טיהור זיקה דו-מולקולרית לבידוד שני חלבונים המקיימים אינטראקציה
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:29 דק׳ • July 8th, 2025
כדי לזהות ולבודד זוג חלבונים אינטראקטיביים ספציפיים באמצעות טיהור זיקה להשלמה דו-מולקולרית, הוסף זוג תערובת פלסמידים-חומר טרנספקציה להשלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית לתוך צלחת תרבית המכילה תאי יונקים.
פלסמיד אחד מקודד חלבון אינטראקטיבי אחד - חלבון הפיתיון - המותך לשבר חלבון פלואורסצנטי מדווח. הפלסמיד השני מקודד לחלבון הקישור השני - חלבון הטרף - שהתמזג למקטע המשלים של החלבון הפלואורסצנטי.
דגירה. סוכן הטרנספקציה מקל על קליטת תאי פלסמיד. תאים שעברו טרנספטציה מוצלחת מבטאים חלבונים מקומיים בקרום התא.
האינטראקציות של חלבוני הפיתיון והטרף מקרבות את שברי החלבון הפלואורסצנטי. זה גורם לשברים להתמזג ולהתקפל מחדש, וליצור את החלבון הפלואורסצנטי הפונקציונלי, שניתן לדמיין את הקרינה שלו במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
החלף את המדיה במאגר ליזה שאינו מכיל חומר ניקוי יוני כדי לשבש את ממברנות התא, ולשחרר את חלבוני ההיתוך. אוספים את הליזאט של התא בצינור. צנטריפוגה.
העבירו את הסופרנטנט המכיל חלבון היתוך לתוך צינור טרי. הוסף חרוזי אגרוז מצומדים עם נוגדן חד-תחום המכוון לחלבון פלואורסצנטי, ננו-גוף, המזהה ונקשר לאפיטופ תלת מימדי על החלבון הפלואורסצנטי המקופל.
צנטריפוגה. השעו מחדש את חרוזי האגרוז הקשורים לחלבון היתוך במאגר. מחממים כדי לנתק חלבוני היתוך מחרוזי האגרוז. בצע SDS-PAGE כדי להפריד חלבונים בודדים, ולאחר מכן
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים