זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה
August 29th, 2015
זרחון חלבונים הוא מאפיין מרכזי של האופן שבו תאים מפרשים ומגיבים למידע בסביבה החוץ-תאית שלהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינון בתפוקה גבוהה באמצעות קינאזות מטוהרות מתאי יונקים כדי לזהות במהירות קינאזות המזרחנות סובסטרט (ים) מעניין.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות קינאזות המזרחנים מצע מעניין באמצעות שיטות סינון בתפוקה גבוהה. זה מושג על ידי טרנסקטציה ראשונה של תאים עם פלסמידים המבטאים קינאזות FU לגלוטתיון כטרנספראז או GST. השלב השני הוא ביצוע משיכת קינאז GST.
לאחר מכן, הדגימות נטענות בג'לים, אשר לאחר מכן מופעלים ומוכתמים בצבע כחול מבריק קומאסי. השלב האחרון הוא ייבוש הג'לים וחשיפתם לסרט רדיוגרפיה אוטומטית. בסופו של דבר על ידי פיתוח ופירוש הסרטים המתקבלים, ניתן לזהות זוגות מצעי קינאז שכן כל נתיב מייצג בדיקת קינאז מובחנת.
השיטות הקיימות לזיהוי קינאז עבור מצע זרחני ידוע כוללות שימוש בגישות ביואינפורמטיות לחיפוש אתר קונצנזוס במצע, איתור קומפלקסים בין קינאז למצעים באמצעות טכניקות ביוכימיות וגישת ניסוי וטעייה, חיפוש מצעי קונצנזוס קונצנזוס על בסיס תפקידם הביולוגי הידוע. גישות אלו גוזלות זמן ולא תמיד זוכות להצלחה. הגישה שלנו מאפשרת זיהוי מהיר של זוגות סובסטרט קינאז על בסיס תוצאות פונקציונליות.
כשעלה בדעתנו לראשונה הרעיון לשיטה זו, חששנו שלא תהיה מספיק ספציפיות במבחנה. כפי שמתברר, הספציפיות של המצע מצוינת ולעתים קרובות אנו מגלים שרק קינאזות של בני משפחה מסוגלים לזרחן מצע נתון במסך. זה בולט במיוחד כאשר אנו מבצעים ריבוי באמצעות מספר מצעים בכל מסך, מה שמדגים את ההליך תהיה קורטני, טכנאית מהמעבדה שלי להתחיל את ההליך בהכנת ריאגנטים, צלחות ותאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
אם הוקפאו צלחות המכילות פלסמידים של קינאז, יש להפשיר בטמפרטורת החדר ולצנטריפוגה ב-1900 פעמים G למשך שלוש דקות כדי לאסוף לחות בתחתית הבארות. מערבבים 8.6 מיליליטר של מדיום סרום מופחת עם 312.7 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה על בסיס שומנים, ומניחים לתערובת לשבת במשך חמש דקות לכל באר. מתוך צלחת 96 בארות המכילה את הפלסמידים של קינאז ב-10 מיקרוליטר של מדיום הסרום המופחת.
השתמש במתקן נוזלים אוטומטי המצויד בקלטת בנפח קטן, ולאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר מתערובת ריאגנטים בינונית מופחתת בסרום לכל באר, באמצעות מתקן נוזלים אוטומטי המצויד בקלטת בנפח קטן ואפשר לצלחת לשבת במשך 20 עד 45 דקות. לאחר מכן, החייאה משהה 2 93 תאי T ב-0.75 מיליון תאים למיליליטר ב-80 מיליליטר של דלקוס שלם ששונה שווה למדיום או DMEM ב-100 מיקרוליטר של תרחיף התאים לבאר. באמצעות מתקן נוזלים אוטומטי המצויד בקלטת נפח סטנדרטית, בדוק את הבארות תחת מיקרוסקופ עבור פיזור תאים אחיד לפני החזרת הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
כדי להתחיל את ניסוי ה-GST קינאז משוך כלפי מטה. הכינו תמיסת 4 מילי-מולרית לכל ונדאט על ידי ערבוב של 60 מיקרוליטר של 0.2 נתרן ונדאט מולרי עם 540 מיקרוליטר מים בשפופרת שנייה מעורבבת 2.7 מיקרוליטר של 30% מי חמצן ו-1.4 מיליליטר של מי מלח חוצץ פוספט או PBS. הוסיפו את שתי התמיסות יחד והשאירו את התערובת למשך 15 דקות לפני השימוש.
