הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין סינפה פעילה תרגומית לאזורים נוירולוגיים מקליפת המוח של העכבר, באמצעות שיפוע צפיפות סוכרוז פרל לא רציף. זה מושג תחילה על ידי איסוף והומוגניזציה של קליפות העכבר, ולאחר מכן צנטריפוגה של ההומוגנאט. לאחר מכן, החל את הצנטריפוגה הומוגנית, או sup natant על הדוח לכל שיפועי סוכרוז.

השלב האחרון הוא צנטריפוגה ואיסוף שבר הסינפטוזום. בסופו של דבר, ניתוח כתמים מערביים וניסויי שילוב מתיונין S 35 מראים כי מקטע הסינפטוזום מועשר סינפטית ופעיל מבחינה תרגומית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו צנטריפוגה וסינון, הנזק המכני הראשון שלנו נמנע על ידי שימוש בשיפועי צפיפות, והשני לכל קריאה הוא בעל רעילות נמוכה כלפי תאים במרכיביהם.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם פרוטוקול זה מכיוון שהתזמון משחק תפקיד מפתח. לאחר קציר הקורטיס, יש להשלים את ההליך במהירות. כדי להתחיל בהליך, הכינו את שכבות השיפוע של 3, 10, 15 ו-23% על ידי הוספת כמויות ה-SIP המתאימות כמתואר בכתב היד הנלווה למאגר GM וערבבו היטב.

יוצקים שכבות שיפוע על ידי פיפטה של שני מיליליטר מכל אחת מתמיסות פרול איזוסמוטיות 23, 15, 10 ו-3% לתוך צינורות הצנטריפוגה של בקמן עם מכסים. באמצעות פיפטה P 1000, יש להבחין בבירור בממשק בין השכבות ללא ערבוב של השכבות. אחסן את השיפועים של ארבע מעלות צלזיוס לפחות 20 דקות לפני השימוש.

לפני שתתחיל בהליך זה, הכן פתרונות נחוצים אחרים כמתואר בכתב היד המצורף. המתת חסד של העכבר בגיל P 13 עד P 21 והכינו אותו לדיסקציה על ידי ריסוס החלק האחורי של הצוואר והראש באתנול 70%. לאחר מכן השתמש במספריים חדים כדי לחתוך את חוט השדרה בבסיס הגולגולת.

לאחר מכן, הסר את העור מהחלק העליון של הגולגולת. חותכים את הגולגולת לרוחב בין העצם הקודקודית לעצם הבין-קודקודית, או בין אזורי המוח לקליפת המוח. לאחר מכן, חותכים את הגולגולת מהבסיס לאף לאורך התפר הסגיטלי.

בשלב זה, הסר בזהירות את העצם הקודקודית הרכה על ידי משיכת כל חצי כדור הצידה. לאחר מכן, הכנס את המרית למוח מעל המוח הקטן כדי לגרוף את קליפת המוח. הניחו אותו במאגר GM קר כקרח, וחזרו על ההליכים שוב לאיסוף קליפות נוספות.

כעת שטפו את הקליפות במאגר GM קר כקרח. לאחר מכן העבירו שתי קליפות להומוגניזטור זכוכית המכיל חמישה מיליליטר של מאגר GM קר. הומוגניזציה עדינה של קליפות המוח עם חמש עד 10 מכות של עלי A, העלי הרופף ואחריו חמש עד 10 מכות של עלי B, סוג עלי

מספר המשיכות משתנה בהתאם להומוגניזטור האישי. העבירו את ההומוגנאט לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה אותו פי 1000.

כוח משיכה למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה של אלגרה שש KR כדי לגלול פסולת תאית וגרעינים. שכבה של שני מיליליטר של הסופינט לכל שיפוע או סוכרוז עם שיפוע אחד לכל קליפת המוח השלמה ומכסה את הצינורות. לאחר מכן צנטריפוגה אותם ברוטור בזווית קבועה בכוח הכבידה פי 32, 500 מכוח הכבידה למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה של בקמן J 2 21.

