Name: זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: למדו לזהות זוגות קינאז-מצע באמצעות סקרינג בקיבולת גבוהה. הפרוטוקול משתמש בקינאזים מטוהרים מתאים יונקיים ובאוטורדיוגרפיה לזיהוי מהיר של פעילות קינאז.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSERC 386634. ברצוננו להודות לחברי המעבדה Screaton לדיונים מועילים.

1. הכנת ריאגנטים, צלחות, ותאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מיליליטר חיץ תמוגה: 25 מ&quot;מ טריס pH 7.5, 150 מ&quot;מ NaCl, 50 מ&quot;מ NAF, 0.5 mM EDTA pH 8.0, 0.5% TritonX-100, 5 מ&quot;מ בטא glycerophosphate, גליצרול 5%. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. מייד לפני השימוש, מוסיף dithiothreitol 1 מ&quot;מ (DTT), פלואוריד 1 מ&quot;מ sulfonyl phenylmethyl (PMSF), וvanadate נתרן 1 מ&quot;מ. לאחר שלב זה, PMSF אינו נדרש בכל חיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות 20 מיליליטר של 10x קינאז מאגר: 200 מ&quot;מ טריס pH 7.5, 50 בטא glycerophosphate מ&quot;מ (FW 216), vanadate נתרן 2 מ&quot;מ. Aliquot ב 1 מיליליטר צינורות ולאחסן ב -20 ° C. מייד לפני השימוש, מוסיף 5 מ&quot;מ DTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות 20 מיליליטר של 10x חיץ M-ATP: 300 מיקרומטר אדנוזין טריפוספט (ATP), 66 מ&quot;מ MgCl 2, 33 Aliquot מ&quot;מ MnCl 2. ב 1 מיליליטר צינורות ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך של סולפט dodecyl נתרן 2x 100 מיליליטר (SDS) תמוגה חיץ: 1.5 בסיס גרם טריס, 20 מיליליטר גליצרול, H 30 מיליליטר 2 O. ממיסים ולהתאים את ה- pH 6.8 עם HCl. הוסף 40מיליליטר 10% SDS, להתאים את עוצמת קול עד 100 מיליליטר. הוסף 25 bromophenol הכחול מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 4 μl של 25 ng / פלסמיד ביטוי היונקים μl קידוד GST-קינאז 14 לכל גם בקבוצות של 96 צלחות גם וצלחות תווית בהתאם. צלחות חותם והקפאה ב -20 ° C עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1-2 ימים לפני transfection, תאי HEK293T התרבות בנשר הבינוני (DMEM) + 10% בסרום שור עוברי (FBS) שונה Dulbecco המלא ואנטיביוטיקה ב37 ° C חממה בתוספת CO 2 (5% סופיים). מעבר עם טריפסין ואינם מאפשר המניה להפוך&gt; 80% ומחוברות בהרחבה. מינימום של 6 x 10 7 תאים נדרשים עבור המסך (3 x 15 סנטימטר מנות של תאי HEK293T כ בנקודת מפגש 80%). </li></ol> 2. Transfection הערה: ראה איור 1 עבור תרשים זרימה של כל פרוטוקול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם צלחות המכילות פלסמידים קינאז הוקפאו, הפשרה בטמפרטורת חדרND צנטריפוגות ב 1,900 XG במשך 3 דקות כדי לאסוף כל לחות בחלק התחתון של בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 8.6 מיליליטר של מדיום מופחת בסרום (למשל, OPTI-MEM) עם 312.7 μl של מגיב transfection שומנים מבוסס. בואו לשבת במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של מדיום סרום מופחת לכל גם באמצעות מצויד בקלטת נפח קטנה מנפק נוזל אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl לכל גם בתמהיל מגיב בינוני סרום / transfection המופחת מצעד 2.2 באמצעות מצויד בקלטת נפח קטנה מנפק נוזל אוטומטי. בואו לשבת במשך 20 עד 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend 293T על 7.5 x 10 5 תאים / מיליליטר ב 80 מיליליטר של DMEM המלא. להוסיף השעיה תא (כלומר 7.5 x 10 4 תאים) 100 μl לכל גם באמצעות מצויד בקלטת נפח סטנדרטית מנפק נוזל אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו בארות תחת מיקרוסקופ לחלוקת תא אחיד ולחזור לחממה עבור 24 שעות. </li></ol> הנפתח 3. GST-קינאז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך Fפתרון pervanadate 4 מ&quot;מ על ידי ערבוב 60 μl של 0.2 M vanadate נתרן עם 540 μl של H 2 O.: ריש בשילוב צינור שני 2.7 μl של 30% חמצן ו -1.4 מיליליטר של PBS. להוסיף שני פתרונות יחד ולתת לשבת במשך 15 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רבה (לא משתמש במתקן נוזלי אוטומטי כפי שהוא יוצר יותר מדי מערבולת בבאר) לוותר על 2 μl של 0.25 מ &#39;CaCl 2 בכל טוב, ואחריו 2.5 μl של pervanadate מוכן בשלב 3.1. דגירה כל צלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן למקם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 35 מיליליטר של חיץ תמוגה ידי הוספת DTT, PMSF, וvanadate נתרן כפי שצוין בסעיף 1 (הכנת ריאגנטים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על צלחות על קרח, להסיר בינוני מכל גם באמצעות aspirator ואקום. מייד להוסיף 50 μl / טוב של חיץ תמוגה קר כקרח באמצעות מצויד בקלטת סטנדרטית מנפק נוזל אוטומטי. בואו לשבת 30 דקות על קרח לlyse (אופציונאלי: ניתן לעצור כאן במידת צורך על ידי איטום platדואר ואחסון ב -80 ° C. כדי להמשיך, צלחות הפשרה על קרח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות ספין ב1,900 XG במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד תאים מכל טוב בעזרת פיפטה רבה ולהעביר את כל התוכן לכותרתו כראוי צלחות 96 גם V-תחתון. צלחות ספין ב1,900 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ספין, למלא