Name: הערכת הביטוי GFP ואת הכדאיות שימוש Cytometer תמונה מבוסס טלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: למדו הערכת כדאיות תאים וביטוי GFP באמצעות ציטומטר מבוסס תמונה Tali. שיטה זו מאפשרת ניתוח אוכלוסיות תאים עם נתונים כמותיים וויזואליים במקביל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. תאים עם ערכת מכתים את הכדאיות טלי - מגיב Cell המלח האדום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הליך זה עם תאים U2OS (גביה סוג התרבות האמריקנית), כי כבר transduced באמצעות CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2.0 *. (הערה: תאים יכול להיות גם הסתחרר למטה resuspended בינוני או PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים תאים מתים עם PI, העברת 100 μL של התאים לצינור microcentrifuge חדש. שים לב, ריכוז של 10 מ&quot;ל 1 x 5-1 / x 10 7 תאים מומלץ assay הזה, אם כי הריכוז אינו חייב להיות מדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, כדי להכתים את התאים המתים, להוסיף 1 μL של מגיב טלי לצרכן המבוסס על תא המלח האדום. בקצרה וורטקס לערבב. דגירה האדום המלח טלי תא מגיב תערובת תא בטמפרטורת החדר בחושך במשך 1-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, מיד להמשיך ניתוח המדגם על Cytometer טלי Image-Based. </li></ol> 2. ביצוע כדאיות התא Assay שימושטלי תמונה מבוסס Cytometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cytometer טלי משתמשת פלסטיק חד פעמיות טלי נייד ניתוח שקופיות ספציפית להשתלב cytometer והוא יכול להחזיק שתי דגימות 25μL בתאי סגורים נפרדים (A ו-B). כאשר הטיפול שקופיות, הקפד תמיד להחזיק אותו על ידי הצדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון את השקופית, μL 25 פיפטה מדגם לאט לתוך שטח ההעמסה חצי ירח בצורת המדגם, לטפל כדי למנוע יצירת בועות או להתיז בחזרה. אל מעל או מתחת למלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה, תאים מלאה (בלא כתם, לא transduced) נטענים בתא ואת מוכתם GFP-להביע תאים נטענים בתא B. מדגם השליטה יסייעו לקבוע את רמת autofluorescence כאשר מנתחים את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע assay הכדאיות, מגע GFP / RFP במסך הבית של cytometer. האפשרויות assay יופיע בצד ימין. בחר ליכולת הקיום GFP +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, על שם סדרת המדגם, הקש שם עכשיו </strong&gt;. לאחר מכן, באמצעות מסך המגע, הקלד את השם של הסדרה מדגם ולחץ שמור. (הערה: שם בחר מאוחר יותר באופן אוטומטי להקצות שם לכל סדרה מדגם לפי תאריך ושעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שיום המדגם, cytometer טלי באופן אוטומטי מראש מסך המדד. לחצו על הלשונית רקע בחצי התחתון הימני של המסך מדוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, עם מדגם הביקורת (א &#39;) מול הרחק cytometer, הכנס את השקופית בנמל הטעינה עד שייעצר. אין להפעיל כוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במסך רקע, לגעת הקש הוספת תא חדש בקרת בלא כתם. השקופית באופן אוטומטי נכנס cytometer ואת תמונת חיים של תאים יוצג על המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הידית להתמקד, להביא את התאים לתוך המטוס תקין של השקפה. התאים צריך להיות אחיד כהה עם הילה בהירה סביב כל תא (איור 1, שמאל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאזה עשוי להיות undercounted כאשר המעבר בין הרקע ואת הקצוות של התאים מעורפלת, כך גבולות התא אינם מוגדרים היטב (איור 1, מרכז). תאים עשויים להיות overcounted כאשר יש להם מרכזי בהיר היקפה כהה (איור 1, ימין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להציג טוב יותר את האוכלוסייה התא תוך התמקדות, להחליק על הכפתור האדום אינדיקטור זום 4X או 16X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהתאים הובאו אל המוקד, מגע לחצו על הפעל בקרה Cell בלא כתם על מנת למדוד את הקרינה רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cytometer באופן אוטומטי ללכוד ולנתח את התמונות של המדגם. זה לוקח בערך 1 דקה כדי ללכוד ולנתח את התמונות ברירת המחדל (9 תמונות) במצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות ממוזערות של כל שדה הראייה מוצגים כפי שהם כבשו את סרגל התקדמות מספקת עדכון שוטף. לאחר לכידת תמונה תושלם, cytometer באופן אוטומטי פולט את השקופית ומספקת את הנתונים מתוך ניתוח של תמונות שנתפסו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הנתונים מאוחסנים יוצג התפריט הנפתח של הכרטיסייה רקע cytometer. המדגם לשלוט רקע יוקצה אותו שם כמו זה שניתן הניסוי יהיה מיובא התפריט הנפתח. הערה: אם שליטה רקע לא לרוץ, cytometer מקצה אוטומטית סף הקרינה. ניתן לשנות זאת באופן ידני לאחר ביצוע assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפעיל את מדגם PI מוכתם transduced, להסיר את השקופית מ cytometer, הופכים אותו סביב והכנס את זה עם מדגם transduced מול הרחק המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על לשונית לדוגמה ולאחר מכן לחץ על הוספת מגע מדגם חדש. כאשר התמונה מופיעה על המסך, השתמש ידית התאמת תמונה להביא את התאים לתוך להתמקד כמו קודם. ואז לגעת לחץ כדי הפעלה לדוגמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לכידת תמונה תושלם, הנתונים מניתוח מופיע תחת הלשונית מדגם האוטומטי cytometerברית פולט את השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמתבקש להיפטר החלק את טלי ניתוח נייד כמו פסולת ביולוגית מסוכנת. טלי שקופיות נייד ניתוח לא ניתן לעשות שימוש חוזר. </li></ol> 3. סף קביעת גייטס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדגם יש להפעיל, ספי כעת ניתן להחיל המדגם להתביית על אוכלוסיית תאים מסוים. הנה, נוכל להתאים את הספים כדי לקבוע את אחוז תאים חיים ומתים ב-GFP transduced תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה לדוגמה, מספר ואחוז התאים לבטא את ה-GFP, תאים חיים ומתים להביע GFP, הכדאיות הכוללת, גודל התא הממוצע, מספר התאים ספרתי, וריכוז תא מוצגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף, המגרשים היסטוגרמה להצגת גודל התא, פלואורסצנטי ירוק, אדום פלואורסצנטי (PI) מוצגים בתחתית המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את השער גודל התא, מגע התמונות גודל התא כדי לפתוח את ההיסטוגרמה גודל התא. בעוד תאים בתרבית רק לעתים נדירות יש דebris, מדגמים אחרים עשויים להכיל פסולת כי הוא גדול יותר או קטן יותר מאשר בתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לא לכלול את ההריסות, להחליק את הכפתורים כחול בסרגל המחוון כדי לכלול אירועים גדולים וקטנים כאחד. לאחר מכן, החל לגעת מחדש לנתח את הנתונים ולעדכן את התוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להוסיף את הקרינה GFP לניתוח, מגע התמונות היסטוגרמה GFP כדי לפתוח אותו. החלק את הפס הכחול כדי לקבוע את הסף רק בצד ימין של השיא הקלוש ביותר, באמצעות מדגם מלאה כמדריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה מאפשר ניתוח כדי לכלול את התאים GFP חיובי, אבל להוציא תאים autofluorescent. Autofluorescence הוא ציין לעתים קרובות כאשר מולקולות ביולוגיות בתוך התאים נרגשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגע החל לאשר ולחזור למסך הקודם. הנתונים המוצגים תחת הלשונית לדוגמא עכשיו צריך לשקף את השערים ספי להגדיר עבור שני ערוצי פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, כדי להפריד את התאים מוכתם PI מ autofluorescence, לחץ לאהוא התמונות לצרכן היסטוגרמה כדי לפתוח את ההיסטוגרמה לצרכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, שיא המדגם לשלוט יוצג שיא אפור על ההיסטוגרמה. השיא הוא אדום פלואורסצנטי המדגם. פלואורסצנציה הרקע מוצג לשיא הקרוב ביותר לערך RFU 0 cytometer על זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע את הקרינה רקע בערוץ PI, להזיז את הכפתור הכחול בסרגל במחוון כדי לכוונן את הסף להוציא את השיא המייצגות הקרינה רקע, באמצעות שיא אפור ממדגם הביקורת כנקודת התייחסות. מגע החל לאשר ולחזור למסך הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, כדי לוודא ויזואלית לכל תא מוקצה כראוי, בחר שדה כבש מבט לבדיקה על ידי לחיצה על התמונה הממוזערת בכרטיסיה זום, ואז לחיצה על הכרטיסייה &#39;שכבות&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לחצו על כפתור ה-GFP או PI, כדי להציג את התמונה שצולמה באמצעות ערוץ מסוים. לחצו על הלחצן שוב כדי להסיר את שכבת מהתצוגה, או, כדי להניח שכבות, לגעת כפתור Layer מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות את האופן שבו נספרים תאים באמצעות ערוץ מסוים, מעגלי מגע. תאים נספרו רק דרך ערוץ בהיר השדה, אשר אינם מבטאים הקרינה יהיה בעיגול כחול. זה מצביע על כך כי תא מסוים הוא חי (כלומר לצרכן שלילי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים GFP להביע יראו בערוץ ה-GFP, יהיה בעיגול ירוק. תאים מתים מוכתם אדום Cell המלח יהיה לראות בערוץ לצרכן, ויהיה מוקף בעיגול אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים ספרתי בערוץ הן אדום וירוק יהיה בעיגול צהוב, זה מצביע על כך התא מבטא GFP, אבל היא גם צבעונית עם לצרכן ולכן הוא מת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדי פעם, עיגולים שחורים יופיע על המסך, אלה הם אובייקטים אשר זוהו, אך הורחקו מן הניתוח מבוסס על גודל התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך fiנה לכוון את סף הקרינה על ההיסטוגרמה באמצעות השלבים שתוארו עד עתה כל תא מבטא הקרינה הוא הקיף עם הצבע המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הפרמטרים ניתוח נשמרים באופן אוטומטי תחת לשונית הנתונים. Cytometer טלי יכול לאחסן קובצי נתונים מכ 500 פועל מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל קובץ מאוחסן בכרטיסיה נתונים זמין עבור reanalysis. על ידי בחירה את הקובץ בכרטיסיה נתונים זה יהיה פתח וכל היסטוגרמות שכבות להיות פעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני ארכיון ולהפיק דוחות, הנתונים מאוחסנים cytometer ניתן להעביר למחשב באמצעות כונן USB. </li></ol> 4. נציג תוצאות: תמונה מבוסס טלי Cytometer שימש כדי למדוד את רמת חלבון פלואורסצנטי ביטוי בתאים שהיו transduced עם מבנה הגרעין במיקוד GFP הביטוי 2.0 BacMam. ארבעה סוגי תאים נציג היו transduced (U2OS, 293MSR, HEKn, CHO ו-S).עבור אלה שורות תאים, מספר תאים הביעו GFP נמסר על ידי cytometer טלי לעומת נתוני דגימות אותו מנותח על cytometer זרימה. בנוסף, התאים היו מוכתמות מגיב התא האדום המלח באמצעות ערכת ליכולת הקיום טלי לזהות את אוכלוסיית התאים המתים הן על cytometer טלי על cytometer זרימה. ייצוגים גראפיים באיור 2 להראות את אחוז מכלל האוכלוסייה לכל סוג תא הביעו GFP. נתונים אלה מראים כי cytometer טלי מייצרת נתונים להשוות נתונים שנוצרו על ידי cytometer זרימה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig1.jpg" /> באיור 1. תאים צריך להיות ממוקד כראוי לפני הניתוח. שקופיות טלי ניתוח נייד עם ריכוזים תא מתאים לניתוח (1 x 05-01 אוקטובר 7 x 10 תאים מומלץ). (משמאל) ב-להתמקד התאים ד אחידארון ברחבי התא, עם הילה בהירה סביב כל תאים סלולריים. (במרכז) ניתן undercounted כאשר המעבר בין הרקע את הקצוות של התאים מטושטשת ותאי יש גבולות מוגדרים (מימין) תאים אולי overcounted כאשר יש להם בהיר מרכזים היקפה כהה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig2.jpg" /> באיור 2. פלורסנט ביטוי חלבון נתונים Cytometer טלי מבוסס תמונה דומה לזו שהושג באמצעות cytometry הזרימה. השוואה Side-by-הצד של ה-GFP ביטוי בתוצאות מחושב 4 שורות תאים שונות בתאים קיימא.