בעזרת פיפטה רב-ערוצית, מחלקים שני מיקרוליטר של 0.25 סידן כלורי מולארי בכל באר, ואחריהם 2.5 מיקרוליטר מתמיסת התמר המוכחת. דגרו כל צלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן הניחו על קרח, תוך שמירה על הצלחות על קרח. הסר את המדיום מכל באר, באמצעות ואקום מיד ב-50 מיקרוליטר לבאר של מאגר ליזה קר כקרח.
בעזרת מתקן נוזלים אוטומטי המצויד בקסטה הסטנדרטית, הניחו לצלחת לשבת במשך 30 דקות על קרח לכינים. לאחר סיבוב הלוחות ב-1900 פעמים G למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס, מגרדים את התאים מכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית ומעבירים את כל התוכן ל-vbo המסומן כראוי. צלחות 96 באר מסובבות את הצלחות ב-1900 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס במהלך הסיבוב ממלאות צלחות מצופות גלוטתיון עם 100 מיקרוליטר לבאר של מאגר ליזה קר כקרח.
כשטיפה, שמור את הצלחות על קרח. לאחר צנטריפוגה של הלוחות התחתונים, הפוך את לוחות הגלוטתיון מעל כיור כדי לנער את מאגר הליזיס ולכתם על מגבת נייר. העבירו את מאגר הליזיס מהלוחות התחתונים V ללוחות הגלוטתיון על ידי הטיית הצלחת ושימוש בפיפטה רב-ערוצית, תוך הקפדה לא להפריע לגלולה בתחתית.
לאחר מכן מכסים את הצלחות ומשאירים על קרח למשך שעתיים לפחות. כדי לקשור קרוב לסוף שלב הכריכה בן השעתיים, הכן תחנת עבודה רדיואקטיבית המבטיחה את אמצעי הבטיחות הדרושים לעבודה רדיואקטיבית. מכוונים את תנור ההכלאה ל -30 מעלות צלזיוס.
הפוך את צלחות הגלוטתיון מעל כיור כדי לנער את מאגר הליזיס ולכתם על מגבת נייר. שטפו את הבארות שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה ללא PMSF. אל תתנו לבארות לשבת יבשות.
שמור אותם בשטיפה עד שהם מוכנים להמשיך. לאחר מכן, הכן 55 מיליליטר של מאגר X קינאז אחד או x kb אחד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף 50 מיקרוליטר של 1 x kb לכל באר של הצלחת באמצעות מתקן נוזלים אוטומטי המצויד בקלטת נפח סטנדרטית.
לאחר מכן הכינו את פתרון A על ידי הכנת תמיסה המכילה את המצע המעניין ואת החלבון הבסיסי של המיאלין או MVP כמפורט בפרוטוקול הטקסט אחד בכל פעם. הפוך את הצלחות מעל כיור כדי להסיר את חלקת השטיפה האחת של XKB על מגבת נייר והוסף מיד 30 מיקרוליטר של תמיסה א. באמצעות מתקן נוזלים אוטומטי המצויד בקלטת בנפח קטן. שמור את הצלחות על קרח.
לאחר מכן, הכינו את תמיסה B באזור העבודה הרדיואקטיבי כמתואר בפרוטוקול הטקסט ב-20 מיקרוליטר של תמיסה B לבאר. בעזרת פיפטה משחזרת, המסייעת בערבוב עקב כוח פליטה מכסים ודוגרים את הצלחת בתנור הכלאה של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, העבירו את הצלחות בחזרה לקרח.
לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של שני x נתרן אקל סולפט או מאגר ליזה SDS לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית. כל העבודות בסעיף זה צריכות להתבצע באזור המיועד לפעילות רדיו. הפעל את תנור ההכלאה והגדר אותו ל 85 מעלות צלזיוס.
לאחר שהתנור הגיע לטמפרטורה, העבירו את הצלחות לתנור ודגרו למשך 10 דקות כדי לפרק את הדגימות. הטעינה הבאה. 26 ג'לים טרומיים היטב עם 15 מיקרוליטר מכל תגובה.
