ויזואליזציה של דנ"א רקומביננטי ו קומפלקסים חלבונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי
18 ביולי 2011
כוח הקשה במצב מיקרוסקופ אטומי (AFM) שיטת הדמיה של פלסמיד דנ"א, חלבונים cytoplasmic, ו-DNA-חלבון מתחמי מתואר. השיטה כוללת גישות חלופיות להכנת דגימות הדמיה AFM בעקבות מניפולציה ביוכימית. ה-DNA המכיל אזורים ספציפיים אינטראקציה חלבון שנצפה כמעט פיזיולוגי התנאים חיץ.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות ביומולקולות כגון DNA וחלבונים במאגרים מימיים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. זה מושג על ידי הכנת ביומולקולות להדמיה. לאחר מכן, מיקרוסקופ הכוח האטומי מוגדר וממוקם גשושית שלוחה FM.
לאחר מכן משטח הדגימה והביו-מולקולות המעניינות מצולמים ומנותחים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות גודל כללי, כמות וארגון של DNA וחלבונים וקומפלקסים ביומולקולריים הטרוגניים בתנאי חוצץ באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המלווה המולקולרי, כגון מהי גיאומטריית ה-STO של צ'פרונים ו-cos chaperones מורכבים ללקוח.
הדגמה חזותית של חלבון של שיטה זו מועילה מכיוון ששלבי הכנת בדיקת מנוף A FM וקנט עשויים להיות קשים ללמוד מהוראות מודפסות בעיקר בגלל המורכבויות הקשורות למניפולציה הפיזית שלהם. מדגימים את ההליך מורגן שאנון וג'ון גרץ, שני סטודנטים מהמעבדה שלי כדי להתחיל לבודד את החלבון או מולקולות ה-DNA להדמיה ולהשעות אותם במאגר מימי. לאחר אישור טוהר הדגימה, דגרו אותה במאגר ספיגת FM על קרח כדי לקדם את היצמדות הדגימה לנציץ.
עבור דגימות חלבון, השתמש במאגר ערימות של 10 מילי-מולריות. ועבור מאגר המכיל מגנזיום DNAA המורכב מ-10 מילי-מולארי טריס, pH 7.5 10 מילי-מולרי נתרן כלורי, שני מילי-מולרי מגנזיום כלוריד מתאים להרכבת בדיקת A FM. הנח את מחזיק בדיקת התא הנוזלי על תחנת העגינה להתקנת השלוחה המתאימה.
אתר את השלוחה העבה הארוכה של בדיקת ידית הניטריד החדה שתשמש להדמיה. העבירו אותו בזהירות למחזיק בדיקת התא הנוזלי, וודאו שהקצה יישאר זקוף. לאחר מכן, בדוק את השלוחה תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהיא שלמה ויושבת כהלכה במחזיק בדיקת התא הנוזלי.
לאחר מכן הסר בזהירות את ראש ה-FM ממכלול זנב היונים של המכשיר על ידי הידוק הראש העצבי clamp בורג. הפוך את ראש ה-FM ודחף בחוזקה את מחזיק בדיקת התא הנוזלי על ארבעת הפינים בבסיס ראש ה-FM. לבסוף, החזר בזהירות את ראש ה-FM למכשיר הרכבת הזנב.
כדי להכין עוד יותר את ה-FM לפני הדמיה דגימות, הזז את הכפתורים של מיקרוסקופ האור המובנה כדי לאתר את קצה השלוחה, כוונן את החצים למעלה ולמטה של בקר האופטיקה בתוכנה כדי להביא את קצה השלוחה למיקוד. השתמש בכפתורי כוונון הלייזר כדי ליישר את הלייזר לקצה השלוחה. זהו אחד השלבים המאתגרים ביותר מבחינה טכנית בפרוטוקול המיקום נעשה באופן ידני ודורש כוונון מדויק של הכפתור.
ניטור קפדני של הלייזר בנקודת ההשתקפות ובנקודת ההארה מגדיל את הסבירות ליישור מוצלח. לאחר מכן, כוונן את כפתורי גלאי הצילום בראש ה-FM כדי למרכז את גלאי הצילום. הנח יריעה טרייה של MICA המחוברת למתכת דיסק דגימת FM על מחזיק הדגימה הממוגנט על גבי לוחית מחזיק ה- FM.
