Name: Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: למדו שיטת ציטומטריית זרימה פוספו לניתוח איתות תא בודד ברזולוציה גבוהה. הפרוטוקול מאפשר זיהוי ביומרקרים והערכת תרופות בחקר תאים ואימונולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נערך במעבדה של פרופסור קייטיל Taskén, נתמכה על ידי החברה לסרטן נורווגית Stiftelsen כריסטיאן גרהרד Jebsen. יוהנס לאנדסקרון, מריאן Enger הם הכירו לקריאה ביקורתית של כתב היד.

דגימות דם התקבלו בעקבות בכתב הסכמה מדעת מתורמים כל. המחקר היה מאושר על ידי הועדה המחוזית הרפואי, בריאות מחקר אתיקה של דרום-מזרח נורבגיה, המחקר דם אדם היתה מתבצעת על פי הצהרת הלסינקי8.
הערה: שלבים 1-3 צריכה להתבצע בתנאים סטריליים בשכונה תרביות רקמה.
1. בידוד של תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) של דגימות דם החולה CLL
התראה: דם אנושי צריך להיות מטופל על פי תקנות אבטחה ברמה 2.
<ol><li>לדלל את הדם 1:1 עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS: 136.9 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 10.1 מ מ נה2HPO4 x 2 H2O, מ מ 1.8 ח'2PO4, pH 7.4), העברת צינורות 50 מ ל (30 מ ל/צינור).</li>
	<li>בזהירות שכבה 10 מ"ל של דחיסות צבע בינוני (למשל, Lymphoprep) לתחתית הצינור באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 800 x g עבור 20 דקות ב 4 º C. PBMCs גלויים כעת על גבי השכבה הדרגתיות צפיפות בינונית.</li>
	<li>השתמש פיפטה פסטר כדי להעביר את התאים לתוך שני צינורות 50 מ ל חדש. לשטוף פעמיים עם PBS (מילוי את הצינורות).</li>
	<li>צנטריפוגה-350 גרם x עבור 15 דקות להשליך תגובת שיקוע, resuspend ב 3 מ"ל של PBS.</li>
	<li>לספור את התאים בשיטה המועדפת.</li>
	<li>Centrifuge התאים ב 350 x g עבור 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע. הערה: צעדים 1.8 ל 3.2 הן אופציונליות. זה אפשרי להמשיך ישירות אל שלב 3.3.</li>
	<li>Resuspend את התאים העובריים בסרום שור (FBS) בתוספת 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ומקפיאים למטה ב- aliquots מתאים באמצעות צינורות הקפאה. הערה: דימתיל סולפוקסיד רעיל לתאים. לעבוד מהר. ברגע התאים מעורבבים עם FBS/דימתיל סולפוקסיד. התאים יכולים להיות מאוחסנים לטווח ארוך חנקן נוזלי.</li>
</ol>2. הפשרתו של תאים
<ol><li>במהירות להפשיר את התאים בתוך אמבט מים 37 º C. הערה: דימתיל סולפוקסיד רעיל לתאים. לעבוד מהר כדי להגביל את החשיפה דימתיל סולפוקסיד.</li>
	<li>לשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מ"ל של מדיום רוזוול פארק אנדרטת מכון קר (1640 RPMI עם GlutaMAX משלימה, ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend התאים RPMI 1640 בינוני עם נתרן פירובט, חומצות אמינו MEM שאינם חיוניים, פניצילין/סטרפטומיצין (נוסף ב- 1 x דילול בהתאם להוראות), 10% FBS. העבר את התאים בקבוקון התרבות תאים קטנים ולהשאיר באינקובטור ב- 5% CO2, 37 º C למשך שעה לאפשר את התאים לכיול.</li>
</ol>3. הכנה של תאים
<ol><li>לספור את התאים קיימא באמצעות שיטה מועדפת.</li>
	<li>להעביר את התאים שפופרת 50 מ ל וזורקים צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend תאי RPMI 1640 בינוני (שלב 2.2) בתוספת 1% FBS לא יותר מ 50 x 106 תאים/מ ל....</li>
	<li>להעביר את הסכום הנדרש של השעיה תא בארות בצלחת V-התחתון טוב 96. הערה: מספר בארות מקביל מספר תנאים כדי להיבדק. דוגמאות עבור זמן-קורס גירוי נמשכים מבאר יחיד. חישוב מדגם µL 50 לכל נקודת זמן + 50 µL נפח מת. לשמור את דוגמאות לפקדים פיצוי (דוגמא אחת וללא רבב + דוגמא אחת לכל barcoding צבע).</li>
	<li>להעביר את הצלחת היטב 96 באמבט מים מחומם מראש-37 מעלות צלזיוס. שאר התאים למשך 10 דקות.</li>
</ol>4. גירוי, קיבוע תאים
הערה: בצע שלבים 4-8 על הספסל מעבדה (קרי, לא סטרילי).
התראה: המרכיב העיקרי של מאגר לתקן אני הוא paraformaldehyde, אשר הוא רעיל (שאיפת והעור קשר). . לטפל.
<ol><li>להכין צלחת 96 V-התחתון טוב עם 60 µL לתקן את המאגר אני לכל טוב עבור דגימה. יוצאים באמבט מים 37 º C. הערה: תאים: מאגר תיקון צריך להיות 1:1. על מנת לאפשר אידוי ב 37 מעלות צלזיוס, המאגר תיקון יש בתחילה בשפע.</li>
	<li>באופן אופציונלי, פנקו את התאים עם סמים לפני גירוי.</li>
	<li>דגימת הבקרה 50 µL להעביר הצלחת לתקן. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה.</li>
	<li>באופן אופציונלי, להתחיל המסלול-הזמן גירוי על-ידי הוספת 10 µg/mL אנטי-IgM לתאים. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה.</li>
	<li>העברה מדגם µL 50 הצלחת לתקן בכל זמן-נקודה. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. הערה: אנטי-IgM המושרה איתות בדרך כלל מתחילה מוקדם (דקות).</li>
	<li>להשאיר את הצלחת תיקון 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאחר הדגימה האחרונה נוספה.</li>
</ol>5. פלורסנט תא Barcoding (FCB)
