Name: הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: למדו הכנת סינאפטונוירוזומים פעילים מתרבולת עכבר באמצעות מדרגת צפיפות Percoll-סוכרוז. השיטה מפחיתה נזק מכני ומאפשרת חקר תרגום חלבונים בסינפסות ביעילות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות BK אוגוסט מאוניברסיטת מתקן אלקטרונים וויסקונסין מיקרוסקופ עבור במיקרוסקופ אלקטרונים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים R01-DA026067 ו-P30 HD03352 (עד JSM).

<ol><li>Westmark, C. J., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+mediates+mGluR5-dependent+translation+of+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein.</a> PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).</li>
<li>Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pin1+and+PKMzeta+sequentially+control+dendritic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis.</a> Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).</li>
<li>Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+isolation+of+synaptosomes+directly+from+an+S1+fraction%3A+Homogeneity+and+morphology+of+subcellular+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions.</a> Brain Res. 441, 59-71 (1988).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li>
<li>Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+a+filtered+synaptoneurosome+preparation+from+guinea+pig+cerebral+cortex%3A+cyclic+adenosine+3%27%3A5%27-monophosphate-generating+systems%2C+receptors%2C+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes.</a> J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).</li>
<li>Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+pre-embedding+double+immunogold-silver+labeling+at+the+ultrastructural+level%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).</li>
<li>Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+translation%3A+stepping+out+of+the+postsynaptic+shadow%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow.</a> Front. Neural Circuits. 3, (2009).</li>
<li>Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whereas+short-term+facilitation+is+presynaptic%2C+intermediate-term+facilitation+involves+both+presynaptic+and+postsynaptic+protein+kinases+and+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis.</a> Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).</li>
<li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49, 349-356 (2006).</li>
<li>Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+synthesis+of+CREB+in+a+presynaptic+neuron+is+required+for+synaptic+enhancement+involved+in+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation.</a> J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).</li>
<li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translational+control+in+dendrites+and+its+role+in+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity.</a> J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).</li>
<li>Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+rat+brain+postsynaptic+density%3A+implications+of+the+diverse+protein+functional+groups+for+the+integration+of+synaptic+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology.</a> J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).</li>
<li>Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+proteomic+analysis+of+rat+forebrain+postsynaptic+density+fractions+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).</li>
<li>Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation+triggers+production+and+release+of+Alzheimer%27s+amyloid+%CE%B242+from+isolated+intact+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).</li>
<li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+ion+stimulation+triggers+protein+translation+in+synaptoneurosomal+poiyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes.</a> Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).</li>
<li>Billard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing%2C+hippocampal+synaptic+activity+and+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22Magnes+Res%22%5BJournal%5D)">Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium.</a> Magnes Res. 19, 199-215 (2006).</li>
<li>Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neuronal+excitability%2C+synaptic+plasticity%2C+and+learning+in+aged+Kvbeta1.1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice.</a> Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).</li>
<li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+Age-Related+Alterations+in+Synaptic+Plasticity+by+Blockade+of+L-Type+Ca21+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels.</a> J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).</li>
<li>Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+kainate+receptor+agonist+ATPA+on+glutamatergic+synaptic+transmission+and+plasticity+during+early+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharm%22%5BJournal%5D)">Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development.</a> Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).</li>
<li>Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+experience-dependent+expression+of+synaptic+NMDA+receptors+in+visual+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo.</a> Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).</li>
<li>Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+control+of+proteins+synthesis+at+developing+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses.</a> Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).</li>
<li>Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+synaptoneurosomes+and+postsynaptic+densities+from+adult+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).</li>
<li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptors+trigger+postsynaptic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).</li>
<li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+nerve+endings+from+brain%3A+An+electron+microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J. Anat. 96, 79-88 (1962).</li>