<ol><li>Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementarity+of+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy.</a> Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).</li>
<li>Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+analysis+by+open-source+software+for+affordable+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry.</a> Scanning. 33, 33-40 (2011).</li>
<li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li>
<li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+apoptosis%3A+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-654 (2002).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Koopman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V+for+flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+B+cells+undergoing+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.</a> Blood. 84, 1415-1420 (1994).</li>
<li>Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+fluorochromes+to+ethidium+bromide+for+automated+read+out+of+cytotoxicity+tests%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests.</a> J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).</li>
<li>King, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+dead+cells+and+measurement+of+cell+killing+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).</li>
<li>Jones, K. H., Kniss, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propidium+iodide+as+a+nuclear+counterstain+for+immunofluorescence+studies+on+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).</li>
<li>Dell'Arciprete, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+expression+gene+cloning+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry.</a> J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).</li>
<li>Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+quantitative+and+inexpensive+method+for+detecting+apoptosis+by+flow+cytometry+in+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).</li>
<li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li>
</ol>

Krissy Remple ולורל סטון עובדים של החיים טכנולוגיות שהפיק את המכשיר משמש במאמר זה. החיים טכנולוגיות מימנה את הייצור של מאמר-video זה.

יש לנו נוהל מפורט רק עבור ביצוע ספירות כדאיות והערכת הביטוי GFP באמצעות תמונה מבוסס טלי Cytometer. שימוש באותו הליך, cytometer זה הוא מסוגל לבצע מספר מבחני אחרות, לרבות: אפופטוזיס, RFP ותא ניתוח כדאיות השימוש הלא transduced תאים. מבחני Fluorometric של כדאיות התא, ביטוי גנים אפופטוזיס הפכו מתודולוגיות מפתח במחקר ביו 7-12. ב המכשור, בעבר נפרדים נעשה שימוש כדי לקבל מידע כמותי על תאים חזותי. בעוד שמידע כמותי על תאים בתוך אוכלוסיה הטרוגנית כבר צבר באמצעות cytometry זרימה, מידע חזותי או איכותי נאסף באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 1-4. כאן, אנו מציגים טכנולוגיה אשר מגשר על הפער בין האוכלוסייה לימודי תא יחיד. שימוש Cytometer תמונה מבוסס טלי, כמותי data ונתונים תא חזותי על תאים בודדים או אוכלוסיות תאים ניתן לאסוף בעת ובעונה אחת. המכשיר טלי יכול לשמש עבור מגוון של יישומים, כולל הערכה של ביטוי גנים, מבחני אפופטוזיס, מחקרים על יעילות התרופה, והערכה של התקדמות המחלה. תמונה מבוסס טלי לוכדת Cytometer ומנתח בהיר שדה, פלואורסצנטי אדום ותמונות פלואורסצנטי ירוק, המאפשר מידע על subpopulations של תאים שיופק. לדוגמה, assay הזה, היינו יכולים להבחין בין תאים מתים מן התאים לחיות בתוך האוכלוסייה-GFP להביע התא באמצעות המלח צבען האדום Cell. זה נותן דיוק במדידה של תאים קיימא להביע GFP, ומזהה את אוכלוסיית התאים שמיש עבור עיבוד במורד הזרם. חשוב לציין כי התאים המתים באוכלוסייה יכולה לנבוע ממקורות שונים, כולל מוות של תאים נורמליים בתרבות או מוות של תאים הנגרם על ידי תנאים סביבתיים (למשל, trypsinization או דהATH המושרה על ידי שיטה transfection / התמרה הנבחר). כאן אנו מדגימים את השימוש cytometer טלי עם תאים U2OS. בשיטות דומות ניתן לבצע באמצעות בתאי יונקים ביותר חרקים. עבור כל קו התא, מיוצר cytometer טלי ביטוי כמותי GFP נתונים, דבר שאינו אפשרי עם בדיקה ויזואלית של התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. למרות התוצאות הללו דומים cytometry זרימה, הם נאספים בשבריר של זמן. Cytometer מסוגל לספור במדויק את התאים בין 5 מיקרומטר עד 60 מיקרומטר קוטר, רצוי בריכוז של 1 x 05-01 אוקטובר 7 x 10 תאים / מ&quot;ל. חשוב לציין כי מכתים פרוטוקולים סטנדרטיים ביותר, לרבות פרוטוקול מכתים המלח Red Cell המתואר כאן, להשתמש יודיד propidium להבחין בין תאים חיים ומתים. זה מציב אתגר כאשר להערכת הכדאיות בתאים שהיו permeabilized עבור רחובaining של סמנים תאיים, שכן לצרכן יהיה כתם לכל תא עם קרום בסכנה. מאז כל צבע חלבון פלואורסצנטי או כי ניתן לאתר את ערוצי פלואורסצנטי ירוק או אדום ניתן לנתח על Cytometer טלי מבוסס תמונה, מחקרים עתידיים עשויים לבדוק את השימוש של צבעים חלופית, כגון צבעי אמין הכדאיות תגובתי 4. מחקר שנעשה בשנת 2006 על ידי Perfetto et al. 12 נמצא צבעים אלה כדי להיות קלה לשימוש לשעתקו להפלות אוכלוסיות תאים חיים ומתים. שים לב טלי יש מגבלות לגבי סוגי מבחני זה יכול לבצע. לדוגמה, מאז המטרה בשימוש על ידי המכשיר היא 4X, מבצעים ספירה מוגבלים סוגי תאים גדולים: המשנה הסלולר מבנים כגון המיטוכונדריה או שלפוחית, וכן תאים חיידקיים לא ניתן לכמת. כמו כן שים לב הערוצים גילוי טלי מוגבלים fluorophores שילהיב פולטים בתוך הערוצים. בעוד YFP ובהיר mCherry אותות גלהתגלות, דימר אותות mCherry לא יכול. לבסוף, טלי רק מנתח את התאים בתרחיף. זה לא מדויק לספור תאים דבקות לשקופית. יתר על כן, בעוד שיש רק יכולת מוגבלת לספור תאים מעוצבים באופן בלתי סדיר, כולל שמרים מסוימים תאים ראשוניים. בנוסף, מחקרים בעתיד צפויה כתובת השימוש במערכת זו בהערכת ביטוי של סמנים תאיים. צבעים בודדים ניתן לבדוק עבור חפיפה ספקטרלית עם ערוצים סמוכים, באמצעות כלי SpectraViewer המקוונת של Invitrogen ( <a href="http://www.invitrogen.com/spectraviewer">www.invitrogen.com / spectraviewer</a> ). לאור החידוש בטכנולוגיה זו, מגוון רחב של יישומים טרם גילו. לסיכום, Cytometer תמונה מבוסס טלי הפגינו כאן מציגה טכנולוגיה חדשה המאפשרת הדמיית ניתוח סימולטני של אוכלוסיות תאים, המאפשרת הערכה של תאים בודדים, כמו גם celאני אוכלוסיות בפורמט קומפקטי עם זרימת עבודה פשוטה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> טלי תמונה מבוסס Cytometer </td><td> Invitrogen </td><td> T10796 </td></tr><tr><td> טלי נייד שקופיות ניתוח, 50 שקופיות </td><td> Invitrogen </td><td> T10794 </td></tr><tr><td> טלי נייד שקופיות ניתוח, 500 שקופיות </td><td> Invitrogen </td><td> T10795 </td></tr><tr><td> טלי ערכת ליכולת הקיום - Red Cell המלח </td><td> Invitrogen </td><td> A10786 </td></tr><tr><td> טלי ערכת ליכולת הקיום - ירוק Cell המלח </td><td> Invitrogen </td><td> A10787 </td></tr><tr><td> טלי אפופטוזיס Kit </td><td> Invitrogen </td><td> A10788 </td></tr><tr><td> U2OS תאים </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת הביטוי gfp ואת הכדאיות שימוש cytometer תמונה מבוסס טלי

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

תא בודד ומידע האוכלוסייה מתקבלים בדרך כלל או על ידי זרימת cytometry או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, אלה שתי שיטות לספק מידע שונים. Cytometry זרימה נותן מידע כמותי רב פרמטרית על מאפיינים פיזיים מכתים או ביטוי, אבל אינו מאפשר ראיה. עצמאיים מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספקת נתונים חזותיים, אך אינו מאפשר מדידה כמותית פשוטה 1. תמונה מבוססי cytometry מגשר על הפער בין שתי השיטות, המאפשר הדמיה מהירה ניתוח כמותי סימולטני של אלפי תאים אוכלוסיות הטרוגניות 2. כאן, אנו מציגים שיטה לביצוע כדאיות התא ירוק ניאון (GFP) חלבון מבחני ביטוי באמצעות Cytometer טלי מבוסס תמונה 3. המכשיר טלי היא פלטפורמה 3 ערוצים (שדה בהיר, ירוק פלואורסצנטי, אדום פלואורסצנטי) benchtop assay כי offers מספר יתרונות על פני cytometry זרימת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. Cytometer טלי פחות יקר, תופס ספסל פחות, דורש פחות תחזוקה, ואת זרימת העבודה הופשטה, כך פעולת ניתוח הרבה יותר פשוט ומהיר. Cytometer טלי הוא מסוגל לבצע מגוון של תא המבוססת על מבחני ההשעיה, כולל ה-GFP ואדום ביטוי ניאון (RFP) חלבון, אפופטוזיס 4-6 ו כדאיות התא ניתוח עם יודיד propidium (PI) 11/07. הנה, אנחנו מדגימים את השימוש במכשיר טלי בביצוע כדאיות התא assay בתאים לבטא GFP. GFP-transduced התאים הם מוכתמים באמצעות ערכת ליכולת הקיום טלי - Red Cell המלח. התאים pipetted מכן לתוך שקופיות ניתוח טלי נייד וטעון cytometer. השדה מואר, אדום פלואורסצנטי ותמונות פלואורסצנטי ירוק נלכדים ונותחו באמצעות אלגוריתמים assay ספציפיים. Histograms נוצרות אז לתצוגה גודל התא, PI fluoעוצמת rescence, ועוצמת הקרינה ה-GFP. פרמטרים אלה לאחר מכן ניתן thresholded להתביית על אוכלוסיית תאים מסוים. תופעות לוואי על ידי השוואה של Cytometer טלי תמונה מבוססי זרימת cytometry המסורתית מוכיח כי שתי השיטות מספקים נתונים השוואתיים לגבי הכדאיות התא ביטוי חלבון. עם זאת, מכשיר טלי מספק מידע חזותי נוסף על אוכלוסיית תאים שלא ניתן להשיג באמצעות cytometer לזרום.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מבחני כדאיות התא ביטוי הקרינה באמצעות Cytometer תמונה מבוסס טלי.

הערכת הביטוי GFP ואת הכדאיות שימוש Cytometer תמונה מבוסס טלי

מידע על תאים בודדים ועל אוכלוסיות תאים מתקבל בדרך כלל באמצעות ציטומטריה של זרימה או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. עם זאת, שתי שיטות אלו מספקות...