צלחות גלוטתיון מצופים (אחד לכל צלחת 96-היטב) עם 100 μl / היטב חיץ קרח קר תמוגה (ללא PMSF) כשטיפה. שמור צלחות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלחות V-תחתון מצנטריפוגות. אחד בכל פעם, להפוך את צלחות גלוטתיון מעל כיור כדי לנער את מאגר תמוגה והכתם על מגבת נייר. העבר את מאגר תמוגה מהצלחות V-תחתון לצלחות גלוטתיון ידי הטיית הצלחת ובעזרת פיפטה רבה, להיות זהיר, כדי לא להפריע את הכדור בחלק התחתון. לכסות צלחות ולהשאיר על קרח עבור שעה 2 מינימום להיקשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרוב לסוף הצעד המחייב 2 שעות, להכין תחנת עבודה רדיואקטיביות, הבטחה לאהוא אמצעי בטיחות דרוש נמצא במקום עבודת רדיואקטיבי. תנור הכלאה להגדיר עד 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 200 מיליליטר של חיץ תמוגה ידי vanadate DTT ונתרן הוספה כאמורה בסעיף 1. PMSF אינו נדרש בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את צלחות גלוטתיון מעל כיור כדי לנער את מאגר תמוגה ולמחוק על מגבת נייר. בארות לשטוף 3x עם 100 חיץ תמוגה μl (ללא PMSF). אל תתנו לבארות לשבת יבשות - לשמור אותם בשטיפה עד מוכן להמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 55 מיליליטר של חיץ 1x קינאז (KB) על ידי דילול המניות 10x והוספת DTT כפי שצוין בסעיף 1. צלחות לשטוף פעם אחת עם 50 μl של 1x KB באמצעות מצויד בקלטת נפח סטנדרטית מנפק נוזל אוטומטי. השאר 1x KB בבארות עד פתרון מוכן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון על ידי הוספת 500-530 מיקרוגרם של המצע של עניין, 500 מיקרוגרם של חלבון המיאלין בסיסי (MBP), 2.65 מיליליטר של 10x KB, 13.25 μl של 1 M DTT, ו- H 2 O עד 15.9 מיליליטר. </li></ol></li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחד בכל פעם, להפוך את הצלחות מעל כיור כדי להסיר שטיפת KB 1x, למחוק על מגבת נייר, ומייד להוסיף 30 μl של הפתרון באמצעות מצויד בקלטת נפח קטנה מנפק נוזל אוטומטי. שמור צלחות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון B באזור עבודת הרדיואקטיביות על ידי הוספת 2.5 מיליליטר 10x M-ATP, ATP 32 P 500 gamma- μCi, ו- H 2 O ל -10 מיליליטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של הפתרון B לכל גם באמצעות פיפטה מהדר אשר מסייעת בערבוב בשל כוח פליטה. מכסים ודגירה בתנור הכלאה 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, להעביר צלחות בחזרה לקרח. הוסף 50 μl של חיץ תמוגה 2x SDS זה גם בעזרת פיפטה רבה. יכול להמשיך בשלב זה לשלב הבא, או לאטום את הצלחות בנייר אלומיניום ולאחסן ב -20 ° C עד נוח. </li></ol> 4. ריצה, מכתים, וג&#39;לי ייבוש הערה: כל העבודה צריכה להתבצע בdesigna אזורטד לרדיואקטיביות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תנור הכלאה ולהגדיר עד 85 מעלות צלזיוס. צלחות הפשרה בטמפרטורת חדר. ברגע שהתנור הגיע טמפרטורה, צלחות העברה לתנור ודגירה של 10 דקות ללפגל דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עומס 26 היטב מראש יצוק ג&#39;לי עם 15 μl של כל תגובה באמצעות פיפטה רבה כדי למלא כמה בארות ובעונה אחת. יש להקפיד שכל הטיפים ליישר עם מקביל היטב לפני הוספת דגימות. הפעל ג&#39;ל ב 150 V. אל תתנו צבע המעקב (קו כחול) לברוח מתחתית הג&#39;ל כזה מכיל ATP מאוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את ג&#39;לי ומנותק ATP מאוגדים (קו כחול) באמצעות אזמל או קצה ישר כפי שהוא יהיה לחשוף יותר מדי הסרטים. מניחים את ג&#39;לי במכולות שכותרתו ולכסות עם כתם Coomassie במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את כתם Coomassie, בקצרה לשטוף את ג&#39;לי עם מים, ולהוסיף destain פתרון. Destain ג&#39;לי עד החלבונים נראים בבירור. להקה לMBP ולהקה למצע צריךיהיה גלוי לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את ג&#39;לי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך גיליון גדול של נייר סינון ולמקם אותו במייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב גיליון צלופן במים מזוקקים עד שהוא חלק ולהתקמט בחינם, ומניח אותו על גבי הנייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ג&#39;לי על גבי גיליון נייר צלופן, מה שהופך את הערה של סדר ג&#39;לי. להרטיב גיליון צלופן שני ומניח על גבי ג&#39;לים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרדדים כל הבועות (רולר איטום צלחת עובד היטב עבור זה) למשטח אחיד נחמד. סגור את הדש, להדליק את הוואקום, ולייבש את ג &#39;לים 3 שעות על 80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהג&#39;לי הוא יבשים, לחשוף אותם לסרט XAR באמצעות מסך כדי להגביר את האות. עטוף את הקלטת עם ניילון נצמד או שקית ניילון ולאטום עם קלטת כדי לשמור את כפור. אחסן את הקלטת בלילה -80 ° C. </li></ol> 5. פיתוח XAR סרטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להסיר קלטת מהמקפיא ולתת הפשרה בטמפרטורת חדר. לפתח את הסרט בחדר חושך באמצעות מעבד סרט על פי הוראות יצרן. הערה: בדוק את הסרטים לראיות של זוגות קינאז-מצע. חשיפה ארוכה יותר שנייה יכולה להיות שימושית גם כדי לזהות אירועי זירחון חלשים. </li></ol>

