זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות קינאזים המפספרים סובסטרט רלוונטי באמצעות שיטות סריקה בספיקות גבוהה (high throughput screening). זאת מושגים תחילה על ידי טרנספקציה של תאים עם פלסמידים המבטאים קינאזים המהוצמדים ל-glutathione S-transferase או GST. השלב השני הוא ביצוע GST kinase pulldown.

בשלב הבא, הדגימות מוטענות לתוך ג'לים, אשר מופעלים ולאחר מכן נצבעים בצבע kumasi brilliant blue. השלב הסופי הוא ייבוש הג'לים וחשיפתם לסרט רדיוגרפיה אוטומטית. בסופו של דבר, על ידי פיתוח וניתוח של הסרטים שהתקבלו, ניתן לזהות זוגות של קינאז ומצע, שכן כל נתיב מייצג בדיקת קינאז נפרדת.

שיטות קיימות לזיהוי קינאז עבור סובסטרט זחוחה known phosphorylated substrate כוללות שימוש בגישות ביו-אינפורמטיות לחיפוש אתר קונסנזוס בסובסטרט, זיהוי קומפלקסים בין קינאז לסובסטרטים באמצעות טכניקות ביוכימיות וגישת ניסוי וטעייה, וחיפוש סובסטרטים של קונסנזוס על בסיס תפקודם הביולוגי הידוע. גישות אלו גוזלות זמן רב ולא תמיד מסתיימות בהצלחה. הגישה שלנו מאפשרת זיהוי מהיר של זוגות קינאז-סובסטרט על בסיס תוצאות תפקודיות.

כאשר עלה רעיון זה לראשונה עבור שיטה זו, חששנו שלא תהיה ספציפיות מספקת in vitro. כפי שהתברר, הספציפיות לסובסטרט היא מצוינת, ולעיתים קרובות אנו מוצאים שבמסך רק קינאזים מאותה משפחה מסוגלים לזרחן סובסטרט נתון. דבר זה בולט במיוחד כאשר אנו מבצעים ריבוי (multiplex) באמצעות סובסטרטים מרובים בכל סבב סריקה, מה שמוכיח כי הפרוצדורה תעבוד. קורטני, טכנאית מהמעבדה שלי, תבצע את הפרוצדורה; התחילו את הפעולה בהכנת הרכיבים, הפלטות והתאים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

אם המ awarding-plates המכילות פלסמידים של קינאז הוקפאו, יש להפשיר אותן בטמפרטורת החדר ולצנטריפוגה במהירות של 1900 ×g למשך שלוש דקות כדי לאסוף לחות לתחתית הבארות. ערבבו 8.6 milliliters של מצע עם סרום מופחת עם 312.7 microliters של ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים, והמתינו חמש דקות לפני ההוספה לכל בארה. מתוך פלטת 96 בארות המכילה את פלסמידי הקינאז, הוסיפו 10 microliters של המצע עם הסרום המופחת.

השתמשו במפיץ נוזלים אוטומטי המצויד בקסטה לנפח קטן, והוסיפו 10 µL מתערובת ריאגנט הטרנספקציה במצע סרום מופחת לכל באר, והניחו לפלטה לעמוד למשך 20 עד 45 דקות. לאחר מכן, השהו תאי 293T בריכוז של 0.75 מיליון תאים ל-mL ב-80 mL של מצע DMEM מלא או מצע Delcos modified, והוסיפו 100 µL מתלי תאי השהו לכל באר באמצעות מפיץ נוזלים אוטומטי המצויד בקסטה לנפח סטנדרטי. בדקו את הבארה תחת מיקרוסקופ כדי לוודא פיזור תאים אחיד לפני החזרת הפלטה לדגירה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות.

כדי להתחיל את ניסוי ה-GST kinase pull down, הכינו תמיסת ונדט בריכוז 4 mM על ידי ערבוב של 60 µL של נתרבן ונדט 0.2 M עם 540 µL של מים. במבחנה שנייה, ערבבו 2.7 µL של מי חמצן 30% עם 1.4 mL של תמיסת PBS (phosphate buffered saline). הוסיפו את שתי התמיסות זו לזו והמתינו 15 דקות לפני השימוש.