הערה: לקבלת רשימה של barcoding ריאגנטים, ראה טבלה 1 .
<ol><li>לשטוף את התאים קבוע 3 x עם PBS (למלא בהם הבארות).</li>
	<li>צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להכין צלחת 96 V-התחתון טוב עם ריאגנטים barcoding. Pipet 5 µL של כל ריאגנט barcoding לכל טוב במספר שילובים הנדרש כדי להכתים את כל הדגימות בעקבות המטריצה מוכתמים, למשל, באיור 1B. כל מדגם יהיה שילוב ייחודי של ריכוזים barcoding שונים.</li>
	<li>Resuspend תאי µL 190 של PBS ולהעביר לצלחת barcoding. מערבבים ביסודיות. הערה: כתם אחד פיצויים לדוגמה עם הריכוז הסופי הגבוה ביותר המשמש עבור כל ריאגנט barcoding ולשמור על דוגמא אחת וללא רבב.</li>
	<li>להשאיר את התאים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.</li>
	<li>לשטוף את התאים מוכתם 2 x עם שטיפת זרימה (PBS, 1% FBS, אזיד הנתרן 0.09%) (למלא את הבארות).</li>
	<li>צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להוסיף µL 190 של זרימה שטיפת התאים ולשלב את הדגימות לבר-קוד בשפופרת אחת 15 מ"ל. העברת כל פקד פיצוי צינור mL 1.7 נפרדים.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
</ol>6. תא Permeabilization עבור צביעת אנטיגן תאיים
התראה: המרכיב העיקרי של פרם מאגר השלישי הוא מתנול רעיל (שאיפת והעור קשר) וזה דליק. . לטפל.
<ol><li>2 מ"ל של פרם מאגר השלישי להעביר צינור 15 מ"ל. יוצאים ב-20 ° C, אז זה קרה כקרח על השימוש. הערה: ניתן יהיה להשאיר את המאגר פרם ב-20 ° C מתחילת הניסוי.</li>
	<li>להוסיף 1.5 mL המאגר הקר פרם באוכלוסייה תא לבר-קוד (בשפופרת 15 מ"ל) ו- 100 µL לכל פקד פיצויים (ב מ ל 1.7 צינורות) drop-wise בעת vortexing כדי למנוע התאים להתאחד.</li>
	<li>העבר את התאים ישירות ל-80 מעלות צלזיוס. להשאיר מינימום של 30 דקות. הערה: זה טבעי כדי להשהות את הניסוי בשלב זה. תאים במאגר פרם יכול להיות מאוחסנת לטווח ארוך ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>7. נוגדן מכתים
הערה: ראה טבלה של חומרים עבור רשימה של נוגדנים ספציפיים פוספו המדווחת.
<ol><li>העבר את התאים מ-80 מעלות צלזיוס קופסה של קרח.</li>
	<li>לשטוף 3 x עם זרימה לשטוף. הערה: זה חשוב להוסיף זרימת שטיפת עודף לראות בגדר תא, למשל, להוסיף 3 מ"ל של שטיפת זרימה באוכלוסייה תא לבר-קוד ו- 1 מ"ל כל פקד פיצוי.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 500 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend האוכלוסייה תא לבר-קוד באמצעי אחסון של שטיפת זרימה, אשר מאפשר µL 25 של השעיה תא לכל כתם פוספו-נוגדן. Resuspend את הפקדים פיצוי ב 200 µL של זרימה לשטוף.</li>
	<li>להכין נוגדנים מכתים בצלחת V-התחתון טוב 96. עוצמת הקול הסופי יהיה µL 50/טוב. לכל טוב, מוסיפים נוגדן ספציפי פוספו מדולל בכביסה זרימה לאמצעי הסופי של µL 10, סמן משטח מדולל בכביסה זרימה לאמצעי הסופי של 15 µL, 25 µL של התא השעיה. הערה: נוגדן דילולים, צריך להיות טיטרציה לפני הניסוי. כוללים שליטה isotype.</li>
	<li>להשאיר את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.</li>
	<li>לשטוף את התאים מוכתם 2 x עם זרימה השטיפה (למלא בהם הבארות).</li>
	<li>צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend תאי µL 150 של זרימה לשטוף.</li>
</ol>8. הכנת פיצוי שולט
<ol><li>היכונו פקדים פיצוי fluorochromes מצומדת נוגדנים במקביל ההכתמה נוגדן. השתמש חרוזים פיצוי לפי הוראות הספק.</li>
</ol>9. לזרום Cytometry ניתוח
הערה: הניסוי ניתן להפעיל על cytometer של זרימה עם גבוהה תפוקה סמפלר (HTS).
<ol><li>למטב את המתח צינור (PMT) האופטיקה עם הפקד וללא רבב.</li>
	<li>להפעיל פקדי פיצוי ולחשב את המטריקס פיצוי.</li>
	<li>הפעל את הדגימות. הקצב אירוע צריך להיות בהתאם למפרטים כלי.</li>
</ol>10. gating אסטרטגיה וניתוח נתונים
<ol><li>לייבא את הקבצים FCS מהניסוי לתוכנת ניתוח cytometry זרימה כמו FlowJo או Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).</li>
	<li>אסטרטגיה חסימה<ol>
<li>בחר לימפוציטים על ידי התוויית האס-A לעומת FSC-A במגרש נקודה צפיפות.</li>
		<li>להציג לימפוציטים ולבחור ללבישה על ידי האס-A לעומת FSC -ו</li>
		<li>להציג את תאים בודדים ושער התא להקליד על-ידי התוויית האס-A נגד דה מרקר משטח.</li>
		<li>להציג את האוכלוסייה סוג התא פסיפיק בלו לעומת צפיפות האס-A מגרש ובחר האוכלוסיה FCB השונות בהתבסס על שלהם פסיפיק בלו מכתים בעוצמה (ראה איור 1 א').</li>
		<li>מגרש בערוץ נוגדן פוספו נגד הערוץ FCB, או כמו של heatmap (ראה איור 1A) כדי להציג את האירועים זירחון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחשב באמצעות הסינוס ההיפרבולי ההופכי (arcsinh) של MFI (חציון פלורסנט בעוצמה) השליטה isotype ' פוספו-האות לעומת פוספו-אותות (רמות זרחון הבזליים, ראה איור 1D), או של מגורה לעומת אוכלוסיות תאים unstimulated (ראה איור 1E).</li>
</ol>