<ol><li>Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+mapping+and+identification+of+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19(2001).</li>
<li>Doll, S., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+detection+and+assignment+of+protein+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications.</a> ACS chem. 10, 63-71 (2015).</li>
<li>Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultradeep+human+phosphoproteome+reveals+a+distinct+regulatory+nature+of+Tyr+and+Ser%2FThr-based+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+rep%22%5BJournal%5D)">Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling.</a> Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).</li>
<li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).</li>
<li>Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalsh%2C+CT+%22Posttranslation+Modification+of+Proteins%3A+Expanding+Nature%27s+Inventory%22">Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory</a>. , 1st edn, Roberts and Company Publishers. (2006).</li>
<li>Boersema, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+qualitative+and+quantitative+profiling+of+tyrosine+phosphorylation+using+a+combination+of+phosphopeptide+immunoaffinity+purification+and+stable+isotope+dimethyl+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).</li>
<li>Hutti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+protein+kinase+phosphorylation+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity.</a> Nat Methods. 1, 27-29 (2004).</li>
<li>Johnson, S. A., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinomics%3A+methods+for+deciphering+the+kinome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Kinomics: methods for deciphering the kinome.</a> Nat Methods. 2, 17-25 (2005).</li>
<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cell+regulatory+systems+through+protein+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains.</a> Science. 300, 445-452 (2003).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+yeast+protein+kinases+using+protein+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of yeast protein kinases using protein chips.</a> Nat Genet. 26, 283-289 (2000).</li>
<li>Shah, K., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+approach+for+the+identification+of+direct+substrates+of+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases.</a> Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).</li>
<li>Zou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKIS%3A+computational+identification+of+protein+kinases+for+experimentally+discovered+protein+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinform%22%5BJournal%5D)">PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites.</a> BMC bioinform. 14, 247(2013).</li>
<li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+active+and+kinase-deficient+kinome+collection+for+identification+of+kinases+regulating+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling.</a> Cell. 133, 537-548 (2008).</li>
<li>Jansson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+controls+CREB+activity+in+islet+cells+via+regulated+phosphorylation+of+TORC2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).</li>
<li>Fu, A., Screaton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+kinomics+to+delineate+signaling+pathways%3A+control+of+CRTC2%2FTORC2+by+the+AMPK+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family.</a> Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).</li>
<li>Abu-Thuraia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axl+phosphorylates+elmo+scaffold+proteins+to+promote+rac+activation+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).</li>
<li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאז הפרסומים המקוריים המתארים את הגישה 14,15, הספרייה המקורית של 180 GST-קינאז הורחבה 420 חברים, או ~ 80% מkinome החלבון האנושי. עם הספרייה המורחבת, הפרוטוקול כפי שתואר לוקח 4-5 ימים ולאחר מכן 1-4 ימים כדי לפתח סרטים (כהכרחי), אשר יכול להתקצר על ידי שימוש בphosphorimaging ושיפור אותות דיגיטלי. יש כמה שלבים עיקריים שבו יש להקפיד (ראה איור 1 לסקירה של פרוטוקול). ראשון, היא הבריאות של המניה של תאים (mycoplasma חופשי, לא אפשר להגיע למפגש בהרחבה, וטופל בטריפ...