באמצעות מתאמים מתאימים לאחר השלמתו, השיפוע אמור לתת פיפטה חזקה של פס SN ולהשליך את התמיסה מעל רצועת ה-SN. באמצעות פיפטות פסטה מזכוכית מפס ה-SN בממשק של 15 עד 23%, שיפוע אחד נותן בדרך כלל כ-0.9 עד 1.1 מיליליטר של sns. לאחר מכן, העבירו אותו לצינור חרוטי ואחסנו על קרח.

לאחר מכן התאם את ריכוז המלח של ה-SNS על ידי הוספת נפח עשירי של פי 10 מאגר גירוי. לחלופין, הוסף פי 1000 סידן כלורי כדי לתת ריכוז סופי של 12 אנו טוחנת. לאחר מכן, הוסף מלאי TTX מילי-מולרי אחד כדי לתת ריכוז סופי של מיקרומולר אחד כדי לדכא עירור לא ספציפי.

השלב הבא הוא להשתמש ב-SNS ביישום הרלוונטי במורד הזרם, כגון מחקרי תרגום חלבונים. עבור יישומים אחרים, ניתן לנקות או לרכז את SN lysate באמצעות ערכת ההכנה לדוגמה של דף Pierce SDS. ניתן לקבוע את ריכוז החלבון של ה-SNS באמצעות ערכת בדיקת חלבון מיקרו BCA.

הנה דוגמה לשש רצועות או שברים. כאשר קליפת המוח של העכבר הומוגנית והופרדה בשיפועי פרול סוכרוז לא רציפים, ה-SNS המועשר נכלל ברצועה חמש בממשק של 23 עד 15%, פס זה הוסר ונבדק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים. דוגמה לשלפוחיות סינפטיות שלמות ושימור אלמנטים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים מוצגות כאן בכתם המערבי.

הוכח כי עלייה בסמנים סינפטיים וירידה בזיהומים ברצועת ה-SN משיפוע לא רציף לכל סוכרוז מאשרים כי העלייה בשילוב מתיונין S 35 עם הוספת גלוטמט נובעת מסינתזת חלבון דה נובו. נוסף 40 מעכב סינתזת חלבון 40 מיקרו-מולרי. איור זה מראה את הירידה הניכרת בשילוב מתיונין S 35 בנוכחות anso mycin עם או בלי גלוטמט נוכח בהשוואה לרמות הבסיסיות.

לפיכך, שיפועי הסוכרוז הלא רציפים מייצרים במהירות SNS פעיל מאוד וטהור יחסית שניתן להשתמש בו לחקר תרגום חלבונים. איור זה מראה כי הרצועה החמישית משיפוע הסוכרוז הלא רציף לליבה מכילה את הרמות הגבוהות ביותר של סינתזת חלבון דה נובו. ה- SNS שהוכן על ידי העברת קליפת המוח ההומוגנית דרך סדרה של מסננים עם גודל נקבוביות הולך ופוחת ולאחר מכן צנטריפוגה על שיפוע סוכרוז לא רציף לכל ליבה לצורך השוואה מכילים יותר ממברנות שבורות ופחות SNS שלם מאשר SNS שהוכן משיטת שיפוע סוכרוז פרול לא רציף SNS שהוכן בשיטת שיפוע סוכרוז פרל לא רציף הוכח כמכיל יותר פעילות סינתזת חלבון דה נובו מאשר SNS שהוכן בשיטת הסינון.

SNS שהוכנו מעכברים צעירים יותר הוכחו כבעלי פעילות תרגומית גדולה יותר מאשר לעכברים מבוגרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לבודד אזורים נוירולוגיים סינפטיים פעילים בתרגום על ידי הומוגניזציה של קליפות עכבר, צנטריפוגה של ההומוגנט ברוטור דלי מתנדנד, צנטריפוגה של הסופרנטנט על פני שיפוע סוכרוז לכל קריאה ברוטור זווית קבועה, ולאחר מכן איסוף פס האזור העצבי הסינפטי המתקבל.