Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן
4 באוקטובר 2018
כאן מוצג פרוטוקול לניתוח בינוני - כדי תפוקה גבוהה של חלבון זרחון אירועים ברמה התאית. Cytometry זרימה פוספו היא גישה רב-עוצמה כדי לאפיין את סטיות איתות, לזהות, לאמת סמנים ביולוגיים, ולהעריך pharmacodynamics.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים של ביולוגיה של התא ואימונולוגיה כגון כיצד מסלולי איתות מושפעים גירויים שונים או תרופות? היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת לך לבצע ניתוח איתות תא יחיד באופן תפוקה בינונית עד גבוהה. לאחר השעיה מחדש של התאים במדיום RPMI 16/40 בתוספת, העבר את הכמות הנדרשת של השעיית תאים ל הבאר של צלחת V-bottom 96 באר.
מעבירים את הצלחת לאמבט מים שחומם מראש ב-37 מעלות ומאפשרים לה לנוח שם במשך 10 דקות. לאחר מכן להוסיף 60 microliters של מאגר קבוע אחד לכל באר של צלחת באר 96 חדש כדי להגדיר את צלחת לתקן. מניחים את הצלחת באמבט המים 37 מעלות צלזיוס.
מעבירים דגימת בקרה של 50 מיקרוליטר לצלחת ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה. באופן אופציונלי, להוסיף 10 microliters לכל מיליליטר אנטי IgM לתאים כדי להתחיל את קורס זמן הסימולציה לערבב על ידי צינור למעלה ולמטה. מעבירים דגימת 50 מיקרוליטר לצלחת התיקון בכל נקודת זמן, ומערבבים כל דגימה בעת הוספתה.
לאחר הוספת הדגימה האחרונה, השאירו את צלחת התיקון באמבט המים למשך 10 דקות. ראשית, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. צנטריפוגה הצלחת ב 500 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant.
לאחר מכן, הכינו צלחת V-bottom טרייה של 96 בארות עם רייגנטים ממקודים, על ידי צינורות חמישה מיקרוליטרים של כל רהיט barcoding לתוך כל באר מילוי מספר הבאר הנדרש כדי להכתים כל אחת מהדגימות. בצלחת התא הקבועה, יש לעשות שימוש חוזר בתאים בכל באר עם 190 מיקרוליטרים של PBS. לאחר מכן, להעביר כל באר של תאים לגם המתאים בצלחת barcoding, ערבוב כל היטב ביסודיות.
תן לצלחת לנוח בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות בחושך. צנטריפוגה הצלחת ב 500 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, לשטוף את התאים בכל באר פעמיים עם לשטוף את הזרימה.
לאחר מכן להוסיף 190 microliters של לשטוף זרימה לכל באר של תאים. שלב את כל הדגימות המקודדות לצינור אחד של 15 מיליליטר והעבר כל בקרת פיצוי לצינור נפרד של 1.7 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant.
כדי להתחיל, להעביר שני מיליליטר של חיץ פרם שלוש לצינור 15 מיליליטר. יש לאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס כך שיהיה קר כקרח בעת שימוש. כאשר מוכן, להוסיף 1.5 מיליליטר של חיץ סל perm קר קרח לצינור 15 מיליליטר המכיל את אוכלוסיית התאים ברקוד dropwise תוך מערבולת כדי למנוע גושים התא.
הוסף 100 מיקרוליטרים של מאגר פרם קר כקרח לכל אחד מפקדי הפיצוי באותו אופן. מעבירים מיד את התאים למקפיא במינוס 80 מעלות למשך 30 דקות לפחות. כאשר מוכנים להתחיל כתמי אנטיגן, להסיר את התאים מהמקפיא ולהעביר אותם לקופסת קרח.
לשטוף את התאים שלוש פעמים עם עודף של לשטוף את הזרימה. צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את אוכלוסיית התאים הברקודדים בנפח של שטיפת זרימה, כך שיש 25 מיקרוליטרים של השעיית תאים לכל כתם פוספו-נוגדן.
להשעות מחדש את פקדי הפיצוי ב 200 microliters של לשטוף זרימה. כדי להתחיל להכין נוגדנים לכתמים, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של נוגדן ספציפי לפוספו, מדוללים בשטיפת זרימה, לכל באר של צלחת V-bottom טרייה של 96 באר. הוסף 15 microliters של סמן פני השטח, מדולל לשטוף זרימה ו 25 microliters של השעיית תא לכל באר עבור נפח סופי של 50 microliters ל הבאר.
תן לתאים לנוח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, לשטוף את התאים מוכתמים פעמיים עם לשטוף את הזרימה. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך חמש דקות.
השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים ב-150 מיקרוליטרים של שטיפת זרימה. לאחר מכן בצע ניתוח ציטומטריית זרימה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. בפרוטוקול המוצג, בר קידוד תלת מימדי מבוצע על ידי שילוב של שלושה צבעי בר קידוד.