שינויי חלבון לאחר translational (PTMs) חיוניים לתקשורת תאית. אולי הכי טוב למדו מכל PTMs הוא זרחון, מזורז על ידי קינאז חלבון, המסדיר את מספר עצום של פונקציות חלבון, כוללים הפעילות ביוכימית שלהם, לוקליזציה subcellular, קונפורמציה, ויציבות. זיהוי של אתרי זירחון על חלבוני יעד יכול להתבצע על ידי מיפוי phosphopeptide tryptic או על ידי טכניקות proteomic עכשיו סטנדרטיות באמצעות דגימות מועשרים לפפטידים phosphorylated 1,2. בעוד שלושה רבעים מproteome הביעה צפויים להיות phosphorylated 3 וזיהה 200,000 אתרי זירחון 5, עם הערכות עד 1 מ&#39;6, רבים מהם אין לי ביולוגיה הוקצתה, מסלול איתות, או חלבון kinase. בעוד זיהוי של אתרי פוספורילציה הוא יחסית פשוט, אתגר גדול יותר הוא יחסיתלזהות אותו מקור קינאז (ים) שמכוון את האתרים הללו, תהליך שאנו מכנים קינאז מיפוי: זוגות מצע. מספר גישות לזיהוי קינאז: זוגות מצע תוארו, או מתחיל עם קינאז של עניין ומחפש מצעים שלה או מתחיל עם מצע של עניין ומנסה למצוא קינאז שינוי בניסוי 7-11 או המחשוב 12. לזהות קינאזות למצע phosphorylated ידוע, ניתן להשתמש ביואינפורמטיקה לזהות חלבונים המכילים רצף נשמר קצר של חומצות אמינו משני צדי שאריות פוספורילציה (אתר הקונצנזוס), כמו גם זיהוי קינאז היוצרים מורכב precipitable עם המצע. עם זאת, גישות אלה הן זמן רב ולעתים קרובות אינו עומדות בהצלחה. פיתחנו גישה פונקציונלית שיטתית לזהות במהירות קינאז שיכול phosphorylate מצע נתון 13. Assay המסך מייצר ספציפי מצוינתity, עם מבחר מאוד ברור לקינאז מקור הפוטנציאלי. בהתחשב במרכזיותה של זירחון לאיתות ביולוגית, המסך שימושי לגילוי במסלולי איתות כמעט בכל תא 14-16. המסך כולל ביצוע assay קינאז בקנה מידה גדולה עם ספרייה של קינאזות חלבון האנושית. קינאז תויג עם S-transferase גלוטתיון חיידקי חלבון (GST) והם מטוהרים מתמציות תאים יונקים, מה שאומר שאנזימי רקומביננטי - בניגוד לאלה שהוכנו מחיידקים - נוצרים בנוכחות חלבון קינאז במעלה הזרם לעתים קרובות נדרש ל אנזימי רקומביננטי יש פעילות במבחנה. ואכן, תוך פעילות קינאז סרין, תראונין, וטירוזין קינאז הנדרשת להפעלה במורד הזרם נמצא בשמרים 10, שמרי הגנום מקודד חלבון קינאז 122, המציין כי kinome היונקים, עם למעלה מ -500 גנים 17, הפך באופן משמעותי יותר מורכב כדי Regulate התהליכים ייחודיים לאורגניזמים מסדר גבוהים יותר. יתר על כן, ההשפעה של גירויים שונים רלוונטיים לביולוגיה של תא ומחלות של בני אדם (כגון מולקולות קטנות, גורמי גדילה, הורמונים, וכו &#39;) יכולה לשמש לפעילות קינאז 14,15 לווסת בהקשר מתאים.