<ol><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+reverse-phase+protein+arrays+as+pharmacodynamic+assays+for+functional+proteomics%2C+biomarker+discovery%2C+and+drug+development+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer.</a> Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).</li>
<li>Myhrvold, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+profiling+of+phospho-protein+levels+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia.</a> Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).</li>
<li>Parente-Ribes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spleen+tyrosine+kinase+inhibitors+reduce+CD40L-induced+proliferation+of+chronic+lymphocytic+leukemia+cells+but+not+normal+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells.</a> Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).</li>
<li>Blix, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-specific+flow+cytometry+identifies+aberrant+signaling+in+indolent+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma.</a> BMC Cancer. 12, 478(2012).</li>
<li>Irish, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+profiling+of+potentiated+phospho-protein+networks+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells.</a> Cell. 118 (2), 217-228 (2004).</li>
<li>Myklebust, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+B-cell+receptor+signaling+in+non-Hodgkin+lymphomas+identified+by+single-cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling.</a> Blood. 129 (6), 759-770 (2017).</li>
<li>World Medical Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Medical+Association+Declaration+of+Helsinki%3A+ethical+principles+for+medical+research+involving+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22THE+JOURNAL+OF+THE+AMERICAN+MEDICAL+ASSOCIATION%22%5BJournal%5D)">World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects.</a> THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 310 (20), 2191-2194 (2013).</li>
<li>Siveen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+STAT3+signaling+pathway+in+cancer%3A+role+of+synthetic+and+natural+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1845 (2), 136-154 (2014).</li>
<li>Fabbri, G., Dalla-Favera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+pathogenesis+of+chronic+lymphocytic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (3), 145-162 (2016).</li>
<li>Arnason, J. E., Brown, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+B+Cell+Signaling+in+Chronic+Lymphocytic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeting B Cell Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia.</a> Current Oncology Reports. 19 (9), 61(2017).</li>
<li>Landskron, J., Tasken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoprotein+Detection+by+High-Throughput+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphoprotein Detection by High-Throughput Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1355, 275-290 (2016).</li>
<li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> Journal of Immunology. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li>
<li>Pollheimer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-33+drives+a+proinflammatory+endothelial+activation+that+selectively+targets+nonquiescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial activation that selectively targets nonquiescent cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), e47-e55 (2013).</li>
<li>Ertsås, H. C., Nolan, G. P., LaBarge, M. A., Lorens, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsphere+cytometry+to+interrogate+microenvironment-dependent+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Microsphere cytometry to interrogate microenvironment-dependent cell signaling.</a> Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 9 (2), 123-134 (2017).</li>
<li>Lin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+phospho-specific+flow+cytometry+can+detect+dynamic+changes+of+phospho-Stat1+level+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells.</a> Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).</li>
<li>Simmons, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry-based+single-cell+analysis+of+intact+epithelial+signaling+reveals+MAPK+activation+divergent+from+TNF-alpha-induced+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo.</a> Molecular Systems Biology. 11 (10), 835(2015).</li>
<li>Simmons, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+coordination+between+signaling+pathways+is+revealed+in+human+colorectal+cancer+using+single-cell+mass+cytometry+of+archival+tissue+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks.</a> Science Signaling. 9 (449), rs11(2016).</li>
<li>Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+medicine+for+cancer+with+next-generation+functional+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).</li>
</ol>

המחבר אין לחשוף.