דגימות בודדות לאחר מכן de-מפותל על ידי gating הבאים על כל reagent barcoding לעומת אזור פיזור בצד. רמות הזרחן המושרה בסיס וגירוי של 20 מולקולות איתות במורד הזרם של קולטן התא B מאופיינים לאחר מכן בתאי B של חולי CLL ובקרות נורמליות בתנאים שונים. Stat3 פוספו טירוזין 705 הוא ראה להיות מוסדר באופן משמעותי.
תאים מגורים עם אנטי IgM עד 30 דקות על מנת לזהות סטייות איתות המושרה דרך מסלול קולטן התא B. בעוד תאי CLL מחולים עם תצוגת IGVH ללא מוטציה רגישות מוגברת כלפי גירוי נגד IgM, זה רק מובהק סטטיסטית עבור AKT זרחן סרין 473. תאים נחשפים לאחר מכן מעכב הדלתא PI 3-kinase idelalisib כדי לבדוק אם האות aסט AKT pS473 ניתן להפוך.
כפי שמוצג כאן, רמות חריגים מופחתים באופן משמעותי על הטיפול באופן תלוי ריכוז המדגים כי מעכבי קינאז ניתן ליישם לנרמל איתות חריג בתאי CLL. לפני שתנסה לבצע הליך זה חשוב לזכור לסמן רייגנטים ונוגדנים, ולוודא כי סמני פני השטח שנבחרו תואמים לריגנטים של קיבעון וחלחלה. התאים צריכים להיות בהשעיה לניתוח זרחן, עדיין הפרוטוקול יכול להיות מותאם לתאים חריגים או רקמות בעקבות הליכים כדי להשיג השעיה של תא יחיד, כגון טריפזינציה שלמה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לניתוח בתפוקה בינונית עד גבוהה של אירועי פוספורילציה של חלבונים ברמה התאית באמצעות פוספו-פלואיטומטריה (phospho flow cytometry). שיטה זו יעילה לאפיון חריגות באותות תאיים, זיהוי ותיקוף של סמנים ביולוגיים, והערכת פרמקודינמיקה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
- העברת אותות
רקע
- ציטומטריה זרימה פוספו-ספציפית (Phospho flow cytometry) מאפשרת ניתוח של אותות בתא בודד.
- טכניקה זו יכולה לבחון כיצד מסלולי העברה של אותות מושפעים מגירויים או תרופות שונות.
- הוא מתאים לניתוח בתפוקה בינונית עד גבוהה.
- השיטה משפרת את היכולת לחקור תגובות תאיות ברמה מפורטת.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול מהימן לניתוח פוספורילציה של חלבונים.
- סיוע בזיהוי של סממנים ביולוגיים באיתות תאי.
- הערכת הפרמקודינמיקה של טיפולים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- את התאים מרחפים מחדש בתוך מצע RPMI 16/40 מועשר.
- כמות מוגדרת של תרחיף תאים מועברת ללוחית 96 בארות בעלת תחתית בצורת V.
- את הלוחית מדגירים באמבט מים שחומם מראש ל-37 °C.
- מוסיפים בופר קיבוע כדי להכין את לוחית הקיבוע לניתוח.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת ניתוח יעיל של נתיבי איתות.
- היא מספקת תובנות לגבי השפעות של תרופות על איתות תאי.
- רזולוציה של תא בודד משפרת את ההבנה של תגובות תאיות.
- תוצאות אלו עשויות להוביל לזיהוי של מטרות טיפוליות פוטנציאליות.
מסקנות
- פוספו-פלואו ציטומטריה (Phospho flow cytometry) היא כלי בעל ערך לחקר פוספורילציה של חלבונים.
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח בסביבת תפוקה גבוהה, מה שהופך אותו לנגיש ליישומים מחקריים מגוונים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו כדי לחקור רשתות איתות מורכבות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
ציטומטריה של זרימה של חלבונים זרחניים (Phospho flow cytometry) עם ברקוד תאים פלואורסצנטי מאפשרת ניתוח של תא בודד ברמת תפוקה בינונית עד גבוהה של זרחון חלבונים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות ובגילוי סממנים ביולוגיים באונקולוגיה ובאימונולוגיה. על ידי כימות שינויים באיתות המושרים על ידי תרופות ברזולוציה של תא בודד, השיטה מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים ומסייעת בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח תרופתי. התאימות שלה לציוד סטנדרטי של ציטומטרים מאפשרת שילוב בר-הרחבה בתהליכי גילוי לחקירת מסלולי איתות ולהערכה פרמקודינמית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת דינמיקת הפוספורילציה של חלבוני סיגנל במורד של רצפטורים, כגון B cell receptor, בתאים הרלוונטיים למחלה.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות זיהוי מולטיפלקס של 20 מולקולות סיגנל בתאים ראשוניים המופקים מחולים, תחת תנאים של גרייה ועכבה.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי זיהוי צמתים חריגים כגון AKT pS473 ו-STAT3 pY705, המהווים קורלציה עם רגישות לתרופות ומנגנוני עמידות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: ברקוד תאים פלואורסצנטי מאפשר איחוד של מספר דגימות ותנאים לשפרוֹב אחת, מה שמגדיל את התפוקה ומפחית את השונות בין הרצות במכשירי ציטומטריה זרימה סטנדרטיים.