<table><tbody><tr><td>מאגר ליזה</td><td>תוצרת הבית</td><td></td><td>ראה פרוטוקול שלב 1.1</td></tr><tr><td>10x מאגר קינאז</td><td>תוצרת הבית</td><td></td><td>ראה פרוטוקול שלב 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>תוצרת הבית</td><td></td><td>ראה פרוטוקול שלב 1.3</td></tr><tr><td>פלסמידים קינאז אנושיים</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>GST מתויג בבית</td></tr><tr><td>96 צלחות באר</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T תאי</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>תוסף תזונה עם 100&nbsp; פניצילין U/ml, 100&nbsp; &#956; גרם/מ"ל סטרפטומיצין, 10% סרום עגל עוברי.</td></tr><tr><td>חממת CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 ס"מ כלי תרבית תאים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>מדיום סרום מופחת</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה על בסיס ליפידים</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>מתקן נוזלים אוטומטי</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>קובץ מצורף לקלטת קטנה</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>חיבור קלטת סטנדרטי</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 מ"מ pervanadate</td><td>תוצרת הבית</td><td></td><td>ראה פרוטוקול שלב 3.1</td></tr><tr><td>0.25 M CaCl2</td><td>תוצרת הבית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטה רב-ערוצית (20-200 & #956; l)</td> <td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה רב-ערוצית (1-10 &#956; l)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות V-bottom</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>צלחות מצופות גלוטתיון 96 בארות</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>תנור היברידיזציה</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GST מצע מתויג</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חלבון בסיסי מיאלין (MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה משחזרת (1 מ"ל)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>32P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS lysis buffer (100&nbsp; מ"ל)</td> <td>תוצרת הבית</td><td></td><td>ראה פרוטוקול שלב 1.4</td></tr><tr><td>ג'ל TGX טרומי 26 בארות</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>אחוז הג'ל הנדרש תלוי במשקל המולקולרי של המצע המעניין</td></tr><tr><td>כתם Coomassie</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td>0.1% Coomassie R250, 10% חומצה אצטית, 40% מתנול</td></tr><tr><td>Coomassie destain</td><td>תוצרת הבית</td><td></td><td>10% חומצה אצטית, 20% מתנול</td></tr><tr><td>מיכלי ג'ל מסומנים</td><td>תוצרת הבית</td><td></td><td>מכסי פלסטיק משומשים מקופסאות קצה ריקות, גדולים מספיק כדי להכיל נייר סינון ג'ל אחד</td></tr><tr><td>Whatman Fisher</td><td>Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>יריעות צלופן (2)</td> <td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>מייבש ג'ל</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>סרט אוטורדיוגרפיה תחליב כפול</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>קלטת סרט</td><td>פישר מדעי</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>מסך מתעצם</td><td>פישר מדעי</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>רולר גומי איטום צלחת</td><td>סיגמא</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

פיתחנו פלטפורמת הקרנה לזהות קינאזות חלבון האנושית ייעודית למצעי phosphorylated אשר יכול לשמש כדי להבהיר מסלולי העברת אותות רומן. הגישה שלנו כוללת שימוש בספרייה של קינאזות חלבון אנושי מתויג GST מטוהר ומצע חלבון רקומביננטי של עניין. השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי לזהות קינאז MAP / microtubule ויסות זיקה 2 (MARK2) כקינאז לאתר מוסדר גלוקוז על-מוסדר CREB תעתיק Coactivator 2 (CRTC2), חלבון דרוש להתפשטות תאי ביתא, כמו גם משפחת אקסל של טירוזין קינאז כרגולטורים של גרורות תא על ידי זירחון של חלבון המתאם ELMO. אנו מתארים את הטכנולוגיה הזו ולדון איך זה יכול לעזור להקים מפה מקיפה של כמה תאים מגיבים לגירויים סביבתיים.

נציגי תוצאות ממסך מוצגות באיור 2. 180 קינאז הוקרן באמצעות מצע פפטיד GST מתויג המתאים לaa 268-283 מCRTC2 כמו גם חלבון המיאלין מצע assay קינאז הקלאסי הבסיסי (MBP). רק שתי קינאזות, MARK2 וMARK3 קינאז הקשורים מאוד phosphorylated פפטיד CRTC2. MBP נכלל כבקרה פנימית בכל מבחני, כפי שהוא מכיל הרבה שאריות phosphorylatable ופועל ב -18 kDa, לכיוון החלק התחתון של הג&#39;ל. זה מאפשר לפרשנות של סגוליות: כמה קינאז חסונה יהיה phosphorylate מצע וMBP. ראוי לציין כאן הוא שהבארות המכי...

זרחון חלבונים הוא מאפיין מרכזי של האופן שבו תאים מפרשים ומגיבים למידע בסביבה החוץ-תאית שלהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינון בתפוקה גבוהה באמצעות קינאזות מטוהרות מתאי יונקים כדי לזהות במהירות קינאזות המזרחנות סובסטרט (ים) מעניין.


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות קינאזים המפספרים סובסטרט רלוונטי באמצעות שיטות סריקה בספיקות גבוהה (high throughput screening). זאת מושגים תחילה על ידי טרנספקציה של תאים עם פלסמידים המבטאים קינאזים המהוצמדים ל-glutathione S-transferase או GST. השלב השני הוא ביצוע GST kinase pulldown.בשלב הבא, הדגימות מוטענות לתוך ג'לים, אשר מופעלים ולאחר מכן נצבעים בצבע kumasi brilliant blue. השלב הסופי הוא ייבוש הג'לים וחשיפתם לסרט רדיוגרפיה אוטומטית. בסופו של דבר, על ידי פיתוח וניתוח של הסרטים שהתקבלו, ניתן לזהות זוגות של קינאז ומצע, שכן כל נתיב מייצג בדיקת קינאז נפרדת.שיטות קיימות לזיהוי קינאז עבור סובסטרט זחוחה known phosphorylated substrate כוללות שימוש בגישות ביו-אינפורמטיות לחיפוש אתר קונסנזוס בסובסטרט, זיהוי קומפלקסים בין קינאז לסובסטרטים באמצעות טכניקות ביוכימיות וגישת ניסוי וטעייה, וחיפוש סובסטרטים של קונסנזוס על בסיס תפקודם הביולוגי הידוע. גישות אלו גוזלות זמן רב ולא תמיד מסתיימות בהצלחה. הגישה שלנו מאפשרת זיהוי מהיר של זוגות קינאז-סובסטרט על בסיס תוצאות תפקודיות.כאשר עלה רעיון זה לראשונה עבור שיטה זו, חששנו שלא תהיה ספציפיות מספקת in vitro. כפי שהתברר, הספציפיות לסובסטרט היא מצוינת, ולעיתים קרובות אנו מוצאים שבמסך רק קינאזים מאותה משפחה מסוגלים לזרחן סובסטרט נתון. דבר זה בולט במיוחד כאשר אנו מבצעים ריבוי (multiplex) באמצעות סובסטרטים מרובים בכל סבב סריקה, מה שמוכיח כי הפרוצדורה תעבוד. קורטני, טכנאית מהמעבדה שלי, תבצע את הפרוצדורה; התחילו את הפעולה בהכנת הרכיבים, הפלטות והתאים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.אם המ awarding-plates המכילות פלסמידים של קינאז הוקפאו, יש להפשיר אותן בטמפרטורת החדר ולצנטריפוגה במהירות של 1900 ×g למשך שלוש דקות כדי לאסוף לחות לתחתית הבארות. ערבבו 8.6 milliliters של מצע עם סרום מופחת עם 312.7 microliters של ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים, והמתינו חמש דקות לפני ההוספה לכל בארה. מתוך פלטת 96 בארות המכילה את פלסמידי הקינאז, הוסיפו 10 microliters של המצע עם הסרום המופחת.השתמשו במפיץ נוזלים אוטומטי המצויד בקסטה לנפח קטן, והוסיפו 10 µL מתערובת ריאגנט הטרנספקציה במצע סרום מופחת לכל באר, והניחו לפלטה לעמוד למשך 20 עד 45 דקות. לאחר מכן, השהו תאי 293T בריכוז של 0.75 מיליון תאים ל-mL ב-80 mL של מצע DMEM מלא או מצע Delcos modified, והוסיפו 100 µL מתלי תאי השהו לכל באר באמצעות מפיץ נוזלים אוטומטי המצויד בקסטה לנפח סטנדרטי. בדקו את הבארה תחת מיקרוסקופ כדי לוודא פיזור תאים אחיד לפני החזרת הפלטה לדגירה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות.כדי להתחיל את ניסוי ה-GST kinase pull down, הכינו תמיסת ונדט בריכוז 4 mM על ידי ערבוב של 60 µL של נתרבן ונדט 0.2 M עם 540 µL של מים. במבחנה שנייה, ערבבו 2.7 µL של מי חמצן 30% עם 1.4 mL של תמיסת PBS (phosphate buffered saline). הוסיפו את שתי התמיסות זו לזו והמתינו 15 דקות לפני השימוש.באמצעות פיפט רב-ערוצי, העבירו 2 µL של calcium chloride בריכוז 0.25 M לכל באר, ולאחר מכן 2.5 µL של תמיסת התאריכים המוכחת. דגרו כל פלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות, ולאחר מכן הניחו על קרח, תוך שמירה על הפלטות בקרח. הסירו את המדיום מכל באר באמצעות ואקום, והוסיפו מיד 50 µL של lysis buffer קר מאוד לכל באר.באמצעות דספנסר נוזלים אוטומטי המצויד בקסטה סטנדרטית, השאירו את הפלטה למשך 30 דקות על קרח לצורך ליזיס. לאחר סבב צנטריפוגה של הפלטות ב-1900 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 4 °C, גרדו את התאים מכל באר באמצעות פיפט רב-ערוצי והעבירו את כל התוכן למבחנות vbo המסומנות כראוי. עבור פלטות 96 בארות, סובבו את הפלטות ב-1900 ×g למשך 10 דקות ב-4 °C; במהלך הסבב, מלאו פלטות מצופות בגלוטתיון ב-100 µL של באפר ליזיס קר מאוד לכל באר.כדי לשמור על התאיים קרים במהלך השטיפה, השאירו את הפלטות על קרח. לאחר סנטריפוגציה של הפלטות התחתונות, הפכו את פלטות הגלוטתיון מעל כיור כדי לנער החוצה את תמיסת הליסיס וייבשו בעזרת נייר סופג. העבירו את תמיסת הליסיס מהפלטות בעלות תחתית V לפלטות הגלוטתיון על ידי הטיית הפלטה ושימוש בפיפט רב-ערוצי, תוך הקפדה שלא להפריע למשקע שבתחתית.לאחר מכן, כסו את הפלטות והשאירו אותן על קרח למשך שעתיים לפחות. לקראת סיום שלב הקישור בן השעתיים, הכינו עמדת עבודה לרדיואקטיביות תוך הבטחה שננקטו אמצעי הבטיחות הנדרשים לעבודה עם חומרים רדיואקטיביים. כוון את תנור ההיברידיזציה ל-30 degrees Celsius.הפוך את פלטות הגלוטתיון מעל כיור כדי לנער החוצה את בופר הליזה וספוג את השאריות בנייר סופג. שטוף את הבארות שלוש פעמים עם 100 µL של בופר ליזה ללא PMSF. אל תאפשר לבארות להתייבש.