באמצעות פיפט רב-ערוצי, העבירו 2 µL של calcium chloride בריכוז 0.25 M לכל באר, ולאחר מכן 2.5 µL של תמיסת התאריכים המוכחת. דגרו כל פלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות, ולאחר מכן הניחו על קרח, תוך שמירה על הפלטות בקרח. הסירו את המדיום מכל באר באמצעות ואקום, והוסיפו מיד 50 µL של lysis buffer קר מאוד לכל באר.

באמצעות דספנסר נוזלים אוטומטי המצויד בקסטה סטנדרטית, השאירו את הפלטה למשך 30 דקות על קרח לצורך ליזיס. לאחר סבב צנטריפוגה של הפלטות ב-1900 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 4 °C, גרדו את התאים מכל באר באמצעות פיפט רב-ערוצי והעבירו את כל התוכן למבחנות vbo המסומנות כראוי. עבור פלטות 96 בארות, סובבו את הפלטות ב-1900 ×g למשך 10 דקות ב-4 °C; במהלך הסבב, מלאו פלטות מצופות בגלוטתיון ב-100 µL של באפר ליזיס קר מאוד לכל באר.

כדי לשמור על התאיים קרים במהלך השטיפה, השאירו את הפלטות על קרח. לאחר סנטריפוגציה של הפלטות התחתונות, הפכו את פלטות הגלוטתיון מעל כיור כדי לנער החוצה את תמיסת הליסיס וייבשו בעזרת נייר סופג. העבירו את תמיסת הליסיס מהפלטות בעלות תחתית V לפלטות הגלוטתיון על ידי הטיית הפלטה ושימוש בפיפט רב-ערוצי, תוך הקפדה שלא להפריע למשקע שבתחתית.

לאחר מכן, כסו את הפלטות והשאירו אותן על קרח למשך שעתיים לפחות. לקראת סיום שלב הקישור בן השעתיים, הכינו עמדת עבודה לרדיואקטיביות תוך הבטחה שננקטו אמצעי הבטיחות הנדרשים לעבודה עם חומרים רדיואקטיביים. כוון את תנור ההיברידיזציה ל-30 degrees Celsius.

הפוך את פלטות הגלוטתיון מעל כיור כדי לנער החוצה את בופר הליזה וספוג את השאריות בנייר סופג. שטוף את הבארות שלוש פעמים עם 100 µL של בופר ליזה ללא PMSF. אל תאפשר לבארות להתייבש.

השאירו אותם בתמיסת השטיפה עד שיהיו מוכנים להמשך. לאחר מכן, הכינו 55 milliliters של באפר קינאז בריכוז one X או one x kb כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסיפו 50 microliters של one x kb לכל באער בלוח באמצעות מפזר נוזלים אוטומטי המצויד בקסט של נפח סטנדרטי.

לאחר מכן, הכין את תמיסה A על ידי הכנת תמיסה המכילה את הסובסטרט הרלוונטי ואת חלבון הבסיס של המיילין או MVP, כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט, אחד אחרי השני. הפוך את הפלטות מעל כיור כדי להסיר את שטיפת ה-1X KB על מגבת נייר, והוסף מיד 30 µL של תמיסה A באמצעות מפזר נוזלים אוטומטי המצויד בקסטה לנפחים קטנים. שמור את הפלטות על קרח.

בשלב הבא, הכין את תמיסה B באזור העבודה עם חומרים רדיואקטיביים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, במינון של 20 µL של תמיסה B לבאר. באמצעות פיפט רפטיטיבי (repeater pipette), המסייע בערבוב הודות לכוח ההזרקה, כסה והדגר את הפלטה בתנור היברידיזציה בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, העבר את הפלטות חזרה לקרח.

לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של תמיסת ליזיס sodium dodecyl sulfate (SDS) בריכוז פי 2 לכל באער באמצעות פיפט רב-ערוצית. את כל העבודה בחלק זה יש לבצע באזור המיועד לעבודה עם חומרים רדיואקטיביים. הפעילו את תנור ההיברידיזציה והגדירו אותו ל-85 °C.

לאחר שהתנור הגיע לטמפרטורה הרצויה, העבירו את הפלטות לתנור והדגירו למשך 10 דקות כדי לדנטור את הדגימות. לאחר מכן, טענו לג'לים מוכנים (precast gels) של 26 בארות 15 microliters מכל תגובה.