<li>Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+Presynaptic+and+Postsynaptic+Markers+by+Size-Based+Gating+Analysis+of+Synaptosome+Preparations+From+Rat+and+Human+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex.</a> Cytometry A. 60, 90-96 (2004).</li>
<li>Hajós, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+preparation+of+synaptosomal+fractions+in+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity.</a> Brain Res. 93, 485-489 (1975).</li>
<li>Bai, F., Witzmann, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptosome+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Synaptosome Proteomics.</a> Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).</li>
<li>Rao, A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+protein+constituents+of+postsynaptic+membrane+specializations+are+locally+synthesized%3A+analysis+of+proteins+synthesized+within+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes.</a> J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).</li>
<li>Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPertoft%2C+H+%22Methods+of+Cell+Separation%22">Methods of Cell Separation</a>. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).</li>
<li>Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+affinity+uptake+of+L-glutamate+and+%26gamma%3B-aminobutyric+acid+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci%22%5BJournal%5D)">High affinity uptake of L-glutamate and &gamma;-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster.</a> J. Biosci. 11, 119-135 (1987).</li>
<li>Munteanu, L. S., Dinu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+granulocytes+from+whole+human+blood+by+centrifugation.+Practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Romanian+J.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints.</a> Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).</li>
<li>Cell separation composition, kit and method. US patent. , 019713 (1997).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הכנה רציפה Percoll-סוכרוז שיפוע המתוארים כאן היא שיטה מהירה, אמינה לבודד SNS פעיל, אשר ניתן להשתמש במגוון של ניסויים בשידור סינפטי. שיטה זו שיפוע, אשר מבוססת על שיטה שפותחה על ידי Dunkley et al. 3,4 הוא המוח subcellular חלוקה הליך המבודדת הן טרום postsynaptic קרום הנגזרות שלפוחית ​​הקשורים זה לזה. ללא טיהור נוסף SNS אלה עולים בקנה אחד עם מגוון רחב של טכניקות הביולוגיה המולקולרית, כולל immunoprecipitation, המערבי סופג, cytometry זרימה, ניטור דה נובו סינתזת החלבו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> מיקרו Assay BCA חלבון Kit </td><td> לנקב </td><td> 23235 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> דיג </td><td> C79-500 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 גז </td><td> Airgas (UW-MDS) </td><td> תקליטור 50 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> RPI </td><td> E57020 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH </td><td> דיג </td><td> A407SK-4 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> דיג </td><td> A142-212 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> דיג </td><td> P285-500 </td><td></td></tr><tr><td> PierceSDS-PAGE Prep ערכת דוגמאות </td><td> לנקב </td><td> 89888 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> RPI </td><td> S23020 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> דיג </td><td> BP328-500 </td><td></td></tr><tr><td> Na Pho 2 4 </td><td> דיג </td><td> S381-500 </td><td></td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> RPI </td><td> S24060 </td><td></td></tr><tr><td> מאגר טריס </td><td> RPI </td><td> T60040 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrodotoxin </td><td> סיגמא </td><td> T5651 </td><td></td></tr><tr><td> לייבל Pro Express Mix S35 תג קל </td><td> פרקין אלמר </td><td> NEG772 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th> ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> Dissection כלים </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dounce homogenizer, 7 מ&quot;ל (מגיע עם זכוכית two pestles שכותרתו &quot;A&quot; ו - &quot;B&quot;) </td><td> ויטון </td><td></td><td></td></tr><tr><td> P1000 Gilson Pipetman </td><td> Gilson </td><td> F123602 </td><td></td></tr><tr><td> אלגרה צנטריפוגה 6KR </td><td> Beckman Coulter </td><td> 366830 </td><td></td></tr><tr><td> GH 3.8 הרוטור, הרוטור דלי Swinging </td><td> Beckman Coulter </td><td> 360581 </td><td></td></tr><tr><td> Beckman J2-21 צנטריפוגה </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beckman צינורות עם כובעים </td><td> Beckman </td><td> 355672 </td><td></td></tr><tr><td> מתאמי קירות לבנים </td><td> Beckman </td><td> 342327 </td><td></td></tr><tr><td> מתאמי חומה כחול </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> JA-17 רוטור, קבוע זווית הרוטור </td><td> Beckman </td><td> 369691 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה של נוגדנים המשמשים כתמים המערבי: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם נוגדן </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> מארח המינים </th><th> דילול פקטור </th></tr><tr><td> β-אקטין </td><td> סיגמא </td><td> A5441 </td><td> עכבר </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> סנטה קרוז </td><td> SC-65343 </td><td> עכבר </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> GP73 </td><td> סנטה קרוז </td><td> SC-134509 </td><td> ארנב </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> HSC70 </td><td> סנטה קרוז </td><td> SC-7298 </td><td> עכבר </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Laminβ </td><td> סנטה קרוז </td><td> SC-6261 </td><td> עז </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Prohibitin </td><td> סנטה קרוז </td><td> SC-28259 </td><td> ארנב </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> PSD95 </td><td> Millipore </td><td> MAB1596 </td><td> עכבר </td><td> 5 מיקרוגרם / μL </td></tr><tr><td> SNAP25 </td><td> AbCam </td><td> ab5666-100 </td><td> ארנב </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> Synaptophysin </td><td> Millipore </td><td> MAB368 </td><td> עכבר </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> β-3-טובולין </td><td> סנטה קרוז </td><td> SC-80016 </td><td> עכבר </td><td> 1:200 </td></tr></tbody></table>