השאירו אותם בתמיסת השטיפה עד שיהיו מוכנים להמשך. לאחר מכן, הכינו 55 milliliters של באפר קינאז בריכוז one X או one x kb כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסיפו 50 microliters של one x kb לכל באער בלוח באמצעות מפזר נוזלים אוטומטי המצויד בקסט של נפח סטנדרטי.לאחר מכן, הכין את תמיסה A על ידי הכנת תמיסה המכילה את הסובסטרט הרלוונטי ואת חלבון הבסיס של המיילין או MVP, כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט, אחד אחרי השני. הפוך את הפלטות מעל כיור כדי להסיר את שטיפת ה-1X KB על מגבת נייר, והוסף מיד 30 µL של תמיסה A באמצעות מפזר נוזלים אוטומטי המצויד בקסטה לנפחים קטנים. שמור את הפלטות על קרח.בשלב הבא, הכין את תמיסה B באזור העבודה עם חומרים רדיואקטיביים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, במינון של 20 µL של תמיסה B לבאר. באמצעות פיפט רפטיטיבי (repeater pipette), המסייע בערבוב הודות לכוח ההזרקה, כסה והדגר את הפלטה בתנור היברידיזציה בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, העבר את הפלטות חזרה לקרח.לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של תמיסת ליזיס sodium dodecyl sulfate (SDS) בריכוז פי 2 לכל באער באמצעות פיפט רב-ערוצית. את כל העבודה בחלק זה יש לבצע באזור המיועד לעבודה עם חומרים רדיואקטיביים. הפעילו את תנור ההיברידיזציה והגדירו אותו ל-85 °C.לאחר שהתנור הגיע לטמפרטורה הרצויה, העבירו את הפלטות לתנור והדגירו למשך 10 דקות כדי לדנטור את הדגימות. לאחר מכן, טענו לג'לים מוכנים (precast gels) של 26 בארות 15 microliters מכל תגובה.בעת שימוש בפיפט רב-ערוצי למילוי מספר בארות בו-זמנית, יש להקפיד שכל הקצוות מיושרים עם הבארות המתאימות. לפני הוספת הדגימות, הרצו את הג'ל במתח של 150 volts. אין לאפשר לקו הכחול לצאת מהחלק התחתון של הג'ל, שכן הוא מכיל ATP שלא נקשר. לאחר מכן, פרקו את הג'לים והסירו את ה-ATP שלא נקשר, כיוון שהוא יגרום להכהיית החשיפה של הג'ל על הסרטים.הניחו את הג'לים במכלי סימון וכסו אותם בצבע Kumasi למשך 15 דקות. לאחר מכן, הסירו את צבע ה-Kumasi. שטפו קצר את הג'לים במים והוסיפו תמיסת הסרת צבע (detain solution).המתינו עם הג'לים עד שהחלבונים ייראו בבירור. עבור כל דגימה, צריכות להופיע פס עבור MVP ופס עבור הסובסטרט. כדי לייבש את הג'לים, גזרו גיליון גדול של נייר סינון והניחו אותו על המייבש.הרטיו גיליון צלופן במים מזוקקים עד שיהיה חלק וללא קמטים והניחו אותו מעל הנייר. הניחו את הג'לים מעל גיליון הצלופן ורשמו את סדר הג'לים. הרטיו גיליון צלופן שני והניחו אותו מעל הג'לים.הוציאו את כל הבועות כדי לקבל משטח אחיד ויפה. סגרו את המכסה, הפעילו את הוואקום והריצו את הג'לים למשך שלוש שעות ב-80 °C. לאחר שהג'לים התייבשו, חשפו אותם לסרט אוטורדיוגרפיה כפול אמולסיה באמצעות מסך להגברת האות.עטפו את הקסטה בניילון נצמד או בשקית פלסטיק ואטמו בעזרת סרט דביק כדי למנוע חדירת כפור לפני אחסון הקסטה בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius למשך הלילה. למחרת, הוציאו את הקסטה מהמקפיא והניחו לה להפשיר בטמפרטורת החדר. פתחו את הסרט בחדר חושך באמצעות מעבד סרטים בהתאם להוראות היצרן המוצגות.להלן תוצאות מייצגות מסריקה של 180 קינזים. הסריקה בוצעה באמצעות סובסטרט פפטיד עם תג GST המתאים לחומצות האמינו 268 עד 283 של kreb regulated transcriptional coactivator two או CRTC2, וכן באמצעות הסובסטרט הקלאסי לבדיקת קינז, myelin basic protein או MBP. רק שני קינזים, mark 2 והקינז הקרוב אליו מאוד, mark 3, פוספילרו את הפפטיד של CRTC2. MBP נכלל כביקורת פנימית בכל הבדיקות, כיוון שהוא מכיל שאריות רבות הניתנות לפוספילור ונע ב-18 kilodaltons לכיוון התחתון של הג'ל.דבר זה מאפשר פרשנות של הסגוליות. קינזות מסוימות יבצעו פוספורילציה חזקה של סובסטרט ושל MVP. ראוי לציין כי באבורים המכילים GST לבדו תמיד מטוהר מידה מסוימת של פעילות קינאז אנדוגנית.לפיכך, תמיד קיימת פוספורילציה של רקע בבדיקה. בעוד שדבר זה אינו שולל את האפשרות שהפוספורילציה של הסובסטרט היא אמיתית, הוא מרמז כי בתנאי in vitro, הקינאז עשוי להיות פחות סלקטיבי. הכללת מספר סובסטרטים בעלי משקלים מולקולריים שונים היא אינפורמטיבית במיוחד להסקת מסקנות לגבי הספציפיות של הקינאז לסובסטרט.מכיוון שהסריקה מתבצעת in vitro ורמות נוספות של מורכבות קיימות in vivo, יש לתקף קינאז מועמד בתאים. לדוגמה, לקינאז מועמד עשויה להיות היכולת לזרחן סובסטרט in vitro, אך הוא עשוי שלא להתבטא באותו סוג תא או באותם תתי-תאים של מדור כפי שמתבטא הסובסטרט. פעולה זו מבוצעת בדרך כלל באמצעות השתקה של המועמד המתווכת על ידי RNAi.ניתן גם לבצע סריקה משנית באמצעות מוטנט של הסובסטרט שאינו ניתן לזרחון כדי לאשר את הספציפיות.

