Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן

כאן מוצג פרוטוקול לניתוח בינוני - כדי תפוקה גבוהה של חלבון זרחון אירועים ברמה התאית. Cytometry זרימה פוספו היא גישה רב-עוצמה כדי לאפיין את סטיות איתות, לזהות, לאמת סמנים ביולוגיים, ולהעריך pharmacodynamics.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים של ביולוגיה של התא ואימונולוגיה כגון כיצד מסלולי איתות מושפעים גירויים שונים או תרופות? היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת לך לבצע ניתוח איתות תא יחיד באופן תפוקה בינונית עד גבוהה. לאחר השעיה מחדש של התאים במדיום RPMI 16/40 בתוספת, העבר את הכמות הנדרשת של השעיית תאים ל הבאר של צלחת V-bottom 96 באר.

מעבירים את הצלחת לאמבט מים שחומם מראש ב-37 מעלות ומאפשרים לה לנוח שם במשך 10 דקות. לאחר מכן להוסיף 60 microliters של מאגר קבוע אחד לכל באר של צלחת באר 96 חדש כדי להגדיר את צלחת לתקן. מניחים את הצלחת באמבט המים 37 מעלות צלזיוס.

מעבירים דגימת בקרה של 50 מיקרוליטר לצלחת ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה. באופן אופציונלי, להוסיף 10 microliters לכל מיליליטר אנטי IgM לתאים כדי להתחיל את קורס זמן הסימולציה לערבב על ידי צינור למעלה ולמטה. מעבירים דגימת 50 מיקרוליטר לצלחת התיקון בכל נקודת זמן, ומערבבים כל דגימה בעת הוספתה.

לאחר הוספת הדגימה האחרונה, השאירו את צלחת התיקון באמבט המים למשך 10 דקות. ראשית, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. צנטריפוגה הצלחת ב 500 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant.

לאחר מכן, הכינו צלחת V-bottom טרייה של 96 בארות עם רייגנטים ממקודים, על ידי צינורות חמישה מיקרוליטרים של כל רהיט barcoding לתוך כל באר מילוי מספר הבאר הנדרש כדי להכתים כל אחת מהדגימות. בצלחת התא הקבועה, יש לעשות שימוש חוזר בתאים בכל באר עם 190 מיקרוליטרים של PBS. לאחר מכן, להעביר כל באר של תאים לגם המתאים בצלחת barcoding, ערבוב כל היטב ביסודיות.

תן לצלחת לנוח בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות בחושך. צנטריפוגה הצלחת ב 500 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, לשטוף את התאים בכל באר פעמיים עם לשטוף את הזרימה.

לאחר מכן להוסיף 190 microliters של לשטוף זרימה לכל באר של תאים. שלב את כל הדגימות המקודדות לצינור אחד של 15 מיליליטר והעבר כל בקרת פיצוי לצינור נפרד של 1.7 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant.

כדי להתחיל, להעביר שני מיליליטר של חיץ פרם שלוש לצינור 15 מיליליטר. יש לאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס כך שיהיה קר כקרח בעת שימוש. כאשר מוכן, להוסיף 1.5 מיליליטר של חיץ סל perm קר קרח לצינור 15 מיליליטר המכיל את אוכלוסיית התאים ברקוד dropwise תוך מערבולת כדי למנוע גושים התא.

הוסף 100 מיקרוליטרים של מאגר פרם קר כקרח לכל אחד מפקדי הפיצוי באותו אופן. מעבירים מיד את התאים למקפיא במינוס 80 מעלות למשך 30 דקות לפחות. כאשר מוכנים להתחיל כתמי אנטיגן, להסיר את התאים מהמקפיא ולהעביר אותם לקופסת קרח.

לשטוף את התאים שלוש פעמים עם עודף של לשטוף את הזרימה. צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את אוכלוסיית התאים הברקודדים בנפח של שטיפת זרימה, כך שיש 25 מיקרוליטרים של השעיית תאים לכל כתם פוספו-נוגדן.

להשעות מחדש את פקדי הפיצוי ב 200 microliters של לשטוף זרימה. כדי להתחיל להכין נוגדנים לכתמים, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של נוגדן ספציפי לפוספו, מדוללים בשטיפת זרימה, לכל באר של צלחת V-bottom טרייה של 96 באר. הוסף 15 microliters של סמן פני השטח, מדולל לשטוף זרימה ו 25 microliters של השעיית תא לכל באר עבור נפח סופי של 50 microliters ל הבאר.

תן לתאים לנוח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, לשטוף את התאים מוכתמים פעמיים עם לשטוף את הזרימה. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך חמש דקות.

השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים ב-150 מיקרוליטרים של שטיפת זרימה. לאחר מכן בצע ניתוח ציטומטריית זרימה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. בפרוטוקול המוצג, בר קידוד תלת מימדי מבוצע על ידי שילוב של שלושה צבעי בר קידוד.

דגימות בודדות לאחר מכן de-מפותל על ידי gating הבאים על כל reagent barcoding לעומת אזור פיזור בצד. רמות הזרחן המושרה בסיס וגירוי של 20 מולקולות איתות במורד הזרם של קולטן התא B מאופיינים לאחר מכן בתאי B של חולי CLL ובקרות נורמליות בתנאים שונים. Stat3 פוספו טירוזין 705 הוא ראה להיות מוסדר באופן משמעותי.

תאים מגורים עם אנטי IgM עד 30 דקות על מנת לזהות סטייות איתות המושרה דרך מסלול קולטן התא B. בעוד תאי CLL מחולים עם תצוגת IGVH ללא מוטציה רגישות מוגברת כלפי גירוי נגד IgM, זה רק מובהק סטטיסטית עבור AKT זרחן סרין 473. תאים נחשפים לאחר מכן מעכב הדלתא PI 3-kinase idelalisib כדי לבדוק אם האות aסט AKT pS473 ניתן להפוך.

כפי שמוצג כאן, רמות חריגים מופחתים באופן משמעותי על הטיפול באופן תלוי ריכוז המדגים כי מעכבי קינאז ניתן ליישם לנרמל איתות חריג בתאי CLL. לפני שתנסה לבצע הליך זה חשוב לזכור לסמן רייגנטים ונוגדנים, ולוודא כי סמני פני השטח שנבחרו תואמים לריגנטים של קיבעון וחלחלה. התאים צריכים להיות בהשעיה לניתוח זרחן, עדיין הפרוטוקול יכול להיות מותאם לתאים חריגים או רקמות בעקבות הליכים כדי להשיג השעיה של תא יחיד, כגון טריפזינציה שלמה.