סרטון זה מדגים הליך לקביעת חיוניות תאים בתאים המבטאים GFP באמצעות הציטומטר מבוסס-תמונות tally. תאים שעברו טרנסדוקציה של GFP נצבעים באמצעות ערכת החיוניות tally viability kit dead cell red, הצובעת את כל התאים המתים באדום עם propidium iodide; התאים מועברים בפיפט לשקופית ניתוח תאי של tally ונטענים לתוך הציטומטר, אשר רוכש ומנתח תמונות בשדה בהיר (brightfield) ופלואורסצנציה באדום ובירוק. לאחר מכן נוצרים היסטוגרמות להצגת מספר התאים, גודל התאים, עוצמת הפלואורסצנציה של PI ועוצמת הפלואורסצנציה של GFP בהשוואה לציטומטריית זרימה מסורתית.מערכת Tali יכולה לספק נתונים דומים בנוגע לחיוניות תאים וביטוי. עם זאת, ציטומטריה זו המבוססת על תמונות מספקת מידע ויזואלי נוסף על אוכלוסיית התאים הנבדקת. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ציטומטריה של זרימה או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הוא שהציטומטר של Tally המבוסס על תמונות מספק מידע כמותי וויזואלי בו-זמנית על דגימת התאים שלך.בנוסף, מכשיר הספירה (tally instrument) קל יותר לשימוש, זול יותר ותופס שטח עבודה קטן יותר מאשר ציטומטר זרימה או מיקרוסקופ פלואורסצנציה. דבר זה מאפשר לחוקרים לבצע במהירות בדיקות כמותיות, כגון בדיקת חיוניות בתאים המבטאים GFP, ישירות על שולחן העבודה. בהליך זה, תאי U2 OS בריכוז של 1×10⁶ תאים למילליליטר הועברו טרנסדוקציה עם מבנה ויראלי של GFP המכוון לגרעין התא, כדי לסמן תאים מתים באמצעות propidium iodide; העברו 100 µL מתלי התאים למבחנה חדשה של מיקרו-צנטריפוגה.שימו לב כי עבור הבדיקה מומלץ להשתמש בריכוז של 1x10⁵ עד 1x10⁷ תאים למילליליטר, אם כי הריכוז אינו חייב להיות מדויק. לאחר מכן, הוסיפו 1 µL של ריאגנט tally dead cell red. ערבבו קצרות באמצעות וורטקס, והדגירו את תערובת ריאגנט הצביעה והתאים בטמפרטורת החדר, בחושך, למשך דקה אחת עד חמש דקות.לאחר הדגירה, עברו מיד לניתוח במכשיר ה-tally image-based cytometer. ה-tally משתמש בשקופיות ניתוח תאיות מפלסטיק חד-פעמי שתוכננו במיוחד עבור המכשיר. הקפידו תמיד להחזיק את השקופית בקצוות כדי להטעין אותה.העבירו בבובט 25 µL של דגימה באיטיות לאחד מאזורי טעינת הדגימות בצורת חצי סהר. כאן, תאים שאינם צבועים ואינם טרנסדוקים המשמשים כביקורת נטענים בתא A, והתאים הצבועים המבטאים GFP נטענים בתא B. כדי לבצע בדיקת חיוניות בתאים המבטאים GFP, לחצו על G-F-P-R-F-P במסך הבית של הציטומטר. אפשרויות הבדיקה יופיעו אז מצד ימין; בחרו ב-GFP plus viability.המכשיר ישאל לאחר מכן האם יש לתת שם לסדרת הדגימות כדי להגדיר את שם סדרת הדגימות. לחץ על "name now". לאחר מכן, הקלד באמצעות מסך המגע את שם סדרת הדגימות ולחץ על "save"; ה-tally cytometer יעבור באופן אוטומטי למסך המדידה.בשלב הבא, כדי למדוד את הפלורסצנציית הרקע, לחץ על לשונית הרקע בחלק הימני התחתון של מסך המדידה כפי שניתן לראות כאן. הגדרת ברירת המחדל מציינת כי יצולמו תשעה שדות של תאים. כעת, כאשר דגימת הביקורת פונה הרחק מהמכשיר, הכנס את הפס לפתח הטעינה עד לעצירה.אין להפעיל כוח בעת לחיצה על מסך הרקע לצורך הכנסת בקרת תאים חדשה ללא צביעה. הזריקה תימשך באופן אוטומטי לתוך המכשיר ותמונה חיה של התאים תוצג על המסך. בעזרת כפתור המיקוד, הגבילו את התאים למישור הראייה המתאים תוך כדי ביצוע המיקוד.