identification-kinase-substrate-pairs-using-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

קינאז leucine חזור ריץ' 2 הוא קינאז multidomain גדול, מוטציות שהן הגורם הגנטי השכיח ביותר של מחלת פרקינסון. ניתוח של פעילות קינאז של החלבון הזה הוכיחה להיות כלי חיוני בהבנת הביולוגיה תפקוד של חלבון זה. במאמר...

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

בסרטון זה, אנו מתארים שיטה לזיהוי מעכבי קינאז במולקולות קטנות המווסתים את האפופטוזיס של CD4+CD8+ חיוביים כפולים חיוביים לא בוגרים. אפופטוזיס מושרה בתימוציטים חיוביים כפולים על ידי הפעלתם עם חרוזים מגנטיים מצופים נגד CD3 ו- CD28; לאחר מכן מתבצע טיפול במעכבי מולקולות קטנות וניתוח ציטומטריית זרימה כדי לזהות אם המעכבים מווסתים את ביטוי הסמן האפופטוטי.

זיהוי מעכבי קינאז המווסתים את תגובת התימוציט לאותות TCR חזקים

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

בדיקת מערך פפטידים היא בדיקת תפוקה גבוהה לזיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבון לחלבון. זה מאפשר מיפוי אינטראקציות מרובות של חלבון מטרה ויכול לשמש כשיטה לזיהוי אתרים למעכבים המכוונים לחלבון. כאן אנו מתארים פרוטוקול לסינון וניתוח מערכי פפטידים.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כמותי וניתן להרחבה לבצע מסכי מולקולה קטנים ממוקד עבור הרגולטורים קינאז של המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם.

שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

מבחני תחרות פפטיד נמצאים בשימוש נרחב במגוון של ניסויים מולקולריים וחיסונית. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת עבור המבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ואת הליכי אימות הקשורים, אשר עשוי להיות שימושי כדי למצוא אתרי זרחן ספציפיים.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) מופעל בשלב G2 של מחזור התא, מסדיר משעולים הסלולר רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להצפנה assay קינאז במבחנה עם Cdk1, אשר מאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 להקמת מטרות תאיות של קינאז חשוב.

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

המטרה של פרוטוקול זה היא תווית להעשיר, לזהות סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תא lysate או homogenate הרקמה. שיטה זו ממנפת את ההיבטים הייחודיים של הביולוגיה CK2 למטרה זו.

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

פרוטוקול מפורט ליצירת מיקרומערכים של חלבון אנושי מורכב באמצעות הקרנת מעכבי הסרט מוצג.

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

למדו לזהות זוגות קינאז-מצע באמצעות סקרינג בקיבולת גבוהה. הפרוטוקול משתמש בקינאזים מטוהרים מתאים יונקיים ובאוטורדיוגרפיה לזיהוי מהיר של פעילות קינאז.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה

גלה סרטונים נוספים