איתור חלבוני פריון חריגים ברקמת המוח באמצעות אימונוהיסטוכימיה

קח שקופית עם קטע קבוע במוח של יונקים המציג אגרגטים של חלבון פריון לא מקופל.

טפל בקטע בחומצה פורמית כדי להפחית את ההדבקה של אגרגטים פריונים.

טפל עם חיץ חומצי בתוך תא לחץ מיובש. חום גבוה ו-pH חומצי שוברים קישורים צולבים של חלבון המושרה על ידי קיבוע, וחושפים את האפיטופים האנטיגניים.

טבלו במי חמצן כדי לנטרל פרוקסידאז אנדוגני, ולמנוע צביעה לא רצויה ברקע.

הניחו את השקופית בצלחת כיסוי והוסיפו חיץ לשמירה על לחות הרקמות.

הציגו תמיסת חסימה, המונעת קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

הוסף נוגדן ראשוני ספציפי לאגרגטים של פריון.

הסר את מולקולות הנוגדנים הלא קשורות. הכנס נוגדן משני ביוטינילי שנקשר לנוגדנים הראשוניים.

הסר את מולקולות הנוגדנים הלא קשורות. הוסף אנזים פרוקסידאז ביוטיניל עם קומפלקס עם אבידין שנקשר לביוטין על הנוגדן המשני.

הוסף מצע כרומוגני, אותו הפרוקסידאז מתחמצן למוצר צבעוני.

בעזרת מיקרוסקופ, התבונן באגרגטים המוכתמים.

טבלו בזהירות את חלקי הרקמה בחומצה פורמית 98% בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שטפו את החלקים במי ברז למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטפו פעמיים במים מזוקקים. השתמש במיכל צביעה מנירוסטה בתא הלחץ המלא ב-500 מיליליטר מים מזוקקים כדי לטפל מראש במאגר ציטראט של 10 מילי-מולרי ב-98 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

למטרות בקרת איכות, הנח קטע של סרט חיווי חיטוי דבק על הסל כדי לפקח על הטמפרטורה והלחץ. לאחר שהאזעקה מציינת שהציוד השיג את זמן התוכנית והטמפרטורה, טבלו את הסל במגלשות. לאחר מכן, התחל את התוכנית בתא הלחץ כדי להגדיר את הנקודה השנייה, ורשום את הלחץ הראשוני והסופי של תוכנית זו.

להשבתת פרוקסידאז אנדוגני, טבלו את סל השקופיות המכיל את חלקי הדגימה באמבט של 3% מי חמצן במתנול למשך 30 דקות. שוטפים את החלקים תחת מים זורמים למשך 5 דקות. לאחר הניקוז, טבלו את החלקים במי מלח עם טריס למשך 5 דקות נוספות. לזיהוי חיסוני, הנח כל שקופית על מחזיק לוחית כיסוי זמין מסחרית שהורטב מראש במי מלח עם Tris-buffering.

כאשר צד הרקמה פונה למחזיק, וקצוות ההחלקה חופפים לשתי הנקודות התחתונות של המחזיק, הקפד להימנע מבועות אוויר. החזק את מכלול מחזיק השקופיות בין האגודל לאצבע. שמור אצבע אחת על גבי שקופית הדגימה והשנייה בתחתית המחזיק. לאחר מכן הנח את המכלול בגלריה של המערכת.

כדי להבטיח שהסט מורכב היטב, מלאו את הבאר בין שקופית הדגימה למחזיק במי מלח עם טריס, מבלי לעלות על גדותיו. מנקודה זו, ודא שיש לשמור על כ-80 מיקרוליטר של מי מלח עם טריס בין המחזיק לשקופית. אל תאפשר לחלקים להתייבש.

הפחת את צביעת הרקע לפני הטיפול בנוגדנים ראשוניים על ידי דגירה מוקדמת של דגימות השקופיות למשך 30 דקות עם 20% סרום תקין מאותו מין כמו מארח הנוגדנים המשני בתמיסת מלח עם Tris-buffered. מבלי לשטוף את החלקים, יש למרוח 200 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים העיקרית ישירות לכל באר של ערכת מחזיקי השקופיות, ולדגור למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.

כדי לשטוף את החלקים, מלאו את הבארות במי מלח עם טריס, והמתינו 5 דקות. חזור על הכביסה פעמיים. לאחר מכן, יש לדלל את הנוגדן המשני הביוטינילי בריכוז של 1 עד 200 בתמיסת מלח עם טריס עם סרום סוסים של 10%.

תקן את הנפח הנדרש, תלוי במספר החלקים שיש לטפל בהם. מרחו 200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית על כל באר של ערכת מחזיקי השקופיות. לאחר 30 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, חזור על שטיפת מי המלח עם Tris-buffering.

לדגירה עם פרוקסידאז קומפלקס אבידין-ביוטין, הכינו את המגיב 30 דקות לפני השימוש. ומרחו 200 מיקרוליטר מהתמיסה בכל באר של מחזיק צלחת השקופיות. לאחר שתסיים, דגרו את מחזיק הצלחת המוגדר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.