סובב את לוחית מחזיק ה-FM כך שדיסק הדגימה ימוקם להדמיה הראשונית. השתמש בבקרת משטח המיקוד של תוכנת המכשיר כדי להזיז את ראש ה-FM כלפי מטה לכיוון פני השטח של דיסק הדגימה של MICA. עד שתכונות ברורות על משטח ה-MICA או השתקפות הקצה יהיו ממוקדות, בחר את סמל המנגינה מתוכנת המכשירים וכוון את השלוחה
תדירות התהודה של בדיקות MSNL או SNL מומלצות היא 20 עד 60 קילו-הרץ. בחר הסטה של 5%peak כדי לדמות את דגימת MICA. ראשית, חבר את הגשושית על משטח ה-MICA הגדר את גודל הסריקה הראשוני ל-10 מיקרומטר ואת קצב הסריקה להרץ אחד.
צלם תמונות סריקה מלאות של שדה 10 מיקרומטר. לאחר מכן הקטן את גודל הסריקה לחמישה מיקרומטר אחד ו-0.5 מיקרומטר וצלם תמונות מלאות של כל שדה. נתק את הגשושית על ידי לחיצה אחת על סמל הניתוק בתוכנת המכשיר.
כדי לדמות ביומולקולות מעניינות, מערבבים חמישה מיקרוליטרים מהדגימה המוכנה עם 45 מיקרוליטר של מאגר ספיגה טרי. הוסף בזהירות 50 מיקרוליטר של 0.5 מיקרוגרם לביו-מולקולה המכילה מיליליטר ישירות על פני ה-MICUs. עצור למשך חמש דקות כדי לאפשר לביו-מולקולות בדגימה להיצמד למשטח מיכה.
לאחר מכן פיפטה 50 עד 100 מיקרוליטר נוספים של מאגר ספיגה לתוך מחזיק בדיקת התא הנוזלי. היזהר לא לגעת בבדיקה, בראש FM או ב-MICA עם קצה הפיפטה, כוונן מחדש את גלאי הצילום ויישר מחדש את הלייזר לשלוחה לפי הצורך. לאחר מכן השתמש בתוכנת המכשיר כדי להפעיל מחדש את הגשושית.
הגדל את גודל הסריקה כדי לזהות אזורי עניין. לאחר השלמת ההדמיה, בחר בסמל המשיכה בתוכנת המכשיר מספר פעמים כדי לנתק את הגשושית. לבסוף, השתמש במים מזוקקים כדי לשטוף היטב את מחזיק בדיקת התא הנוזלי ואת דיסק הדגימה.
ואז נסה את זה עם אוויר דחוס. דוגמה לתמונת A FM מוצגת כאן. מצע הנציץ מספק משטח שטוח מולקולרית שעליו יכולים לספוג DNA וחלבון.
הדמיית MICA לפני דגימות ביומולקולות מספקת בקרה שלילית והערכה של רעש הדמיה. זה גם מספק רמת ביטחון שהשלוחה מכוונת כראוי והדמיית הדגימה שלאחר מכן תהיה מוצלחת. DNA פלזמה דו-גדילי שככל הנראה סופר מפותל מזוהה בקלות על ידי המראה הא-סימטרי שלו והשקעתו האחידה על מצע מיכה שלא היה ראוי לציון בעבר.
קומפלקסים של חלבונים בגודל חלקיקים בדידים ניתנים גם הם להבחנה ייחודית ממצע מיכה. הבדלי גודל החלקיקים מצביעים על הטרוגניות של הדגימה ויכולים להיות שימושיים לקירוב חלבון, גיאומטריה סטואית מורכבת או פעילות ביוכימית. הצורה האלכסונית הכללית והכיוון העקבי של חלקיקי החלבון נצפו.
הנה חפץ הדמיה שכן חלבונים צפויים להיות מכוונים על מצע מיכה בצורה אקראית. סיבות אפשריות לחפץ הנצפה או חריגה בקצה הפיזי או הדמיית FM בשני מהירים של קצב סריקה בעוד שפיתול הקצה מונע חישובי מדידת אורך מוחלט במדידת גובה ציר x ו-Y או מדידות ציר Z ו-X ו-Y יחסיות עשויות להיות שימושיות בכל זאת להערכת התכונות הביופיזיקליות של הביו-מולקולות המצולמות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכוון במדויק את השלוחה וליישר את גלאי הצילום בעקבות הליך FM בסיסי זה.
ניתן להוסיף שלבים אחרים, כולל שימוש בתא נוזל חילופי חיץ, על מנת לענות על שאלות נוספות כגון היכולת של מלווים מולקולריים להשפיע על שחרור קולטני סטרואידים ממרכיבי תגובת ה-DNA שלהם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין טוב יותר כיצד לדמות חלבוני DNA וקומפלקסים ביו-מולקולריים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי בתנאי חוצץ.