Cytometry זרימה פוספו היא טכניקה חזקה כדי למדוד רמות זרחון החלבון בתאים בודדים. מאז השיטה מסתמכת על צביעת עם נוגדנים, cytometry זרימה פוספו מוגבל על ידי נוגדנים זמינות. יתר על כן, על מנת לקבל תוצאות אמינות, לכל הנוגדנים צריך להיות טיטרציה ונבדקה לפני השימוש. פרוטוקול מפורט עבור טיטור של נוגדנים ספציפיים פוספו כבר תיאר במקום12. במהלך עיצוב לוח, שיקול של יחס אות לרעש היא קריטית. בדוגמה שהוצגו, כל פוספו-נוגדנים היו מצומדת כדי אלקסה עבור חיל הים 647. Fluorophore הזה לעיתים קרובות מספק ההפרש אופטימלי ב...

Cytometry זרימה פוספו משמש כדי לנתח את רמות זרחון החלבון ברזולוציה תא בודד. המטרה הכוללת של השיטה הוא למפות את דפוסי איתות סלולרי בתנאים שצוינו. על ידי ניצול הקיבולת multiparameter של cytometry זרימה, מספר איתות המסלולים ניתן לנתח בו-זמנית בקבוצות משנה שונות של אוכלוסיה הטרוגנית התא כגון דם היקפיים. תכונות אלה מציעות יתרונות אחרים נוגדן מבוססי טכנולוגיות כגון אימונוהיסטוכימיה, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה), מערך חלבון שלב הפוכה חלבון מערך (RPPA)1. ניתן לשלב cytometry זרימה פוספו barcoding תא פלורסנט (FCB), מה שאומר כי דגימות תאים בודדים מסומנות עם חתימות ייחודיות של צבעי פלורסנט כך שהם יכולים להיות מעורבבים יחד, צבעונית נותחו מדגם יחיד2. זה מפחית את צריכת נוגדן, מגביר את החוסן נתונים באמצעות השילוב של שליטה ושל דגימות שטופלו ומגביר את המהירות של רכישה. האוכלוסיה FCB יכול להיות לאחר מכן לחלק דוגמיות קטנות יותר, צבעונית עם נוגדנים ספציפיים פוספו ברורים עד 35, בהתאם לכמות החומר מתחיל. ניסויים פרופיל גדולה, ובכך, ניתן להפעיל עם חומרה cytometer רגיל. Cytometry זרימה פוספו הוחלה על פרופיל איתות המסלולים בדגימות החולה של מספר סוגי סרטן hematological, כולל לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL)3,4,5, לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) 6 ו שאינה הודג'קין לימפומה7. Cytometry זרימה פוספו היא לפיכך בגישה רב-עוצמה כדי לאפיין את סטיות איתות, לזהות, לאמת סמנים ביולוגיים, ולהעריך pharmacodynamics.
. הנה, פרוטוקול ממוטב עבור ניתוח של CLL דגימות מטופלים על ידי פוספו cytometry זרימה מסופק (איור 1 א'). דוגמאות של אפיון איתות הבזליים, אנטי-IgM/B תא קולטן לגירוי סמים ההפרעות מוצגים. תיאור מפורט של מטריקס FCB מסופק. הפרוטוקול בקלות ניתן להתאים סוגי תאים אחרים ההשעיה.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td>מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270169</td><td>תוסף למדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td>תוסף למדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td>תוסף למדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies AS</td><td>מדיום</td><td>שיפוע צפיפות</td></tr><tr><td>1114547 Anti-IgM</td><td>Southern Biotech</td><td>2022-01</td><td>לגירוי קולטן תאי B</td></tr><tr><td>BD Phosflow Fix Buffer I</td><td>BD</td><td>557870</td><td>מאגר קיבוע</td></tr><tr><td>BD Phosflow Perm Buffer III</td><td>BD</td><td>558050</td><td>מאגר פרמביליזציה</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 5-TFP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A30005</td><td>מגיב ברקוד</td></tr><tr><td>פסיפיק כחול Succinimidyl Ester</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10163</td><td>מגיב ברקוד</td></tr><tr><td>פסיפיק תפוז Succinimidyl Ester, מלח טריאתילאמוניום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P30253</td><td>מגיב ברקוד</td></tr><tr><td>חרוזי פיצוי</td><td>מוגדר על ידי משתמש</td><td></td><td>מינים נכונים תגובתיות</td></tr><tr><td>שפופרות פלקון</td><td>מוגדרות על ידי משתמש</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף</td><td>מוגדרות על ידי משתמש</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 באר צלחות V-תחתונות</td><td>מוגדרות על ידי משתמש</td><td></td><td>תואמות לצנטריפוגות ציטומטר זרימה</td></tr><tr><td></td><td>מוגדרות על ידי משתמש</td><td></td><td>עבור צינורות אפנדורף, צינורות פלקון וצלחות</td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>מוגדר על ידי משתמש</td><td></td><td>טמפרטורה מווסתת</td></tr><tr><td>זרימה ציטומטר</td><td>מוגדר על ידי משתמש</td><td></td><td>עם דגימת תפוקה גבוהה (HTS)</td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>הערות</td></tr><tr><td>< חזק>אנטיגן</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT (pS473)</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>4075</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> D9E <חזק>התייחסות:</חזק> Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, מעכבי טירוזין קינאז טחול מפחיתים;, המטולוגיקה, 101(2):e59-62 Sk&aring; nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T באמצעות CD2 ו-CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, אפנון של איתות פרוקסימלי בנורמלי וטרנספורמציה;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>ATF-2 (pT71)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8398</td><td>Clone: F-1 התייחסות: </חזק> Sk&aring; nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T דרך CD2 ו-CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 מניע אנדותל פרו-דלקתי&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>BLNK (pY84)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>558443</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> J117-1278 התייחסות: </חזק> Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, מעכבי טירוזין קינאז טחול מפחיתים;, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, אפנון של איתות פרוקסימלי בנורמלי וטרנספורמציה;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, דפוסים מובהקים של איתות קולטני תאי B ב&hellip;, דם, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY223)/ITK (pY180)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>564846</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> N35-86 <חזק>התייחסות:</חזק> Myklebust et al., 2017, דפוסים מובהקים של איתות קולטני תאי B ב&hellip;, דם, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY551)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>558129</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> 24a/BTK (Y551)&nbsp; התייחסות: Kalland et al., 2012, Modulation of Proximal Signaling in normal and transformed&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>Btk (pY551)/Itk (pY511)Beckton</td> <td>Dickinson Pharmingen</td><td>558134</td><td>clone: 24a/BTK (Y551)&nbsp; התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, מעכבי טירוזין קינאז טחול מפחיתים&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62</td></tr><tr><td>CD3&zeta; (עמ' 142)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>558489</td><td>clone: K25-407.69 התייחסות: Sk&aring; nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T באמצעות CD2 ו-CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>Histone H3 (pS10)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9716</td><td>Clone: D2C8 התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות פוספו-חלבון ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>I&kappa; B&אלפא;</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>5743</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> L35A5 <חזק>התייחסות:</חזק> Myklebust et al., 2017, דפוסים מובהקים של איתות קולטני תאי B in&hellip;, דם, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>LAT (pY171)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>558518</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> I58-1169 <חזק>התייחסות: </חזק> Sk&aring; nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T באמצעות CD2 ו-CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>Lck (pY505)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>558577</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> 4/LCK-Y505&nbsp; התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו>., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>MEK1 (pS298)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>560043</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> J114-64 <חזקהתייחסות:</חזק> Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T באמצעות CD2 ו- CD28&hellip;, Biochem J, 460(3): 399-410</td></tr><tr><td>NF-&kappa; B p65 (pS529)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>558422</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> K10-895.12.50 התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו-ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T דרך CD2 ו-CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, אפנון של איתות פרוקסימלי בנורמלי וטרנספורמציה;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 מניע אנדותל פרו-דלקתי;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>NF-&kappa; B p65 (pS536)</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>4887</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> 93H1 <חזק>התייחסות:</חזק> Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T דרך CD2 ו- CD28&hellip;, Biochem J, 460 (3): 399-410 Kalland et al., 2012, אפנון של איתות פרוקסימלי בנורמלי וטרנספורמציה&hellip;, Exp Cell Res, 318 (14): 1611-9</td></tr><tr><td>p38 MAPK (pT180 / Y182)</td> <td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>4552</td><td><חזק>שיבוט: < / חזק> 28B10 <חזק>התייחסות: </חזק> Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T דרך CD2 ו-CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 מניע אנדותל פרו-דלקתי;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (pT202/Y204)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4375</td><td>Clone: E10 התייחסות: </חזק> Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, מעכבי טירוזין קינאז טחול מפחיתים&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62 Sk&aring; nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T דרך CD2 ו-CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, אפנון של איתות פרוקסימלי בנורמלי וטרנספורמציה;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 מניע אנדותל פרו-דלקתי;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>p53 (pS15)</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>NN</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> 16G8 <חזק>התייחסות:</חזק> אירית ואחרים, 2007, שכפול Flt3 Y591 וביטוי יתר של Bcl-2;, דם, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS20)</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>NN</td><td>clone: Polyclonal התייחסות: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 שכפול וביטוי יתר של Bcl-2 &hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS37)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal התייחסות: Irish et al., 2007, שכפול Flt3 Y591 וביטוי יתר של Bcl-2&hellip;, דם, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS46)</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>NN</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> פוליקלונלי <חזק>התייחסות:</חזק> אירית ואחרים, 2007, שכפול Flt3 Y591 וביטוי יתר של Bcl-2&hellip;, דם, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS392)</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>NN</td><td>clone: Polyclonal התייחסות: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 שכפול וביטוי יתר של Bcl-2&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>PLC&gamma; 2 (pY759)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>558498</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> K86-689.37 התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, דפוסים מובהקים של איתות קולטני תאי B ב&hellip;, דם, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Rb (pS807/pS811)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>558590</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> J112-906 התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות חלבון פוספו-ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 מניע אנדותל פרו-דלקתי;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>S6-Ribos. Prot. (pS235/236)</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>4851</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> D57.2.2E התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות פוספו-חלבון ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>SAPK/JNK (pT183/Y185)</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>9257</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> G9 <חזק>התייחסות:</חזק> Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות חלבון פוספו-ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 מניע אנדותל פרו-דלקתי;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>SLP76 (pY128)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>558438</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> J141-668.36.58&nbsp; הפניה: Sk&aring; nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T באמצעות CD2 ו-CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>STAT1 (pY701)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>612597</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> 4a&nbsp; התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, דפוסים מובהקים של איתות קולטני תאי B ב&hellip;, דם, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>STAT3 (pY705)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>557815</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> 4/P-STAT3 <חזק>התייחסות:</חזק> Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות חלבון פוספו>., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>STAT4 (pY693)</td><td>Zymed/ThermoFisher Scientific</td><td>71-7900</td><td>Clone: Polyclonal <strongהתייחסות: Uzel et al., 2001, איתור STAT-4 זרחני תוך תאי על ידי ציטומטריית זרימה, Clin Immunol, 100(3): 270-6</td></tr><tr><td>STAT5 (pY694)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>612599</td><td><חזק>שיבוט: </חזק> 47/Stat5(pY694) התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T באמצעות CD2 ו-CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, דפוסים מובהקים של איתות קולטני תאי B ב&hellip;, דם, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>STAT6 (pY641)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>612601</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> 18/P-Stat6 התייחסות: < / חזק> Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות פוספו-חלבון ב.., Oncotarget, 9 (10): 9273-9284</td></tr><tr><td>SYK (pY525 / Y526)</td> <td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>12081</td> <td><חזק>שיבוט: < / חזק> C87C1 <חזק>התייחסות: < / חזק> Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9 (10): 9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, מעכבי טירוזין קינאז טחול reduce&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62</td></tr><tr><td>ZAP70/SYK (pY319/Y352)</td><td>בקטון דיקינסון פארמינגן</td><td>557817</td><td><חזק>שיבוט:</חזק> 17A/P-ZAP70 <חזק>התייחסות:</חזק> Sk&aring; nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T דרך CD2 ו-CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, אפנון של איתות פרוקסימלי בנורמלי וטרנספורמציה;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, דפוסים מובהקים של איתות קולטני תאי B ב&hellip;, דם, 129(6): 759-770</td></tr></tbody></table>

cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

איתות התא סוטה משחקת תפקיד מרכזי סרטן התפתחות והתקדמות. טיפולים ממוקדים ביותר הרומן מכוונים אכן חלבונים ופונקציות חלבון, שיבושים איתות התא עשוי לשמש לכן סמנים כדי לציין אפשרויות טיפול אישי. לעומת ניתוח DNA ו- RNA, שינויים בפעילות חלבון יכול להעריך בצורה יעילה יותר את המנגנונים שבבסיס תרופות רגישות והתנגדות. Cytometry זרימה פוספו היא טכניקה חזקה המודד אירועים זירחון חלבונים ברמה התאית, תכונה חשובה שמבדיל שיטה זו לבין גישות אחרות נוגדן מבוסס. השיטה מאפשרת ניתוח בו זמנית של מספר חלבונים איתות. בשילוב עם פלורסנט תא barcoding, ניתן לרכוש גדול בינוני - כדי בתפוקה גבוהה-ערכות נתונים על-ידי cytometer סטנדרטי חומרה תוך זמן קצר. Cytometry זרימה פוספו יש יישומים בלימודי ביולוגיה בסיסית והן במחקר קליני, כולל מערכת אזעקה ניתוח, סמן גילוי והערכה של pharmacodynamics. כאן, פרוטוקול נסיוני מפורט מסופק עבור ניתוח תזרים פוספו תאי תאי דם היקפיים מטוהרים, תאים לוקמיה לימפוציטית כרונית כדוגמא.

השלבים העיקריים של פרוטוקול cytometry זרימה פוספו מומחשים איור 1A. בדוגמה שהוצגו, תאים CLL היו מוכתמים הכימית barcoding פסיפיק בלו-דילולים ארבע. Barcoding תלת מימדי יכול להתבצע על-ידי שילוב שלושה צבעים barcoding, כמופיע ב איור 1B. הדגימות בודדים הם deconvoluted אז על ידי gating הבאים על כל barcoding ריאגנט נגד האס-A (איור 1C). מידע מפורט אודות ריאגנטים barcoding מפורטים בטבלה 1</stro...

כאן מוצג פרוטוקול לניתוח בינוני - כדי תפוקה גבוהה של חלבון זרחון אירועים ברמה התאית. Cytometry זרימה פוספו היא גישה רב-עוצמה כדי לאפיין את סטיות איתות, לזהות, לאמת סמנים ביולוגיים, ולהעריך pharmacodynamics.

Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים של ביולוגיה של התא ואימונולוגיה כגון כיצד מסלולי איתות מושפעים גירויים שונים או תרופות? היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת לך לבצע ניתוח איתות תא יחיד באופן תפוקה בינונית עד גבוהה. לאחר השעיה מחדש של התאים במדיום RPMI 16/40 בתוספת, העבר את הכמות הנדרשת של השעיית תאים ל הבאר של צלחת V-bottom 96 באר.מעבירים את הצלחת לאמבט מים שחומם מראש ב-37 מעלות ומאפשרים לה לנוח שם במשך 10 דקות. לאחר מכן להוסיף 60 microliters של מאגר קבוע אחד לכל באר של צלחת באר 96 חדש כדי להגדיר את צלחת לתקן. מניחים את הצלחת באמבט המים 37 מעלות צלזיוס.מעבירים דגימת בקרה של 50 מיקרוליטר לצלחת ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה. באופן אופציונלי, להוסיף 10 microliters לכל מיליליטר אנטי IgM לתאים כדי להתחיל את קורס זמן הסימולציה לערבב על ידי צינור למעלה ולמטה. מעבירים דגימת 50 מיקרוליטר לצלחת התיקון בכל נקודת זמן, ומערבבים כל דגימה בעת הוספתה.לאחר הוספת הדגימה האחרונה, השאירו את צלחת התיקון באמבט המים למשך 10 דקות. ראשית, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. צנטריפוגה הצלחת ב 500 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant.לאחר מכן, הכינו צלחת V-bottom טרייה של 96 בארות עם רייגנטים ממקודים, על ידי צינורות חמישה מיקרוליטרים של כל רהיט barcoding לתוך כל באר מילוי מספר הבאר הנדרש כדי להכתים כל אחת מהדגימות. בצלחת התא הקבועה, יש לעשות שימוש חוזר בתאים בכל באר עם 190 מיקרוליטרים של PBS. לאחר מכן, להעביר כל באר של תאים לגם המתאים בצלחת barcoding, ערבוב כל היטב ביסודיות.תן לצלחת לנוח בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות בחושך. צנטריפוגה הצלחת ב 500 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, לשטוף את התאים בכל באר פעמיים עם לשטוף את הזרימה.לאחר מכן להוסיף 190 microliters של לשטוף זרימה לכל באר של תאים. שלב את כל הדגימות המקודדות לצינור אחד של 15 מיליליטר והעבר כל בקרת פיצוי לצינור נפרד של 1.7 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant.כדי להתחיל, להעביר שני מיליליטר של חיץ פרם שלוש לצינור 15 מיליליטר. יש לאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס כך שיהיה קר כקרח בעת שימוש. כאשר מוכן, להוסיף 1.5 מיליליטר של חיץ סל perm קר קרח לצינור 15 מיליליטר המכיל את אוכלוסיית התאים ברקוד dropwise תוך מערבולת כדי למנוע גושים התא.הוסף 100 מיקרוליטרים של מאגר פרם קר כקרח לכל אחד מפקדי הפיצוי באותו אופן. מעבירים מיד את התאים למקפיא במינוס 80 מעלות למשך 30 דקות לפחות. כאשר מוכנים להתחיל כתמי אנטיגן, להסיר את התאים מהמקפיא ולהעביר אותם לקופסת קרח.לשטוף את התאים שלוש פעמים עם עודף של לשטוף את הזרימה. צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את אוכלוסיית התאים הברקודדים בנפח של שטיפת זרימה, כך שיש 25 מיקרוליטרים של השעיית תאים לכל כתם פוספו-נוגדן.להשעות מחדש את פקדי הפיצוי ב 200 microliters של לשטוף זרימה. כדי להתחיל להכין נוגדנים לכתמים, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של נוגדן ספציפי לפוספו, מדוללים בשטיפת זרימה, לכל באר של צלחת V-bottom טרייה של 96 באר. הוסף 15 microliters של סמן פני השטח, מדולל לשטוף זרימה ו 25 microliters של השעיית תא לכל באר עבור נפח סופי של 50 microliters ל הבאר.תן לתאים לנוח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, לשטוף את התאים מוכתמים פעמיים עם לשטוף את הזרימה. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך חמש דקות.השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים ב-150 מיקרוליטרים של שטיפת זרימה. לאחר מכן בצע ניתוח ציטומטריית זרימה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. בפרוטוקול המוצג, בר קידוד תלת מימדי מבוצע על ידי שילוב של שלושה צבעי בר קידוד.דגימות בודדות לאחר מכן de-מפותל על ידי gating הבאים על כל reagent barcoding לעומת אזור פיזור בצד. רמות הזרחן המושרה בסיס וגירוי של 20 מולקולות איתות במורד הזרם של קולטן התא B מאופיינים לאחר מכן בתאי B של חולי CLL ובקרות נורמליות בתנאים שונים. Stat3 פוספו טירוזין 705 הוא ראה להיות מוסדר באופן משמעותי.תאים מגורים עם אנטי IgM עד 30 דקות על מנת לזהות סטייות איתות המושרה דרך מסלול קולטן התא B. בעוד תאי CLL מחולים עם תצוגת IGVH ללא מוטציה רגישות מוגברת כלפי גירוי נגד IgM, זה רק מובהק סטטיסטית עבור AKT זרחן סרין 473. תאים נחשפים לאחר מכן מעכב הדלתא PI 3-kinase idelalisib כדי לבדוק אם האות aסט AKT pS473 ניתן להפוך.כפי שמוצג כאן, רמות חריגים מופחתים באופן משמעותי על הטיפול באופן תלוי ריכוז המדגים כי מעכבי קינאז ניתן ליישם לנרמל איתות חריג בתאי CLL. לפני שתנסה לבצע הליך זה חשוב לזכור לסמן רייגנטים ונוגדנים, ולוודא כי סמני פני השטח שנבחרו תואמים לריגנטים של קיבעון וחלחלה. התאים צריכים להיות בהשעיה לניתוח זרחן, עדיין הפרוטוקול יכול להיות מותאם לתאים חריגים או רקמות בעקבות הליכים כדי להשיג השעיה של תא יחיד, כגון טריפזינציה שלמה.