הזרימו את כפתור הזום האדום ל-4x או 16x. כדי לצפות טוב יותר באוכלוסיית התאים, התאים צריכים להיות כהים באופן אחיד עם הילה בהירה סביב כל תא. כפי שמוצג כאן, ייתכן שספירת התאים תהיה נמוכה מדי כאשר המעבר בין הרקע לקצוות התאים מטושטש, כך שגבולות התאים אינם מוגדרים היטב.ייתכן שספירת התאים תהיה גבוהה מהממשי כאשר למרכז התא יש גוון בהיר ולהיקפו גוון כהה. לאחר שהתאים הובאו למיקוד, גע/י או לחץ/י להפעלת בקרת תאים לא צבועים. כדי למדוד את הפלואורסצנציה של הרקע, הציטומטר יצלם תמונות באופן אוטומטי ויציג תצלומיות של כל שדה ראייה.סרגל ההתקדמות מספק עדכון שוטף של הניתוח. לאחר השלמת לכידת התמונה, הציטומטר פולט את הפלטה באופן אוטומטי ומספק את הנתונים מניתוח התמונות שנלכדו. נתונים שמורים מוצגים בתפריט הנפתח של לשונית הרקע.לדגימת בקרת הרקע יוקצה אותו שם שניתן לניסוי. כדי להריץ את הדגימה של ה-GFP שעברה טרנסדוקציה ונצבעה ב-PI, הוצא את השקופית מהמכשיר, הפוך אותה והכנס אותה שוב כך שהדגימה שעברה טרנסדוקציה פונה הרחק מהמכשיר. לחץ על לשונית הדגימה ולאחר מכן לחץ על press כדי להכניס דגימה חדשה.כאשר התמונה מופיעה על המסך, השתמש בגלגל המיקוד כדי להביא את התאים למיקוד. כפי שנעשה קודם לכן, לחץ על run sample להרצת הדגימה. לאחר השלמת לכידת התמונה, הנתונים מהניתוח יופיעו תחת הלשונית sample והציטומטר יפלוט את השקופית באופן אוטומטי.השליכו את שקופית ניתוח התאים של ה-tally. כפסולת ביולוגית מסוכנת, לא ניתן להשתמש בשקופיות אלו שוב. לאחר הרצת הדגימה, ניתן להחיל ספי רגישות (thresholds) על הדגימה.כדי לנתח אוכלוסיות תאים ספציפיות כאן, נתאים את הספים כדי לקבוע את אחוז התאים החיים והמתים. תחת לשונית הדגימה, עבור תאים המבטאים GFP, יופיעו מספר ואחוז התאים המבטאים GFP, תאים מתים המבטאים GFP והחיוניות הכוללת. מוצגים גם גודל תא ממוצע, מספר התאים שנספרו וריכוז התאים.בנוסף, בתחתית המסך מוצגות תרשימי היסטוגרמה המציגים את גודל התאים, פלואורסצנציה ירוקה ופלואורסצנציה אדומה. כדי להגדיר את שער סינון גודל התאים, גע בתמונה הממוזערת של גודל התאים כדי לפתוח את ההיסטוגרמה של גודל התאים לצורך הסרת פסולת. הזז את פסי ההזזה הכחולים כדי להוציא מהניתוח אירועים גדולים וקטנים כאחד.הקישו על apply כדי לכלול את התאים בתוך השערים. כדי להוסיף את פלואורסצנציית ה-GFP לניתוח, הקישו על התמונה הממוזערת של היסטוגרמת ה-GFP כדי לפתוח אותה.הזיזו את סרגל ההגרה הכחול כדי לקבוע את סף החיתוך (threshold) מימין לשיא החלש ביותר. השתמשו בדגימת הביקורת כמדריך. פעולה זו מאפשרת לאנליזה לכלול את התאים החיוביים ל-GFP, אך להוציא תאים עם פלואורסצנציה עצמית (autofluorescent cells).אוטופלורסצנציה נצפית לעיתים קרובות כאשר מולקולות ביולוגיות בתוך תאים עוברות עירור. הקשเพื่อ לאשר וחזור למסך הקודם. הנתונים המוצגים תחת לשונית הדגימה צריכים לשקף כעת את השערים (gates) ואת הסף שנקבעו עבור שני ערוצי הפלורסצנציה. לאחר מכן, כדי להפריד את התאים הצבועים ב-PI מהאוטופלורסצנציה או מכל רקע שנמצא בדגימה, לחץ שוב על התמונה הממוזערת של היסטוגרם ה-PI כדי לפתוח אותה.