טכנולוגיית מיקרו-מערך פפטידי לפרופיל ספציפיות של נוגדנים

קח שקופית מיקרו-מערך המכילה פפטידים של היסטון עם שינויים לאחר תרגום מטרה ולא מטרה או PTMs.

הפפטידים משותקים באמצעות ביוטין מצומד בנקודות ספציפיות בשקופית הזכוכית המתפקדת על ידי סטרפטווידין.

הכתמים מכילים גם פלואורופור ירוק מצומד ביוטין, המקל על זיהוי הכתמים.

הציגו חוצץ חוסם, המונע אינטראקציה לא ספציפית של נוגדנים.

הסר את המאגר והצנטריפוגה לייבוש השקופית.

בתוך חותם שעווה, תחם את המערך בשעווה.

איזון המערך עם מאגר הכלאה.

דגירה עם הנוגדנים העיקריים הספציפיים ל-PTM מטרה.

הכנס נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור אדומים הנקשרים לנוגדנים הראשוניים.

הסר נוגדנים וצנטריפוגה לא קשורים לייבוש השקופית.

דמיין את השקופית באמצעות סורק מיקרו-מערך. הקרינה הירוקה עוזרת לזהות את הכתמים, בעוד שהפלואורסצנציה האדומה מצביעה על אינטראקציה בין PTM לנוגדנים, ומדגימה את ספציפיות הנוגדנים.

זיהוי ה-PTM המטרה מדגים ספציפיות נוגדנים, בעוד שזיהוי PTMs שאינם מטרה מעיד על תגובתיות צולבת של נוגדנים.

בהנחיית מפת לוחית המקור, טען 1 עד 2 מיקרוליטר מכל תכונת פפטיד לבארות המיועדות של לוח אחד או יותר בנפח קטן של 384 בארות. לדלל כל תכונה פי עשרה עם מאגר הדפסה של מיקרו-מערך חלבון פי 1, בתוספת אלבומין סרום בקר של 1%, ו-5 מיקרוגרם למיקרוליטר ביוטין עם תווית פלואורסצאין. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצלחות ב 500 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. לאחר מכן, רוקן את מיכל הפסולת של מדפסת המיקרו-מערך. מלאו את תמיסת הכביסה במיכלי מכשיר אדים במים מזוקקים סטריליים. הזן את פרמטרי שקופיות המערך בתוכנת מדפסת המיקרו-מערך.

הגדר את הליך הכביסה לשטיפה של שנייה אחת עם טבילה אחת, לאחר הכביסה לטבול מחדש את הסיכות חמש פעמים, ואת הלחות ל -60%. לאחר מכן, הכנס שקופיות זכוכית מצופות סטרפטווידין לתוך פלטות המצע. טען את הפלטות לתוך מעלית משטח ההדפסה. הכנס את לוחות המקור למחזיקי הצלחות, וטען את המחזיקים למעלית לוחית המקור. הפעל את תהליך ההדפסה.

לאחר מכן, הסר את לוחות המצע מהמכשיר. חסום את השקופיות המודפסות עם מאגר חוסם מיקרו-מערך חלבון 1x למשך 30 דקות תוך כדי ניעור. לאחר מכן, שטפו את השקופיות במי מלח עם pH 7.6 פוספט בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. חזור על הכביסה עם מנה טרייה של PBS. יבש את השקופיות באמצעות צנטריפוגה למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, מחממים מראש מדפיס שעווה מיקרו-מערך בחום של 85 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, או עד שהשעווה נמסה. לאחר מכן, הכנס שקופית, עם הצד המודפס כלפי מטה, לתוך המחזיק, ויישר את המחזיק עם תבנית ההדפסה. הביאו את התבנית למגע עם המגלשה, והחזיקו למשך שתי שניות. לאחר מכן, הסר במהירות את השקופית מהמחזיק ובדוק את גבולות השעווה כדי לוודא שהמערכים סגורים כהלכה. אחסן את המגלשות המחולקות ב -4 מעלות צלזיוס באזור יבש וחשוך.

כדי להתחיל בהליך ההכלאה, הניחו שקופית מערך מחולקת בצלחת פלסטיק, וכסו את השקופית במאגר הכלאה. אזנו את המגלשה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תוך כדי ניעור במהירות נמוכה. יבש את השקופית על ידי סיבוב בצנטריפוגת שקופיות מיקרו-מערך בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 5 מיקרוליטר מכל תמיסת נוגדן PTM של היסטון לשתי בארות לפחות של המערך, ודגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר הדגירה, יש להסיר את תמיסת הנוגדנים ולשטוף את המערך ב-PBS קר שלוש פעמים, למשך 5 דקות כל אחת, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דגרו את המערך בתמיסת נוגדנים משנית מצומדת בצבע פלואורסצנטי למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, בהיעדר אור. שטפו את השקופית שלוש פעמים עם PBS קר כמו קודם.

טובלים את המערך בטמפרטורת החדר 0.1x PBS כדי להסיר עודפי מלחים, ומייבשים את השקופית על ידי צנטריפוגה קצרה בטמפרטורת החדר. דמיין את השקופית עם סורק מיקרו-מערך ברזולוציה של 25 מיקרון לפחות.