בדיקת אלקטרוכימילומינסנציה לכימות רמות חלבון המטרה בליזט במוח

לזיהוי כמותי של חלבון ספציפי בליזאט מוח עכבר באמצעות האלקטרוכימילומינסנציה, ECL, בדיקה חיסונית, התחל עם לוחית בדיקה מרובת בארות.

הבארות מורכבות מאלקטרודות עבודה מוליכות ונגד, המשלימות את המעגל החשמלי. שכבה דיאלקטרית מפרידה בין האלקטרודות, ומשפרת את רגישות הבדיקה.

הוסף נוגדנים חד שבטיים ראשוניים של עכבר כנגד חלבון המטרה לבארות. האלקטרודות העובדות, בעלות יכולת קשירה גדולה יותר, מאפשרות לנוגדנים לשתק אותן.

דגירה עם תמיסה המכילה חלבון, נקשרת למשטחי הכריכה הנותרים של הבאר, ומפחיתה את הפרעות הרקע.

הוסף ליזאט שבר גרעיני של מוח העכבר. חלבון המטרה בליזאט נקשר במיוחד לנוגדנים החד-שבטיים.

הוסף נוגדנים רב-שבטיים ללא תווית, המזהים ונקשרים לאפיטופים על החלבון, הקשור לנוגדנים חד-שבטיים ראשוניים על האלקטרודה. הוסף נוגדנים משניים ספציפיים המסומנים בקומפלקס רותניום, הנקשרים לנוגדנים הלא מסומנים. הוסף חוצץ מתאים המכיל פעילי שטח - המספק סביבת ייצור ECL מתאימה - וטריפרופילמין, TPA.

הנח את הצלחת מרובת הבארות במערכת זיהוי ה-ECL. עם הפעלת הפוטנציאל על פני האלקטרודות, קומפלקס הרותניום הקשור לנוגדנים מתחמצן. במקביל, ה-TPA מתחמצן ומאבד באופן ספונטני פרוטון.

רדיקל ה-TPA שנוצר מפחית את קומפלקס הרותניום המחומצן למצבו הנרגש. עם הרפיה למצב הקרקע שלו, קומפלקס הרותניום פולט פוטון שזוהה על ידי גלאי הפוטו.

עוצמת האור הנמדדת מייצגת את ריכוז החלבון הספציפי של הליזאט.

הוציאו את צלחת 96 הבארות מהמקרר והוציאו את נייר הכסף. הסר את תמיסת ציפוי הנוגדנים מהבארות על ידי הזלפה לתוך מיכל פסולת. לאחר מכן, הקש על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל התמיסה שנותרה.

לאחר מכן, הוסף 125 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לכל באר. לאחר מכן, אטמו את הצלחת שוב בנייר כסף. הנח את הצלחת על שייקר מיקרופלייט מסלולי, המוגדר ל-800 סל"ד, ודגר אותה למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.

להפשיר על קרח, בקבוקון אחד של תמיסת מלאי חלבון MeCP2 או TAT-MeCP2, ליזטים למוח עכבר וליזטים HDF. לדלל את תמיסת מלאי החלבון בצינורות נקיים, כמתואר בטבלה 2 של כתב היד.

לאחר מכן, יש לדלל את דגימות הליזאט. עבור ליזטים של מוח העכבר, השתמש ב-1 עד 20 מיקרוגרם לכל 25 מיקרוליטר של מאגר ליזה. עבור ליזאט HDF, הוסף 0.25 עד 1 מיקרוגרם לכל 25 מיקרוליטר של מאגר ליזה.

לאחר שהצלחת בת 96 הבארות הודגרה במשך 90 דקות, הסר את תמיסת החסימה מהבארות על ידי הזלפה לתוך מיכל פסולת. לאחר מכן, הקש על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל התמיסה שנותרה. לאחר מכן, שטפו את הצלחת 3 פעמים עם 150 מיקרוליטר תמיסת כביסה, על ידי הוספת תמיסת הכביסה והסרתה מייד.

הוסף 25 מיקרוליטר של תקנים ודגימות לבארות של צלחת 96 הבארות. אוטמים את הצלחת ומדגרים אותה עוד ארבע שעות בטמפרטורת החדר, עם טלטול קבוע של 800 סל"ד.

הפשירו את נוגדן הזיהוי הלא מסומן, ארנב רב-שבטי אנטי-MeCP2, על קרח. בעזרת תמיסת דילול בדיקה, יש לדלל את הנוגדן ביחס של 1:6000. כאשר צלחת 96 הבארות סיימה לדגור על השייקר, הסר את התקנים והדגימות על ידי הזזת הצלחת למיכל פסולת. לאחר מכן, הקש על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל התמיסה שנותרה.

שוטפים את הצלחת 3 פעמים עם 150 מיקרוליטר תמיסת כביסה על ידי הוספת תמיסת הכביסה והסרתה מיד. הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים לזיהוי ללא תווית לכל באר עם הצנרת הרב-ערוצית. אוטמים את הצלחת ודוגרים אותה למשך שעה בטמפרטורת החדר עם טלטול מתמיד ב 800 סל"ד.

השיגו את הנוגדן המשני הספציפי מהמקרר, והניחו אותו על קרח. יש לדלל את הנוגדן המשני בתמיסה מדללת בדיקה ולערבב בעדינות.

כדי להסיר את נוגדן הזיהוי החופשי ללא תווית מצלחת 96 הבארות, החלק אותו לתוך מיכל הפסולת ולאחר מכן, הקש על הצלחת על מגבת נייר. לאחר שטיפת הצלחת 3 פעמים, כפי שתואר קודם לכן, הוסף 25 מיקרוליטר נוגדן משני לכל באר עם הפיפטטור הרב-ערוצי. אוטמים את הצלחת ודוגרים אותה למשך שעה בטמפרטורת החדר עם טלטול מתמיד ב 800 סל"ד.

הסר את הנוגדן המשני החופשי על ידי הזלפה שלו לתוך מיכל הפסולת, והקשה על הצלחת על מגבת נייר, ולאחר מכן, שטוף את הצלחת שלוש פעמים כפי שתואר קודם לכן.

לכל באר של הצלחת, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר קריאת זהב מבוסס טריס 1X עם חומר פעילי שטח, המכיל טריפרופילאמין כמגיב משותף לייצור אור.

כדי להימנע מיצירת בועות אוויר, השתמש בטכניקות פיפטינג הפוכות. הנח את צלחת 96 הבארות על פלטפורמת המיקרופלייט עם מערכת זיהוי אלקטרוכימילומינסנציה.

באמצעות מצלמת ה-CCD המובנית, התחל מיד ללכוד נתונים. רשום את ספירת האותות התואמות ליחידות אור יחסיות ועומדות ביחס ישר לעוצמת האור.