בעת שימוש בפיפט רב-ערוצי למילוי מספר בארות בו-זמנית, יש להקפיד שכל הקצוות מיושרים עם הבארות המתאימות. לפני הוספת הדגימות, הרצו את הג'ל במתח של 150 volts. אין לאפשר לקו הכחול לצאת מהחלק התחתון של הג'ל, שכן הוא מכיל ATP שלא נקשר. לאחר מכן, פרקו את הג'לים והסירו את ה-ATP שלא נקשר, כיוון שהוא יגרום להכהיית החשיפה של הג'ל על הסרטים.

הניחו את הג'לים במכלי סימון וכסו אותם בצבע Kumasi למשך 15 דקות. לאחר מכן, הסירו את צבע ה-Kumasi. שטפו קצר את הג'לים במים והוסיפו תמיסת הסרת צבע (detain solution).

המתינו עם הג'לים עד שהחלבונים ייראו בבירור. עבור כל דגימה, צריכות להופיע פס עבור MVP ופס עבור הסובסטרט. כדי לייבש את הג'לים, גזרו גיליון גדול של נייר סינון והניחו אותו על המייבש.

הרטיו גיליון צלופן במים מזוקקים עד שיהיה חלק וללא קמטים והניחו אותו מעל הנייר. הניחו את הג'לים מעל גיליון הצלופן ורשמו את סדר הג'לים. הרטיו גיליון צלופן שני והניחו אותו מעל הג'לים.

הוציאו את כל הבועות כדי לקבל משטח אחיד ויפה. סגרו את המכסה, הפעילו את הוואקום והריצו את הג'לים למשך שלוש שעות ב-80 °C. לאחר שהג'לים התייבשו, חשפו אותם לסרט אוטורדיוגרפיה כפול אמולסיה באמצעות מסך להגברת האות.

עטפו את הקסטה בניילון נצמד או בשקית פלסטיק ואטמו בעזרת סרט דביק כדי למנוע חדירת כפור לפני אחסון הקסטה בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius למשך הלילה. למחרת, הוציאו את הקסטה מהמקפיא והניחו לה להפשיר בטמפרטורת החדר. פתחו את הסרט בחדר חושך באמצעות מעבד סרטים בהתאם להוראות היצרן המוצגות.

להלן תוצאות מייצגות מסריקה של 180 קינזים. הסריקה בוצעה באמצעות סובסטרט פפטיד עם תג GST המתאים לחומצות האמינו 268 עד 283 של kreb regulated transcriptional coactivator two או CRTC2, וכן באמצעות הסובסטרט הקלאסי לבדיקת קינז, myelin basic protein או MBP. רק שני קינזים, mark 2 והקינז הקרוב אליו מאוד, mark 3, פוספילרו את הפפטיד של CRTC2. MBP נכלל כביקורת פנימית בכל הבדיקות, כיוון שהוא מכיל שאריות רבות הניתנות לפוספילור ונע ב-18 kilodaltons לכיוון התחתון של הג'ל.

דבר זה מאפשר פרשנות של הסגוליות. קינזות מסוימות יבצעו פוספורילציה חזקה של סובסטרט ושל MVP. ראוי לציין כי באבורים המכילים GST לבדו תמיד מטוהר מידה מסוימת של פעילות קינאז אנדוגנית.

לפיכך, תמיד קיימת פוספורילציה של רקע בבדיקה. בעוד שדבר זה אינו שולל את האפשרות שהפוספורילציה של הסובסטרט היא אמיתית, הוא מרמז כי בתנאי in vitro, הקינאז עשוי להיות פחות סלקטיבי. הכללת מספר סובסטרטים בעלי משקלים מולקולריים שונים היא אינפורמטיבית במיוחד להסקת מסקנות לגבי הספציפיות של הקינאז לסובסטרט.

מכיוון שהסריקה מתבצעת in vitro ורמות נוספות של מורכבות קיימות in vivo, יש לתקף קינאז מועמד בתאים. לדוגמה, לקינאז מועמד עשויה להיות היכולת לזרחן סובסטרט in vitro, אך הוא עשוי שלא להתבטא באותו סוג תא או באותם תתי-תאים של מדור כפי שמתבטא הסובסטרט. פעולה זו מבוצעת בדרך כלל באמצעות השתקה של המועמד המתווכת על ידי RNAi.

ניתן גם לבצע סריקה משנית באמצעות מוטנט של הסובסטרט שאינו ניתן לזרחון כדי לאשר את הספציפיות.