באמצעות פיפטה רב-ערוצית למילוי מספר בארות בבת אחת, יש להקפיד שכל הטיפים יתיישרו עם הבארות המתאימות. לפני הוספת הדגימות, הפעל את הג'ל ב -150 וולט. אל תתנו לקו הכחול לברוח מתחתית הג'ל מכיוון שהוא מכיל את ה-A TP הלא משולב. לאחר מכן פרק את הג'לים והסר את ה-TP הלא משולב מכיוון שהוא יכהה את חשיפת הג'ל על הסרטים.
מניחים את הג'לים במיכלים מסומנים ומכסים בכתם קומאסי למשך 15 דקות. לאחר מכן, הסר את כתם הקומאסי. שוטפים בקצרה את הג'לים במים ומוסיפים תמיסת עיכוב.
עצרו את הג'לים עד שהחלבונים נראים בבירור. רצועה ל-MVP ורצועה למצע צריכה להיות גלויה עבור כל דגימה. לייבוש הג'לים, חותכים דף גדול של נייר פילטר ומניחים אותו על המייבש.
הרטיבו דף צלופן במים מזוקקים עד שהוא חלק וללא קמטים והניחו אותו על גבי הנייר. הניחו את הג'לים על גבי דף הצלופן ורשמו את סדר הג'לים. הרטיבו דף צלופן שני והניחו על גבי הג'לים.
מרדדים את כל הבועות למשטח אחיד ויפה. סוגרים את הדש, מפעילים את הוואקום ומניעים את הג'לים במשך שלוש שעות בחום של 80 מעלות צלזיוס. לאחר שהג'לים יבשים, חשוף אותם לסרט רדיוגרפיה אוטומטי של תחליב כפול באמצעות מסך כדי להעצים את האות.
עוטפים את הקסטה בניילון או בשקית ניילון וסוגרים בנייר דבק כדי למנוע כפור לפני אחסון הקסטה במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הוציאו את הקסטה מהמקפיא ותנו לה להפשיר בטמפרטורת החדר. פתח את הסרט בחדר חשוך באמצעות מעבד סרטים בהתאם להוראות היצרן המוצגות.
להלן תוצאות מייצגות ממסך 180 קינאזות הוקרנו באמצעות מצע פפטיד מתויג GST המתאים לחומצות אמינו 268 עד 283 מקו-אקטיבטור שעתוק מווסת kreb 2 או C RTC 2, כמו גם החלבון הבסיסי של מיאלין סובסטרט בדיקת קינאז קלאסי או MBP רק שניים. קינאזות סימן שתיים והקינאז הקשור מאוד, סימן שלוש זרחני. ה-MBP של CRTC שני פפטידים נכלל כבקרה פנימית בכל הבדיקות מכיוון שהוא מכיל שאריות זרחניות רבות הניתנות לחיבור ופועל ב-18 קילו-דלטון לכיוון תחתית הג'ל.
זה מאפשר פרשנות של ספציפיות. קינאזות מסוימות יזרחו חזק מצע ו-MVP. יש לציין כאן שהבארות המכילות GST לבדן תמיד מטהרות פעילות קינאז אנדוגנית כלשהי.
לפיכך, תמיד יש זרחון רקע בבדיקה. אמנם זה לא שולל שהזרחון של המצע הוא אמיתי, אבל זה כן מצביע על כך שבסביבה במבחנה, הקינאז עשוי להיות פחות סלקטיבי. זה אינפורמטיבי במיוחד לכלול מספר מצעים בעלי משקלים מולקולריים שונים כדי להסיק מסקנות לגבי ספציפיות מצע קינאז.
מכיוון שהמסך הוא במבחנה ורמות נוספות של מורכבות מתרחשות in vivo, יש לאמת קינאז מועמד בתאים. לדוגמה, קינאז מועמד עשוי להיות בעל יכולת לזרחן מצע במבחנה, הוא לא יתבטא באותו סוג תא או באותם תאי משנה של תא כמו המצע. זה נעשה בדרך כלל באמצעות השתקה בתיווך RNAi של המועמד.
