בדיקת משיכה של מולקולה יחידה לניתוח זרחן חלבונים: טכניקת תפוקה גבוהה לכימות זרחן חלבונים בליזט התא

זרחון של חלבונים תאיים מסוימים חשוב לתפקודם הביולוגי.

כדי לכמת את רמות הזרחן של חלבונים שלמים באמצעות מבחן משיכה של מולקולה אחת, התחל בלקיחת כיסוי זכוכית עם דפוס מערך רשת. כל תא מצופה בפוליאתילן גליקול ביוטיניל או מקשרים מבוססי פוליאתילן גליקול, המשולבים עם PEG רגיל כדי למנוע הפרעה סטרית במהלך קשירת החלבון.

טפל בכיסוי עם מגיב מפחית כדי למזער את האוטופלואורסצנטיות בניתוח. כיסו את הכיסוי ב-Neutravidins - חלבונים קושרי ביוטין - ודגרו על הכיסוי, מה שמאפשר להם לקשור מקשרים PEG ביוטיניליים.

השלם את המערך עם נוגדנים ספציפיים לחלבון אנטי-מטרה. כל נוגדן מכיל ביוטין המקושר לאזור ה-Fc שלו, המסייע לעגן את הנוגדן לנויטרווידין, וגורם לקיבוע.

כעת, הוסיפו את ליזאט תרבית התאים המכיל חלבונים שונים, כולל הגרסאות הזרחניות והלא זרחניות הירוקות של חלבון המטרה, ודגרו. שתי הגרסאות של חלבון המטרה נלכדות על ידי הנוגדנים ויוצרות קומפלקסים. שטפו כדי להסיר את החלבונים הלא קשורים.

לאחר מכן, טפל בקומפלקסים אלה עם הקבוצה השנייה של נוגדנים מתויגים פלואורסצנטיים אדומים, הקושרים באופן בלעדי את שאריות הזרחן של החלבון, ומעניקים אות פלואורסצנטי שונה לקומפלקס.

צלם את המערך תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וצפה בשני אותות פלואורסצנטיים נפרדים. הקולוקליזציה של שני אותות הקרינה מצביעה על נוכחות של חלבונים זרחניים בדגימה.

הסר את המערכים הפונקציונליים של ביוטין-PEG מהמקפיא ואזן אותם לטמפרטורת החדר. הנח את הכיסוי כשהמערך פונה כלפי מעלה מעל צלחת תרבית רקמות בגודל 100 מילימטר מרופדת בניילון איטום. דגרו על כל ריבוע במערך עם 10 מיליגרם למיליליטר נתרן בורוהידריד ו-PBS למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים שלוש פעמים עם PBS.

לאחר מכן, דגרו עם 0.2 מיליגרם למיליליטר של NeutrAvidin ב-T50 למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים עם T50-BSA. חזור על הדגירה עם 2 מיקרוגרם למיליליטר של נוגדן ספציפי ל-POI ביוטיניל ב-T50-BSA למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטיפה.

ראשית, יש להפשיר ולערבב את הליזאט על ידי פיפטינג. מדללים 1 מיקרוליטר של הליזט ל-100 מיקרוליטר T50-BSA/PPI קר כקרח. דגרו את הליזאט על המערך למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטיפה. הכן נוגדן אנטי-פוספוטירוזין מצומד AF647 ב-T50-BSA/PPI קר כקרח, ודגר על המערך למשך שעה.

הפקידו טיפת שמן על המטרה. הנח את הננו-גריד על הבמה להדמיה. באמצעות אור לבן מועבר, התמקד בתבנית הרשת. רכוש סדרה של 20 תמונות של הרשת. ודא שהפיקסלים אינם רוויים, ושמור את סדרת התמונות כ"נאמנות".

בטלו את המיקוד של הננו-גריד כדי ליצור דפוס אוורירי. רכוש סדרה של 20 תמונות לכיול הגברה, ושמור את התמונה כ"רווח". לאחר מכן, רכשו סדרה של 20 תמונות להיסט המצלמה על ידי חסימת כל האור למצלמה, ושמרו את התמונה כ"רקע".

כדי להשיג תמונות SiMPull, ראשית, נקה את מטרת הנפט, והפקיד שמן נוסף על המטרה. אבטח את מערך הכיסוי על המיקרוסקופtage. רכוש תמונות עבור כל דגימה, תחילה בערוץ האדום הרחוק, ואחריו פלואורופורים באורך גל נמוך יותר. בדקו את רמת המאגר כל 30 עד 45 דקות, וחידשו לפי הצורך.