טיהור זיקה דו-מולקולרית לבידוד שני חלבונים המקיימים אינטראקציה

כדי לזהות ולבודד זוג חלבונים אינטראקטיביים ספציפיים באמצעות טיהור זיקה להשלמה דו-מולקולרית, הוסף זוג תערובת פלסמידים-חומר טרנספקציה להשלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית לתוך צלחת תרבית המכילה תאי יונקים.

פלסמיד אחד מקודד חלבון אינטראקטיבי אחד - חלבון הפיתיון - המותך לשבר חלבון פלואורסצנטי מדווח. הפלסמיד השני מקודד לחלבון הקישור השני - חלבון הטרף - שהתמזג למקטע המשלים של החלבון הפלואורסצנטי.

דגירה. סוכן הטרנספקציה מקל על קליטת תאי פלסמיד. תאים שעברו טרנספטציה מוצלחת מבטאים חלבונים מקומיים בקרום התא.

האינטראקציות של חלבוני הפיתיון והטרף מקרבות את שברי החלבון הפלואורסצנטי. זה גורם לשברים להתמזג ולהתקפל מחדש, וליצור את החלבון הפלואורסצנטי הפונקציונלי, שניתן לדמיין את הקרינה שלו במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

החלף את המדיה במאגר ליזה שאינו מכיל חומר ניקוי יוני כדי לשבש את ממברנות התא, ולשחרר את חלבוני ההיתוך. אוספים את הליזאט של התא בצינור. צנטריפוגה.

העבירו את הסופרנטנט המכיל חלבון היתוך לתוך צינור טרי. הוסף חרוזי אגרוז מצומדים עם נוגדן חד-תחום המכוון לחלבון פלואורסצנטי, ננו-גוף, המזהה ונקשר לאפיטופ תלת מימדי על החלבון הפלואורסצנטי המקופל.

צנטריפוגה. השעו מחדש את חרוזי האגרוז הקשורים לחלבון היתוך במאגר. מחממים כדי לנתק חלבוני היתוך מחרוזי האגרוז. בצע SDS-PAGE כדי להפריד חלבונים בודדים, ולאחר מכן הכתמה מערבית עם נוגדנים ספציפיים לשברי החלבון הפלואורסצנטי.

רק חלבונים המתויגים באינטראקציה עם שברי פלואורסצנט מזוהים, המאשרים את בידודם.

ראשית, תאי HEK293T זרעים בצלחות של 10 סנטימטר המכילות 10 מיליליטר DMEM. לאחר מכן, יש לדלל 2.5 מיקרוגרם מכל וקטור השלמה פלואורסצנטי דו-מולקולרי ב-500 מיקרוליטר של מאגר טרנספקציה.

מוסיפים 10 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה, ומערבלים את התערובת למשך 10 שניות. לאחר מכן, צנטריפוגה קצרה של הדגימות, ודגר אותן בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף את תערובת טרנספקציית ה-DNA טיפה למנה. לאחר מכן, דגרו על הדגימות למשך 8 עד 24 שעות.

הכן מאגר ליזה של תאים ומאגר ליזה של תאים משלים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS קר כקרח פעמיים. שאפו את ה-PBS, והוסיפו 1 מיליליטר של מאגר ליזה תאים בתוספת קר כקרח.

לאחר מכן, הניחו את המנה על קרח, ודגרו במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש במגרד תאים כדי להסיר את התאים ולהעביר אותם לצינור מיקרו-צנטריפוגה מקורר. צנטריפוגה של הצינור בכוח הכבידה פי 18,000 למשך חמש דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את הפסולת התאית. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט השקוף לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי.

שוטפים נפח מתאים של חרוזי אגרוז במיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן, צנטריפוגה את החרוזים בכוח הכבידה פי 300, והסר בזהירות את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטר של חרוזי אגרוז לכל דגימה, ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עם סיבוב מקצה לקצה.

צנטריפוגה את החרוזים בכוח הכבידה פי 300, ושטוף אותם במאגר ליזה של תאים שלוש פעמים. לאחר מכן, השעו מחדש את החרוזים השטופים ב-50 מיקרוליטר של מאגר דגימה מדולל. לבסוף, מחממים את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך שתיים-שלוש דקות.