אפשר גם לבצע סקר משני באמצעות מוטציה שאינה ניתנת לזרחן של המצע כדי לאשר את הספציפיות.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול סינון תפוקה גבוהה שנועד לזהות קינאזות שמפוספטות מצעים ספציפיים. השיטה משתמשת בקינאזות שהופרדו מתאים של יונקים, ומאפשרת ניתוח מהיר של פעילות קינאזות.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- תמרור תאים
- זירחון חלבונים
- סינון תפוקה גבוהה
רקע
- זירחון חלבונים הוא קריטי להגיבים התאיים לסימנים חיצוניים.
- זיהוי אינטראקציות קינאז-מצע חשוב להבנת מסלולי האותות.
- שיטות תפוקה גבוהה יכולות להאיץ את גילוי האינטראקציות האלו.
- מחקר זה מתמקד בגישה שיטתית לסינון קינאזות פעילות.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול לזיהוי קינאזות שמפוספטות מצעים ספציפיים.
- להשתמש בסינון תפוקה גבוהה לניתוח מהיר.
- לשפר את ההבנה של פעילות קינאזות בתהליכים תאיים.
שיטות ששימשו
- טרנספקציה של תאים עם פלסמידים המבטאים קינאזות המחוברות לגלוטתיון S-טרנספראז (GST).
- ביצוע פולדאון GST-קינאז כדי לבודד קומפלקסים של קינאז-מצע.
- טעינת דגימות לג'לים לאלקטרופורזה.
- מכתים של ג'לים בצבע Coomassie Brilliant Blue וניתוח באמצעות אוטו-רדיוגרפיה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של זוגות קינאז-מצע באמצעות הפרוטוקול שפותח.
- הוכחת היעילות של שיטות סינון תפוקה גבוהה.
- ויזואליזציה של פעילות קינאזות באמצעות אלקטרופורזה בג'ל.
- פרשנות סרטי אוטו-רדיוגרפיה כדי לקבוע אינטראקציות ספציפיות.
מסקנות
- הפרוטוקול מזהה ביעילות קינאזות שמפוספטות מצעים של עניין.
- סינון תפוקה גבוהה הוא כלי חשוב לחקר פעילות קינאזות.
- שיטה זו יכולה לשמש למצעים שונים כדי לחקור פונקציות קינאזות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High throughput identification of kinase-substrate pairs is critical for deconvoluting cellular signaling networks and advancing target validation in early drug discovery. This platform enables rapid, functional mapping of kinase activity, supporting mechanistic de-risking and prioritization of signaling pathways relevant to disease biology. The approach enhances predictive confidence at the discovery inflection point, informing portfolio decisions and downstream assay development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional interrogation of kinase-substrate relationships for pathway clarification.
- Supports biological de-risking by distinguishing specific kinase activities among large enzyme families.
- Facilitates rapid triage of candidate targets based on substrate specificity and signaling relevance.
Screening & Assay Development
- Prepares validated kinase-substrate systems for downstream screening and compound profiling workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs via autoradiography and gel-based readouts.
- Enables scalable, multiplexed screening of kinase libraries against diverse substrates.
- Supports robust assay standardization for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns kinase-substrate mapping with disease-relevant signaling pathways for translational continuity.
- Provides mechanistic evidence to inform preclinical model selection and biomarker strategies.
- Reduces risk of late-stage biological failure by confirming pathway engagement early.
Pipeline & Workflow Integration
This high throughput screening method integrates at the interface of early discovery and lead identification, bridging target validation with assay development and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway mapping by directly linking kinases to their substrates.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible kinase-substrate pairs for compound screening platforms.
- Analytics: Provides quantitative autoradiography and gel-based outputs for comparative analysis of kinase activity.
- Translational Research: Connects in vitro kinase specificity to disease-relevant cellular contexts for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable screening platform adaptable to new substrates and kinase libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes kinase-substrate identification with scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and reduces late-stage biological attrition.
Implementation Considerations
- Requires expertise in kinase biology, protein purification, and radiolabel handling.
- Demands access to automated liquid handling, gel electrophoresis, and autoradiography infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay conditions and controls for reproducibility.
- Adaptation to different substrates or kinase families may require protocol optimization.
- Background phosphorylation and in vitro specificity must be interpreted with in vivo validation strategies.