הכנת synaptoneurosomes מ - עכבר cortex באמצעות צבע רציפה percoll-סוכרוז צפיפות

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNS) מתקבלים לאחר homogenization ועל חלוקה של קליפת המוח העכבר. הם resealed שלפוחית ​​או מסופי מבודדים להתנתק מסופי האקסון כאשר רקמת קליפת המוח הוא הומוגני. SNS לשמור על המאפיינים טרום postsynaptic, מה שהופך אותם שימושיים בחקר בשידור סינפטי. הם שומרים על מנגנון מולקולרי המשמש איתות עצבי ומסוגלים ספיגת, אחסון, שחרור של נוירוטרנסמיטורים. ההפקה והבידוד של פעיל SNS יכול להיות בעייתי כמו שימוש במדיות Ficoll, אשר ניתן ציטוטוקסיות ודורשים צנטריפוגה המורחבת עקב צפיפות גבוהה, סינון ושיטות צנטריפוגה, אשר עלולה לגרום פעילות נמוכה עקב נזק מכני של SNS. עם זאת, השימוש Percoll-סוכרוז הדרגתיים רציפה צפיפות לבודד SNS מספק שיטה מהירה כדי לייצר תשואות טובות של SNS פעיל translationally. השיטה Percoll-סוכרוז שיפוע הוא מהיר ועדין כפי שהיא מעסיקה התנאים איזוטוני, יש ספינים צנטריפוגה פחות קצר נמנע צעדים צנטריפוגה כי גלולה SNS ולגרום נזק מכני.

שיטה להכין פעיל translationally, synaptoneurosomes שלם (SNS) של קליפת המוח עכבר מתואר. השיטה משתמשת שיפוע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות המאפשרת הכנה מהירה של פעיל SNS.

