בדיקת משיכה של מולקולה יחידה לניתוח זרחן חלבונים: טכניקת תפוקה גבוהה לכימות זרחן חלבונים בליזט התא

זרחון של חלבונים תאיים מסוימים חשוב לתפקודם הביולוגי.

כדי לכמת את רמות הזרחן של חלבונים שלמים באמצעות מבחן משיכה של מולקולה אחת, התחל בלקיחת כיסוי זכוכית עם דפוס מערך רשת. כל תא מצופה בפוליאתילן גליקול ביוטיניל או מקשרים מבוססי פוליאתילן גליקול, המשולבים עם PEG רגיל כדי למנוע הפרעה סטרית במהלך קשירת החלבון.

טפל בכיסוי עם מגיב מפחית כדי למזער את האוטופלואורסצנטיות בניתוח. כיסו את הכיסוי ב-Neutravidins - חלבונים קושרי ביוטין - ודגרו על הכיסוי, מה שמאפשר להם לקשור מקשרים PEG ביוטיניליים.

השלם את המערך עם נוגדנים ספציפיים לחלבון אנטי-מטרה. כל נוגדן מכיל ביוטין המקושר לאזור ה-Fc שלו, המסייע לעגן את הנוגדן לנויטרווידין, וגורם לקיבוע.

כעת, הוסיפו את ליזאט תרבית התאים המכיל חלבונים שונים, כולל הגרסאות הזרחניות והלא זרחניות הירוקות של חלבון המטרה, ודגרו. שתי הגרסאות של חלבון המטרה נלכדות על ידי הנוגדנים ויוצרות קומפלקסים. שטפו כדי להסיר את החלבונים הלא קשורים.

לאחר מכן, טפל בקומפלקסים אלה עם הקבוצה השנייה של נוגדנים מתויגים פלואורסצנטיים אדומים, הקושרים באופן בלעדי את שאריות הזרחן של החלבון, ומעניקים אות פלואורסצנטי שונה לקומפלקס.

צלם את המערך תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וצפה בשני אותות פלואורסצנטיים נפרדים. הקולוקליזציה של שני אותות הקרינה מצביעה על נוכחות של חלבונים זרחניים בדגימה.

הסר את ה