Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן
October 4th, 2018
כאן מוצג פרוטוקול לניתוח בינוני - כדי תפוקה גבוהה של חלבון זרחון אירועים ברמה התאית. Cytometry זרימה פוספו היא גישה רב-עוצמה כדי לאפיין את סטיות איתות, לזהות, לאמת סמנים ביולוגיים, ולהעריך pharmacodynamics.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים של ביולוגיה של התא ואימונולוגיה כגון כיצד מסלולי איתות מושפעים גירויים שונים או תרופות? היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת לך לבצע ניתוח איתות תא יחיד באופן תפוקה בינונית עד גבוהה. לאחר השעיה מחדש של התאים במדיום RPMI 16/40 בתוספת, העבר את הכמות הנדרשת של השעיית תאים ל הבאר של צלחת V-bottom 96 באר.
מעבירים את הצלחת לאמבט מים שחומם מראש ב-37 מעלות ומאפשרים לה לנוח שם במשך 10 דקות. לאחר מכן להוסיף 60 microliters של מאגר קבוע אחד לכל באר של צלחת באר 96 חדש כדי להגדיר את צלחת לתקן. מניחים את הצלחת באמבט המים 37 מעלות צלזיוס.
מעבירים דגימת בקרה של 50 מיקרוליטר לצלחת ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה. באופן אופציונלי, להוסיף 10 microliters לכל מיליליטר אנטי IgM לתאים כדי להתחיל את קורס זמן הסימולציה לערבב על ידי צינור למעלה ולמטה. מעבירים דגימת 50 מיקרוליטר לצלחת התיקון בכל נקודת זמן, ומערבבים כל דגימה בעת הוספתה.
לאחר הוספת הדגימה האחרונה, השאירו את צלחת התיקון באמבט המים למשך 10 דקות. ראשית, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. צנטריפוגה הצלחת ב 500 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant.
לאחר מכן, הכינו צלחת V-bottom טרייה של 96 בארות עם רייגנטים ממקודים, על ידי צינורות חמישה מיקרוליטרים של כל רהיט barcoding לתוך כל באר מילוי מספר הבאר הנדרש כדי להכתים כל אחת מהדגימות. בצלחת התא הקבועה, יש לעשות שימוש חוזר בתאים בכל באר עם 190 מיקרוליטרים של PBS. לאחר מכן, להעביר כל באר של תאים לגם המתאים בצלחת barcoding, ערבוב כל היטב ביסודיות.
תן לצלחת לנוח בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות בחושך. צנטריפוגה הצלחת ב 500 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, לשטוף את התאים בכל באר פעמיים עם לשטוף את הזרימה.
לאחר מכן להוסיף 190 microliters של לשטוף זרימה לכל באר של תאים. שלב את כל הדגימות המקודדות לצינור אחד של 15 מיליליטר והעבר כל בקרת פיצוי לצינור נפרד של 1.7 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant.
כדי להתחיל, להעביר שני מיליליטר של חיץ פרם שלוש לצינור 15 מיליליטר. יש לאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס כך שיהיה קר כקרח בעת שימוש. כאשר מוכן, להוסיף 1.5 מיליליטר של חיץ סל perm קר קרח לצינור 15 מיליליטר המכיל את אוכלוסיית התאים ברקוד dropwise תוך מערבולת כדי למנוע גושים התא.
הוסף 100 מיקרוליטרים של מאגר פרם קר כקרח לכל אחד מפקדי הפיצוי באותו אופן. מעבירים מיד את התאים למקפיא במינוס 80 מעלות למשך 30 דקות לפחות. כאשר מוכנים להתחיל כתמי אנטיגן, להסיר את התאים מהמקפיא ולהעביר אותם לקופסת קרח.
לשטוף את התאים שלוש פעמים עם עודף של לשטוף את הזרימה. צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את אוכלוסיית התאים הברקודדים בנפח של שטיפת זרימה, כך שיש 25 מיקרוליטרים של השעיית תאים לכל כתם פוספו-נוגדן.