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

סינפטו-נוירוסומים (SNs) מופקים לאחר הומוגניזציה ופרקציונציה של קליפת המוח של עכברים. אלו הן שלפוחיות שנסגרו מחדש או טרמינלים מבודדים אשר...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין אזורי סינפסה פעילים תרגומית מקליפת המוח של עכבר, באמצעות מדרג צפיפות סוכרוז לא רציף. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף והומוגניזציה של קליפות המוח של העכבר, ולאחר מכן על ידי סבוב של ההומוגנאט בצנטריפוגה. לאחר מכן, יש להעביר את ההומוגנאט שעבר צנטריפוגה, או את supernatant, למדרגי הסוכרוז שהוכנו מראש.השלב הסופי הוא סבוב בצנטריפוגה ואיסוף של פראקציית הסינפטוזומים. בסופו של דבר, אנליזת western blot וניסויי שילוב של S 35 methionine מראים כי פראקציית הסינפטוזומים מועשרת בסינפסים ופעילה תרגומית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון סבוב בצנטריפוגה וסינון הם, ראשית, מניעת נזק מכני באמצעות שימוש במדרגי צפיפות, ושנית, רעילות נמוכה של per call כלפי התאים ומרכיביהם.בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקשו בביצוע הפרוטוקול, כיוון שהתזמון ממלא תפקיד מרכזי. לאחר קציר הקורטיס, יש להשלים את הפעולה במהירות. כדי להתחיל את ההליך, הכינו את שכבות המדרג של 3%, 10%, 15% ו-23% על ידי הוספת כמויות SIP המתאימות, כפי שמתואר בכתב היד המצורף, לבאפר GM וערבבו היטב.מזגו את שכבות המדרג על ידי פפיט של שני מיליליטרים מכל אחת מהתמיסות האיסו-אסמוטיות של perol בריכוזים של 15%, 10% ו-3% אל תוך מבחנות צנטריפוגה של Beckman עם מכסים. בעזרת פפיפט P 1000, יש לוודא שהממשק בין השכבות גלוי בבירור וללא ערבוב ביניהן. שמרו את המדרגים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות לפני השימוש.לפני תחילת פרוצדורה זו, הכין תמיסות נחוצות נוספות כפי שמתואר בכתב היד המצורף. בצע המתנה לעכבר בגיל P 13 עד P 21 והכן אותו לניתוח על ידי ריסוס עורף הצוואר והראש ב-70% ethanol. לאחר מכן, השתמש במספריים חדות כדי לחתוך את השקע של חוט השדרה בבסיס הגולגולת.בשלב הבא, הסירו את העור מחלקו העליון של הגולגולת. חתכו את הגולגולת באופן צדי בין העצם הפריאטלית לבין העצם האינטר-פריאטלית, או בין אזורי המוח הגדול לקורטקס. לאחר מכן, חתכו את הגולגולת מבסיסה לכיוון האף לאורך התפר הסגיטלי.בשלב זה, הסיר בזהירות את עצם הפריאטלית הרכה על ידי משיכת כל המיספירה הצידה. לאחר מכן, הכנס את השפכטל לתוך המוח מעל המוח הקטן (cerebellum) כדי להוציא את הקורטקס. הנח אותו בבופר GM קר בקרח, וחזור על הפרוצדורות שוב כדי לאסוף קורטקסים נוספים.כעת שטפו את קליפות המוח בבופר GM קר בקרח. לאחר מכן, העבירו שתי קליפות מוח להומגניזר מסוג glass down המכיל חמישה מיליליטרים של בופר GM קר. בצעו הומוגניזציה עדינה של קליפות המוח באמצעות חמישה עד 10 תנועות של פסטל A (הפסטל הרפוי), ולאחר מכן חמישה עד 10 תנועות של פסטל B (הפסטל הצפוף).מספר הפעולות משתנה בהתאם למכשיר ההומוגניזציה האינדיבידואלי. העבירו את ההומוגנאט לפרועת קונית בנפח 15 milliliter. סבבבב את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 1000 times.