פיסגת דגימת הביקורת תוצג כפיסגית אפורה בהיסטוגרמה. הפיסגית האדומה מייצגת את הפלואורסצנציה של הדגימה. הפלואורסצנציה של הרקע מוצגת כפיסגית הקרובה ביותר לערך RFU אפס במכשיר זה.כדי לבטל את הפלואורסצנציית הרקע בערוץ ה-PI, הזז את פס ההחלקת הכחול כדי להתאים את סף הגילוי (threshold). כדי להוציא שיא זה, השתמש בשיא האפור של דגימת הביקורת כנקודת ייחוס. כאשר סף הגילוי בערוץ ה-PI מוגדר כראוי, לחץ על apply כדי לאשר ולחזור למסך הקודם; מכשיר הספירה ינתח מחדש את הנתונים באופן אוטומטי ויעדכן את התוצאות בלשונית הדגימה.בשלב הבא, כדי לאשר ויזואלית שכל תא שויך כראוי, לחצו על לשונית הזום (zoom), ולאחר מכן בחרו שדה ראייה שצולם לצורך סקירה על ידי לחיצה על התמונה הממוזערת. לאחר מכן, לחצו על לשונית השכבות (layers). בשלב הבא, לחצו על כפתור ה-GFP או ה-PI כדי להציג את התמונה שצולמה דרך ערוץ זה.לחץ שוב על אותו כפתור כדי להסיר את השכבה מהתצוגה, או כדי להלביש שכבות אחת על השנייה, גע בכפתורים המתאימים לכל ערוץ כדי לזהות כיצד נספרים התאים דרך ערוץ מסוים. מעגלים המקיפים תאים שנספרו רק דרך ערוץ השדה המואר (bright field), אשר אינם מבטאים פלואורסצנציה, יופיעו בצבע כחול. הדבר מעיד על כך שתא מסוים הוא תא חי המבטא סימן בערוץ הירוק.תאי GFP יסומנו במעגל ירוק כאשר הם מתבטאים בערוץ האדום. תאים שצבעו ב-pi יסומנו במעגל אדום והם תאים מתים שנספרים בשני הערוצים. תאים המופיעים בערוץ האדום והירוק יסומנו במעגל צהוב.דבר זה מעיד על כך שהתא מבטא GFP אך נצבע גם ב-pi ולכן הוא מת. מדי פעם יופיע עיגול שחור על המסך. אלו הם אובייקטים שזוהו אך הוצאו מהניתוח על בסיס גודל התא.המשיכו לדייק את סף החיתוך בהיסטוגרמת הפלואורסצנציה באמצעות השלבים שתוארו זה עתה, עד שכל תא המבטא פלואורסצנציה יסומן במעגל בצבע המתאים. כל פרמטרי הניתוח נשמרים באופן אוטומטי במכשיר, תחת לשונית הנתונים (data tap).המונה יכול לאחסן קבצי נתונים מ-500 הרצות דגימה. כל קובץ המאוחסן בלשונית הנתונים (data) זמין לניתוח חוזר. על ידי בחירת הקובץ מלשונית הנתונים, הוא ייפתח מחדש וכל ההיסטוגרמות והשכבות יהפכו לפעילות לצורך ארכוב נתונים והפקת דוחות.ניתן להעביר את הנתונים המאוחסנים במכשיר למחשב באמצעות התקן USB. ארבעה סוגי תאים מייצגים הועברו באמצעות קונסטרוקט ויראלי של GFP, חלבון פלואורסצנטי המכוון לגרעין התא, ונצבעו בערכת tally viability באמצעות ריאגנט dead cell red, ולאחר מכן נותחו באמצעות tally בציטומטר זרימה כפי שמוצג כאן. שתי השיטות דיווחו על אחוז דומה של האוכלוסייה עבור כל סוג תא שהביע GFP, לצד אחוז האוכלוסייה הכולל שהיה גם חיוני וגם מבטא GFP.נתונים אלו מדגימים כי הציטומטר Tali מסוגל להבחין בין ביטוי GFP כולל באוכלוסייה לבין ביטוי GFP באוכלוסיית התאים החיים. הדגמנו כעת כיצד להשתמש בציטומטר Tali מבוסס תמונה כדי להעריך ביטוי פלואורסצנציה וחיוניות בדגימת התאים שלכם. טכנולוגיה זו מגשרת על הפער בין מחקרי תאים בודדים למחקרי אוכלוסיות תאים.באמצעות הציטומטר המבוסס על דימות של tally, ניתן לאסוף מידע חזותי כמותי ואיכותי על תאים בודדים וכן על אוכלוסיות תאים גדולות יותר. באמצעות אותו הליך, ניתן לבצע מספר בדיקות נוספות, כולל אפופטוזיס, ביטוי RFP וחיוניות תאים. עבור תאים שאינם מבטאים, היישומים הפוטנציאליים כוללים הערכת ביטוי גנים ועד למחקרים על יעילות תרופות.