להשעות מחדש את פקדי הפיצוי ב 200 microliters של לשטוף זרימה. כדי להתחיל להכין נוגדנים לכתמים, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של נוגדן ספציפי לפוספו, מדוללים בשטיפת זרימה, לכל באר של צלחת V-bottom טרייה של 96 באר. הוסף 15 microliters של סמן פני השטח, מדולל לשטוף זרימה ו 25 microliters של השעיית תא לכל באר עבור נפח סופי של 50 microliters ל הבאר.
תן לתאים לנוח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, לשטוף את התאים מוכתמים פעמיים עם לשטוף את הזרימה. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך חמש דקות.
השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים ב-150 מיקרוליטרים של שטיפת זרימה. לאחר מכן בצע ניתוח ציטומטריית זרימה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. בפרוטוקול המוצג, בר קידוד תלת מימדי מבוצע על ידי שילוב של שלושה צבעי בר קידוד.
דגימות בודדות לאחר מכן de-מפותל על ידי gating הבאים על כל reagent barcoding לעומת אזור פיזור בצד. רמות הזרחן המושרה בסיס וגירוי של 20 מולקולות איתות במורד הזרם של קולטן התא B מאופיינים לאחר מכן בתאי B של חולי CLL ובקרות נורמליות בתנאים שונים. Stat3 פוספו טירוזין 705 הוא ראה להיות מוסדר באופן משמעותי.
תאים מגורים עם אנטי IgM עד 30 דקות על מנת לזהות סטייות איתות המושרה דרך מסלול קולטן התא B. בעוד תאי CLL מחולים עם תצוגת IGVH ללא מוטציה רגישות מוגברת כלפי גירוי נגד IgM, זה רק מובהק סטטיסטית עבור AKT זרחן סרין 473. תאים נחשפים לאחר מכן מעכב הדלתא PI 3-kinase idelalisib כדי לבדוק אם האות aסט AKT pS473 ניתן להפוך.
כפי שמוצג כאן, רמות חריגים מופחתים באופן משמעותי על הטיפול באופן תלוי ריכוז המדגים כי מעכבי קינאז ניתן ליישם לנרמל איתות חריג בתאי CLL. לפני שתנסה לבצע הליך זה חשוב לזכור לסמן רייגנטים ונוגדנים, ולוודא כי סמני פני השטח שנבחרו תואמים לריגנטים של קיבעון וחלחלה. התאים צריכים להיות בהשעיה לניתוח זרחן, עדיין הפרוטוקול יכול להיות מותאם לתאים חריגים או רקמות בעקבות הליכים כדי להשיג השעיה של תא יחיד, כגון טריפזינציה שלמה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול לניתוח תפוקה בינוני עד גבוה של אירועי זרחון חלבון ברמת התא באמצעות ציטומטריה של זרימה פוספואטית. שיטה זו יעילה לביאור חריגות באיתות, זיהוי ואימות סמני סימנים ביולוגיים והערכת פרמקודינמיקה.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
- העברת אותות
רקע
- ציטומטריה של זרימה פוספואטית מאפשרת ניתוח איתות של תא יחיד.
- הטכניקה יכולה לבחון כיצד מסלולי איתות מושפעים מגירויים או תרופות שונות.
- היא מתאימה לניתוח תפוקה בינוני עד גבוה.
- השיטה משפרת את היכולת לחקור תגובות תאיות ברמה מפורטת.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול אמין לניתוח זרחון חלבון.
- לאפשר זיהוי סמני סימנים ביולוגיים באיתות התאי.
- להעריך את הפרמקודינמיקה של טיפולים שונים.
שיטות ששימשו
- תאים מושעים מחדש במדיום RPMI 16/40 מועשר.
- כמות מסוימת של השעיה תאית מועברת לצלחת תחתית V 96 חור.
- הצלחת מוחזקת במי רחצה מחוממים מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- חומר חיץ קבוע מתווסף להגדרת צלחת הקיבעון לניתוח.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת ניתוח יעיל של מסלולי איתות.