סבב בצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C במכשיר Allegra six KR כדי לשקע פסד פסד תאי וגרעינים. שכבדו 2 mL של הנוזל העליון (supernatant) על גרדיאנט סוכרוז עבור כל דגימה, כאשר גרדיאנט אחד מיועד לכל קורטקס שלם, וסגרו את המבחנות בפקקים. לאחר מכן, סובבו אותן ברוטור בזווית קבועה ב-32,500 ×g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 °C בצנטריפוגה מסוג Beckman J 2 21.בסיום התהליך, תוך שימוש במתאמים מתאימים, המדרג צריך להניב פס SN חזק; יש לשאוב ולהשליך את התמיסה שמעל פס ה-SN. באמצעות פיפטת פסטור מזכוכית, יש לשאוב את פס ה-SN בממשק שבין 15% ל-23%; מדרג אחד מניב בדרך כלל כ-0.9 עד 1.1 milliliters של sns. לאחר מכן, יש להעביר את התוצר למבחנה קונית ולאחסנו על קרח.לאחר מכן, התאימו את ריכוז המלח של ה-SNS על ידי הוספת נפח של 1/10 מבuffer גירוי בריכוז פי 10. באופן רבנתי, ניתן להוסיף calcium chloride בריכוז פי 1000 כדי להגיע לריכוז סופי של 12 nano molar. לאחר מכן, הוסיפו מאגר TTX בריכוז 1 millimolar כדי להגיע לריכוז סופי של 1 micromolar, למשם דיכוי עירור לא ספציפי.השלב הבא הוא שימוש ב-SNS באפליקציה רלוונטית בהמשך התהליך, כגון מחקרים של תרגום חלבונים. עבור אפליקציות אחרות, ניתן לנקות או לרכז את הליזאט מה-SN באמצעות ערכת ה-Pierce SDS page sample prep. ניתן לקבוע את ריכוז החלבון ב-SNS באמצעות ערכת micro BCA protein assay.הוצגו כאן שש רצועות או פראקציות. כאשר קליפת המוח של העכבר עברה הומוגניזציה והפרדה במדרגי סוכרוז פרול לא רציפים, ה-SNS המועשרים נמצאו ברצועה חמש בממשק שבין 23% ל-15%; רצועה זו הוסרה ונבדקה באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית. דוגמה של שלפוחיות סינפטיות שלמות ושימור של אלמנטים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים מוצגים כאן ב-western blot.עלייה במסמנים סינפטיים וירידה בזיהומים בפס ה-SN מגרדיאנט סוכרוז לא רציף מוכיחות כי העלייה בהטמעה של S 35 methionine עם הוספת גלוטמט נובעת מסנתזת חלבונים דה-נובו (de novo). הוספו 40 micromolar anesa mycin, מעכב סנתזת חלבונים. דמות זו מראה ירידה ניכרת בהטמעת S 35 methionine בנוכחות anso mycin, עם או בלי גלוטמט, בהשוואה לרמות הבסיס.כך, מדרגי סוכרוז (sucrose gradients) לא רציפים של percoll מייצרים במהירות SNS פעיל מאוד וטהור יחסית שניתן להשתמש בו לחקר תרגום חלבונים. איור זה מראה כי פס 5 מהמדרג הלא רציף של percoll sucrose מכיל את הרמות הגבוהות ביותר של סינתזת חלבונים דה-נובו (de novo). ה-SNS שהוכן על ידי העברת קורטקס הומוגניזד דרך סדרה של מסננים בעלי גודל נקבים פוחת ולאחר מכן צנטריפוגה על מדרג percoll sucrose לא רציף לצורך השוואה, מכיל יותר ממברנות שבורות ופחות SNS שלם מאשר SNS שהוכן בשיטת מדרג ה-percoll sucrose הלא רציף. נראה כי SNS שהוכן בשיטת מדרג ה-percoll sucrose הלא רציף מכיל פעילות סינתזה של חלבונים דה-נובו גבוהה יותר מאשר SNS שהוכן בשיטת הסינון.נמצא כי SNS שהוכן מעכברים צעירים בעל פעילות תרגומית רבה יותר מאשר מעכברים מבוגרים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבודד אזורים סינפטיים עצביים (synaptic neuro zones) פעילים תרגומית על ידי הומוגניזציה של קורטקס עכברים, סבוב של ההומוגנאט ברוטור מסוג swinging bucket, סבוב של העילאי מעל מדרג סוכרוז פרקולרי ברוטור בזווית קבועה, ולאחר מכן איסוף של פס האזורים הסינפטיים העצביים שהתקבל.