- פלט כמותי: מייצר נתונים ברזולוציית תא בודד על רמות פוספורילציה, מה שמאפשר ניתוח תגובה למינון של מעכבי קינאז כגון idelalisib במודלים של CLL.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: שלבים סטנדרטיים של קיבוע, פרמיליזציה וצביעה בנוגדנים תומכים בהתאמה לסוגים שונים של תאי מערכת החיסון ופרוטוקולי גירוי עבור קמפיינים של סריקה אורךית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש בתאים ראשוניים ממטופלי CLL למידול הפרעות באותיות (signaling aberrations), המספק מערכת רלוונטית מבחינה קלינית להערכת טיפולים ממוקדים.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין תגובה לתרופות ex vivo לבין גילוי סמנים ביולוגיים על ידי קורלציה בין הפחתה של pS473 למצב מוטציית IGVH, ובכך תומך באסטרטגיות לסיווג מטופלים (patient stratification).
- הסרת סיכונים מכניסטית: מדגים הפיכה של אותיות שגויות באמצעות עיכוב PI3Kδ, מה שמתקף את המעורבות של המטרה (target engagement) ואת מנגנון הפעולה של מעכבי קינאז במודלים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מוקדם של מטרות, דרך אופטימיזציה של מובילים ועד לבדיקות יעילות פרה-קליניות, ובמיוחד בתוכניות בתחומי האימונולוגיה והאונקולוגיה המתמקדות במודולטורים של העברה אותית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי כימות שינויים בphosphorylation המושרה על ידי גירוי בתאי B אנושיים ראשוניים, ובכך מבהירה את מצבי ההפעלה של המסלולים בתנאי בסיס ובתנאי טיפול תרופתי.
- סריקה: מאפשרת הערכה רב-ערוצית (multiplexed) וניתנת לשחזור של השפעות תרכובות על רשתות סיגנלינג, כאשר שימוש בברקודים מקל על השוואה מקבילה של מינונים, נקודות זמן ורקעים גנטיים.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות של phosphorylation ברמת התא הבודד, המאפשרות השוואה סטטיסטית של מצבי סיגנלינג בין תנאים שונים, ובכך תומכת בהגדרת ספי תגובה של ביומרקרים ובסיווג תגובות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תגובה תרופתית in vitro לתיקוף ביומרקרים ex vivo באמצעות דגימות CLL ראשוניות, בהתאם לקריטריונים למעבר משלב פרה-קליני לשלב קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: פאנל ריאגנטים סטנדרטי ואסטרטגיית ברקודים מאפשרים שימוש חוזר בפרויקטים הבוחנים סיגנלינג של ציטוקינים, הפעלת רצפטורים לאנטיגן או מנגנוני פעולה של תרופות באוכלוסיות של תאי חיסון ותאים ממאירים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קישור בין גרייה של קולטן לבין פוספורילציה של אפקטורים במורחב (downstream) ברזולוציה של תא בודד בדגימות תאים ראשוניים הטרוגניים.
- ערך תפעולי: זרימת עבודה סטנדרטית עם ברקודים (barcoding) מגבירה את תפוקת הדגימות, ממזערת שונות טכנית וממקסמת את ניצול המכשיר בפלטפורמות פלואיטומטריה קיימות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי אספקת ראיות מוקדמות למודולציה של מטרה ועיכוב מסלול, ובכך מפחית השקעה בתרכובות עם פעילות ביולוגית לא מספקת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים (leads) מותאם סיכון, המבוסס על מעורבות המטרה ונרמול האותות בתאים אנושיים הרלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בציטומטריה של זרימה, בדיקת תיתור של נוגדנים ותיקוף של ריאגנטים ספציפיים לפוספו-פרוטאין כדי להבטיח את ספציפיות האות ולמזער את הרעש ברקע.
- תלוי בגישה לציטומטרים של זרימה בעלי תצורת לייזר וגלאים מספקת עבור פאנלים מרובי-סמנים של סמני פוספו וסמני פני שטח.
- מחייב סטנדרטיזציה של שלבי הקיבוע, הפרמיאביליזציה והשטיפה בין משתמשים ואתרים שונים כדי לשמור על השחזוריות של אותות הפוספורילציה.
- דורש אופטימיזציה של ריכוזי ריאגנטים לברקוד כדי למנוע חפיפה ספקטרלית ולהבטיח דה-קונבולוציה מדויקת של הדגימות במהלך הניתוח.
- מוגבל לתאים בתסמיס; דגימות של תאים תלויים-היצמדות או דגימות רקמה דורשות פירוק מוקדם לתסמיס של תאים בודדים באמצעות שיטות אנזימטיות או מכניות מתוקפות.