phospho-flow-cytometry-with-fluorescent-cell-barcoding-for-single

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

שיטת ה-IP FCM מוצג, המאפשר רגיש, הערכה החזקה, ביוכימיות של חלבונים אינטראקציות הילידים, ללא צורך בהנדסה גנטית או גודל מדגם גדול.

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

Subcellular לוקליזציה של חלבונים חשוב בקביעת הרגולציה במרחב ובזמן של איתות התא. כאן אנו מתארים השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) כשיטה פשוטה לניטור אינטראקציות המרחבי של חלבונים בתא.

השלמה Fluorescence bimolecular

שינויים עדינים מעקב בהתקדמות ו קינטיקה של שלבי מחזור התא ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בשילוב של תיוג חילוף החומרים של חומצות גרעין עם BrdU ו מכתים סך הדנ"א הגנומי באמצעות יודיד Propidium. שיטה זו מונעת את הצורך של סינכרון כימי של תאים רכיבה על אופניים, ובכך למנוע את כניסתה של נזק שאינו ספציפי בדנ"א, אשר בתורו משפיע על התקדמות מחזור התא.

מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

בסרטון זה אנו מדגימים את האינטראקציה בין חלבונים לבין שלפוחיות פוספוליפידים מלאכותיות באמצעות ציטומטריית זרימה כמותית. קשירת חלבונים המסומנים בפלואורסצנטיות לשלפוחיות פוספוליפידים המסומנים בפלואורסצנטיות מגבירה את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת, ועלייה זו מזוהה על ידי ציטומטר זרימה.

ציטומטריית זרימה כמותית לחקר אינטראקציות שלפוחית חלבון-פוספוליפידים

סרטון זה מדגיש שיטה פרוטאומית חד-תאית המשתמשת בנוגדנים מצומדים במתכת כבדה לברקוד תאים מובחן. לאחר מכן, immunostaining ו cytometry המסה מוחלים כדי להעריך שינויים פנוטיפיים חיסוניים ותפקודיים בתאי חיסון אנושיים שמקורם בדם שלם.

בדיקת ברקוד לאפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאי מערכת החיסון

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular מספק שיטה כמותית תפוקה גבוהה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על אתרי קישור ומיפוי חלבון לסינון גורמים המווסתים את האינטראקציה בין חלבונים.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

מאז גילוי גן החלבון הפלואורסצנטי הירוק, חלבונים פלואורסצנטיים השפיעו על הביולוגיה המולקולרית של התא. פרוטוקול זה מתאר כיצד ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים מובחנים באמצעות הנדסה גנטית משמש לברקוד תאים בודדים. ההליך מאפשר מעקב אחר אוכלוסיות שונות בתערובת תאים, שהיא אידיאלית עבור יישומים מרובים.

Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed

Phosphoinositides מאותת שומנים שיחסית שפע במהירות משתנה בתגובה לגירויים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת השפע של phosphoinositides ידי תאים מטבולית תיוג עם -inositol מיו 3 H-, ואחרי חילוץ וdeacylation. glycero-inositides חולץ אז מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים ולכמת ידי זרימת נצנץ.

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

PI (4,5) P 2 מסדיר פונקציות סלולריות שונות, אך הארגון ננו שלה בקרום פלזמת התא הוא הבין היטב. על ידי PI תיוג (4,5) P 2 עם בדיקה ניאון כפול צבע התמזגו תחום Pleckstrin הומולוגיה, אנו מתארים גישה חדשנית ללמוד את PI (4,5) P 2 הפריסה המרחבית בקרום פלזמה ב ננומטר סולם .

הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות

כאן אנו מציגים bilayer שומנים בדם בהקשר של פלטפורמת microfluidic ללמוד אינטראקציות חלבון- phosphoinositide בשיטה ללא תווית המבוססת על אפנון pH.

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

כאן, אנו מתארים קבוצה של שיטות לאפיון האינטראקציה של חלבונים עם ממברנות של תאים או microvesicles.

ניתוח האינטראקציה של חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית עם מיקרו-וסיקלים מלאכותיים של פוספוליפידים באמצעות ציטומטריה כמותית של זרימה

למדו שיטת ציטומטריית זרימה פוספו לניתוח איתות תא בודד ברזולוציה גבוהה. הפרוטוקול מאפשר זיהוי ביומרקרים והערכת תרופות בחקר תאים ואימונולוגיה.

Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן

גלה סרטונים נוספים