- היא מספקת תובנות לגבי השפעות התרופות על איתות תאי.
- רזולוציה של תא יחיד משפרת את ההבנה של תגובות תאיות.
- תוצאות יכולות להוביל לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות.
מסקנות
- ציטומטריה של זרימה פוספואטית היא כלי חשוב לחקר זרחון חלבון.
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח בתפוקה גבוהה, מה שהופך אותו לנגיש ליישומי מחקר שונים.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על שיטה זו כדי לחקור רשתות איתות מורכבות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Phospho flow cytometry with fluorescent cell barcoding enables medium- to high-throughput single-cell analysis of protein phosphorylation, supporting target validation and biomarker discovery in oncology and immunology. By quantifying drug-induced signaling changes at single-cell resolution, the method enhances predictive confidence in preclinical models and informs go/no-go decisions in therapeutic development. Its compatibility with standard cytometer hardware allows scalable integration into discovery workflows for pathway interrogation and pharmacodynamic assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring phosphorylation dynamics of signaling proteins downstream of receptors such as B cell receptor in disease-relevant cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiplexed detection of 20 signaling molecules in primary patient-derived cells under stimulated and inhibited conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying aberrant nodes like AKT pS473 and STAT3 pY705 that correlate with drug sensitivity and resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent cell barcoding allows pooling of multiple samples and conditions into a single tube, increasing throughput and reducing run-to-run variability on standard flow cytometers.
- Quantitative Output: Generates single-cell resolution data on phosphorylation levels, enabling dose-response analysis of kinase inhibitors such as idelalisib in CLL models.
- Platform Reuse: Standardized fixation, permeabilization, and antibody staining steps support adaptation across immune cell types and stimulation paradigms for longitudinal screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses primary CLL patient cells to model signaling aberrations, providing a clinically relevant system for evaluating targeted therapies.
- Translational Continuity: Links ex vivo drug response to biomarker discovery by correlating pS473 reduction with IGVH mutation status, supporting patient stratification strategies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates reversal of aberrant signaling by PI3Kδ inhibition, validating target engagement and mechanism of action for kinase inhibitors in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead optimization to preclinical efficacy testing, particularly in immunology and oncology programs focused on signal transduction modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying stimulus-induced phosphorylation changes in primary human B cells, clarifying pathway activation states under basal and drug-treated conditions.
- Screening: Enables reproducible, multiplexed assessment of compound effects on signaling networks, with barcoding facilitating side-by-side comparison of doses, time points, and genetic backgrounds.
- Analytics: Delivers quantitative, single-cell phosphorylation readouts that allow statistical comparison of signaling states across conditions, supporting biomarker threshold setting and response classification.
- Translational Research: Connects in vitro drug response to ex vivo biomarker validation using primary CLL specimens, aligning with preclinical-to-clinical transition criteria.
- Enterprise Reuse: Standardized reagent panel and barcoding strategy allow reuse across projects studying cytokine signaling, antigen receptor activation, or drug mechanism in immune and malignant cell populations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor stimulation to downstream effector phosphorylation at single-cell resolution in heterogeneous primary cell samples.
- Operational Value: Standardized workflow with barcoding increases sample throughput, minimizes technical variance, and maximizes instrument utilization on existing flow cytometry platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early evidence of target modulation and pathway inhibition, reducing investment in compounds with insufficient biological activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on target engagement and signaling normalization in disease-relevant human cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, antibody titration, and phospho-specific reagent validation to ensure signal specificity and minimize background.
- Dependent on access to flow cytometers with sufficient laser and detector configuration for multiplexed phospho- and surface marker panels.
- Necessitates standardization of fixation, permeabilization, and washing steps across users and sites to maintain reproducibility of phosphorylation signals.
- Requires optimization of barcoding reagent concentrations to avoid spectral overlap and ensure accurate sample deconvolution during analysis.
- Limited to cells in suspension; adherence-dependent or tissue samples require prior dissociation to single-cell suspension using validated enzymatic or mechanical methods.