assessment-gfp-expression-viability-using-tali-image-based

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדווחים על שיטה הקדמה, מעקב וניתוח כמותי של ה-GFP ביטוי בתאי הצמח. שיטה זו משתמשת מערכת אישית מעוצבת רובוטיקה לאיסוף חצי תמונה רציפה של מספר גדול של דגימות, לאורך זמן. אנחנו גם מדגימים את השימוש ImageJ ו ImageReady ניתוח של סדרת תמונות.

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

פרוטוקול לניתוח של מחזור תא...

ניתוח מחזור תא חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות באמצעות התמקדות Cytometer אקוסטית לכוונן וה-DNA ויולט Vybrant DyeCycle כתם

המוני רקמות מורכבים, מאיברים לגידולים, מורכבים מאלמנטים הסלולר שונים. אנו הובהר התרומה של פנוטיפים הסלולר בתוך רקמת ניצול עכברים הטרנסגניים ניאון רב שכותרתו בשילוב עם מכתים immunofluorescent multiparameter אחרי unmixing רפאים לפענח מוצא תא, כמו גם מאפייני תא המבוססים על ביטוי חלבון.

כמותיים Multispectral ניתוח בעקבות השתלת רקמות פלורסנט וליזואליזציה של מקורות ניידים, סוגים, ואינטראקציות

הנה, אנחנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בcytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח בתרבות. טכניקה זו יכולה לשמש כאלטרנטיבה לספירת CFU.

שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

מוצגים הוא עבודה אינפורמטיקה גמישה המאפשרת ניתוח מבוסס תמונת ריבוב של תאים שכותרתו fluorescently. העבודה מכמתת סמנים גרעיניים וcytoplasmic ומחשבה טרנסלוקציה סמן בין תאים אלה. נהלים מסופקים ההפרעות של תאים באמצעות siRNA ומתודולוגיה אמינה לגילוי סמן על ידי immunofluorescence העקיף בפורמטי 96-היטב.

זרימת עבודה עבור גבוהה תוכן, כימות תא יחידה של פלורסנט סמנים מUniversal מיקרוסקופים נתונים, הנתמכים על ידי תוכנות קוד פתוחות

ברמה התת-תאית, אירועי איתות מווסתים באופן דינמי על ידי רמזים התפתחותיים וסביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת הביטוי החולפת של הטבק כדי לנטר אינטראקציה דינמית של חלבון-חלבון ולחשוף ארגון מרחבי של העברת אותות בתאי צמחים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

אנו מציגים ניתוח תוכן בקוד פתוח גבוה (HCA) מכשיר ניצול הדמית חי קרינה אוטומטי (FLIM) עבור assaying אינטראקציות חלבון באמצעות תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג) readouts המבוסס. רכישת נתונים עבור מכשיר openFLIM-HCA זו נשלטת על ידי תוכנות שנכתבו ב μManager וניתוח נתונים מבוצע FLIMfit.

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

הדמיה לחיות תאים מספק שפע של מידע על תאים בודדים או באוכלוסיות שלמות כי הוא בלתי ניתן להשגה על-ידי תא קבוע הדמיה לבד. כאן, מתוארים פרוטוקולי הדמיה לחיות תאים כדי להעריך את החלטות גורל התא לאחר הטיפול עם פקליטקסל סמים אנטי mitotic.

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

אנו מתארים פרוטוקול למדידת מגעים בין תאים בשכבות אפיתל סמוכות בדיסקים דמיוניים חיים של כנפי דרוזופילה באמצעות גישה מבוססת בנייה מחדש של GFP.

מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת GFP להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה

למדו הערכת כדאיות תאים וביטוי GFP באמצעות ציטומטר מבוסס תמונה Tali. שיטה זו מאפשרת ניתוח אוכלוסיות תאים עם נתונים כמותיים וויזואליים במקביל.

הערכת הביטוי GFP ואת הכדאיות שימוש Cytometer תמונה מבוסס טלי

גלה סרטונים נוספים