preparation-synaptoneurosomes-from-mouse-cortex-using-discontinuous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מציג את הליך ליצירת תרביות נוירונים מעובר מאוחר ועכבר מוקדם קליפת המוח לאחר הלידה. תרבויות אלו יכולים לשמש immunocytochemistry, ביוכימיה, electrophysiology, סידן ונתרן הדמיה לספק פלטפורמה ללימוד פיתוח העצבית של חיות טרנסגניות שנושאים מוטציה לאחר הלידה הגן הקטלני.

הכנת ניתק תרבויות עכבר קליפתיים Neuron

סרטון זה מדגים את ההליך לבידוד תאי מוח ותאי חיסון שחדרו מרקמות מוח איסכמיות של עכברים על ידי עיכול אנזימטי, ולאחר מכן הסרת פסולת תאים ומיאלין על ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, כדי לחקור תגובות דלקתיות בחקר שבץ.

השגת תרחיפים של תאים מרקמת מוח איסכמית של עכבר

Source: Lunelli, L., et. al. הצצה בפוליזומים במוח עם כוח אטומי מיקרוסקופיה. J. Vis. Exp.(2016).סרטון זה מדגים הדמיה של פוליזומים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. יריעת נציץ מצופה יוני ניקל מעגנת RNA עם ריבוזומים מחוברים. הדגימה נשטפת, מיובשת ומותקנת על במת המיקרוסקופ. קצה השלוחה סורק את פני הדגימה, רושם סטיות לייזר כדי למפות את הטופולוגיה. תוכנה משמשת לתיקון עיוותים ולהמחשת מבני פוליזום ברזולוציה גבוהה.

 הדמיית פוליזומים שבודדו ממוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

מאמר זה מפרט את ההעשרה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז רציף. ההכנה הבאה של חלבוני צפיפות פוסט סינפטי מתואר גם. הכנות חלבון מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE.

הכנת Synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות Postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף

בעוד שמבנה הריבוזום אופיין בהרחבה, ארגון הפוליזומים עדיין לא נחקר. כדי להתגבר על חוסר ידע זה, אנו מציגים כאן פרוטוקול הכנה מפורט להדמיה מדויקת של פוליזומים של יונקים על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) באוויר ובנוזל.

מציץ המוח Polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי

זיהוי מולקולות ומסלולים השולטים בגמישות הסינפטית ובזיכרון הוא עדיין אתגר מרכזי במדעי המוח. כאן, מתואר תהליך עבודה המתייחס לכימות היחסי של חלבונים סינפטיים המעורבים כביכול בארגון מחדש מולקולרי של סינפסות במהלך למידה וגיבוש זיכרון בפרדיגמת למידה שמיעתית.

גבוהה פרופיל Proteome Synaptic החלטה כמותי של אזורים במוח העכבר לאחר למידה אפליה שמיעתית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים.

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

מאתגר צעיר הנוירונים באזורים במוח חדש יכול לחשוף תובנות חשובות איך הסביבה מפסל גורל עצביים ועם בגרות. פרוטוקול זה מתאר הליך כדי לקצור מבשרי interneuron מאזורים ספציפיים במוח, השתלת אותם גם homotopically או heterotopically לתוך המוח של הגורים כמחנכת.

השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם

התפתחות מוח היונקים דורשת שליטה נאותה בביטוי הגנים ברמת התרגום. כאן, אנו מתארים מערכת פרופיל פוליזום עם פלטפורמת יצירת שיפוע סוכרוז קל להרכבה ושבר כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs במוח המתפתח.

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

פרוטוקול זה מציג שיטה חזקה ומפורטת להשגת סינפטוזומים טהורים ביותר, שלפוחיות סינפטיות ושברים סינפטיים אחרים ממוח העכבר. שיטה זו מאפשרת הערכה של תהליכים סינפטיים, כולל ניתוח ביוכימי של לוקליזציה ותפקוד חלבונים ברזולוציה מדורית.

פיצול תת-תאי לבידוד רכיבים סינפטיים ממוח מורין

למדו הכנת סינאפטונוירוזומים פעילים מתרבולת עכבר באמצעות מדרגת צפיפות Percoll-סוכרוז. השיטה מפחיתה נזק מכני ומאפשרת חקר תרגום חלבונים בסינפסות ביעילות גבוהה.

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

גלה סרטונים נוספים