סקירה
מאמר זה מתאר שיטת מיקרוסקופיה בכוח אטומי (AFM) באופן הקשה לדמיית ביו-מולקולות כגון DNA פלסמיד וחלבונים בתנאי חיץ קרובים לפיזיולוגיים. השיטה כוללת טכניקות הכנת דגימות המעלימות את איכות ודיוק ההדמיה.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביאופיזיקה
- ביוכימיה
רקע
- מיקרוסקופיה בכוח אטומי (AFM) היא כלי רב עוצמה להדמיית ביו-מולקולות.
- הבנת האינטראקציות בין DNA וחלבונים חיונית בביולוגיה מולקולרית.
- הכנת דגימות חיונית להדמיה מוצלחת של AFM.
- הדמיה בזמן אמת בתנאי חיץ יכולה לספק תובנות לגבי מבנים של ביו-מולקולות.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה להדמיית DNA וחלבונים בחיץ מימי באמצעות AFM.
- להדמית מתחמי DNA-חלבון וארגונם.
- להקל על הבנת אינטראקציות של צ'אפרונות מולקולריים.
שיטות בשימוש
- הכנת ביו-מולקולות בחיץ מתאים.
- הגדרה וכיול של מכשיר ה-AFM.
- הדמיה של דגימות על מצע מיקה.
- ניתוח של גודל, כמות והארגון של ביו-מולקולות.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של DNA דו-גדילי פלסמיד ומתחמי חלבון.
- זיהוי של הטרוגניות הדגימה באמצעות הבדלי גודל החלקיקים.
- דמיית הארגון של DNA וחלבונים על פני המיקה.
- הדגמה של יעילות השיטה בהדמיה בזמן אמת.
מסקנות
- שיטת ה-AFM מספקת תובנות חשובות לגבי אינטראקציות ביו-מולקולריות.
- הכנת הדגימות היא קריטית לתוצאות הדמיה באיכות גבוהה.
- טכניקה זו יכולה לקדם מחקרים בתחום חקר הצ'אפרונות המולקולריים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy (AFM) enables direct visualization of recombinant DNA, proteins, and their complexes in near-physiologic buffer conditions, supporting early-stage mechanistic de-risking and target validation. This capability provides biopharma R&D teams with high-resolution, label-free structural insights critical for understanding biomolecular interactions and complex assembly. Integrating AFM imaging into discovery workflows enhances predictive confidence and informs portfolio triage decisions at key inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Direct visualization of DNA-protein and protein-protein complexes clarifies molecular assembly and interaction specificity.
- AFM imaging supports functional target validation by revealing complex stoichiometry and heterogeneity.
- Structural mapping of biomolecular complexes reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Label-free imaging in buffered conditions preserves native conformations for accurate hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- AFM provides quantitative topographical data to assess sample homogeneity and complex formation.
- Imaging outputs enable standardization of biomolecule preparations for downstream assays.
- Real-time visualization supports reproducibility and assay readiness for screening campaigns.
- Platform adaptability allows reuse across diverse protein and nucleic acid targets.
Translational & Preclinical Research
- AFM imaging informs preclinical model selection by characterizing disease-relevant biomolecular assemblies.
- Structural insights support translational biomarker alignment when complex formation is linked to functional outcomes.
- Quantitative measurements guide risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
- Mechanistic de-risking is enabled by direct observation of molecular interactions under physiologic conditions.
Pipeline & Workflow Integration
AFM imaging fits within the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, providing a reusable analytical capability for structural interrogation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven mapping of protein-DNA and protein-protein interactions at the single-molecule level.
- Screening: Supplies quantitative, reproducible imaging outputs to benchmark assay performance and sample quality.
- Analytics: Delivers topographical and dimensional data for comparative analysis of biomolecular complexes.
- Translational Research: Supports continuity by linking structural features to functional and disease-relevant endpoints.
- Enterprise Reuse: Adaptable to a wide range of biomolecules, supporting multiple programs and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by clarifying complex assembly.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, cantilever tuning, and sample preparation.
- Demands access to high-resolution AFM instrumentation and analytical software.
- Cross-team standardization is essential for reproducible imaging and data interpretation.
- Buffer composition and substrate selection must be optimized for each biomolecule type.
- Tip convolution and scan rate limitations may affect absolute dimensional measurements.
