הערכת הביטוי GFP ואת הכדאיות שימוש Cytometer תמונה מבוסס טלי

סרטון זה מדגים הליך לקביעת כדאיות התאים בתאים המבטאים GFP באמצעות הציטומטר מבוסס תמונת המספר. תאים מתמרים GFP מוכתמים באמצעות ערכת כדאיות הספירה תא מת אדום, אשר מכתים את כל התאים המתים באדום עם יודיד פרופידיום, התאים מוכנסים לשקופית ניתוח תאים ונטענים לתוך הציטומטר, אשר רוכש ומנתח תמונות פלואורסצנטיות בהירות ואדום וירוק. לאחר מכן נוצרות היסטוגרמות כדי להציג את ספירת התאים, גודל התא, עוצמת הקרינה PI ועוצמת הקרינה GFP בהשוואה לציטומטריית זרימה מסורתית.

טלי יכולה לספק נתונים דומים לגבי כדאיות התאים וביטוים. עם זאת, ציטומטריה מבוססת תמונה זו מספקת מידע חזותי נוסף על אוכלוסיית התאים הנבדקת. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הוא שהציטומטר המבוסס על תמונת טלי מספק מידע כמותי וחזותי בו זמנית על דגימת התא שלך.

בנוסף, מכשיר הספירה קל יותר לשימוש, זול יותר ובעל טביעת רגל קטנה יותר מאשר ציטומטר זרימה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זה מאפשר לחוקרים לבצע במהירות בדיקות כמותיות כמו כדאיות בתאים המבטאים GFP על הספסל. בהליך זה, תאי U2 OS בריכוז של 1 פעמים 10 לששת התאים למיליליטר הומרו עם מבנה ויראלי GFP אור תא ממוקד גרעיני כדי לקיים תאים מתים עם העברת פרופידיום יודיד 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש.

שימו לב שריכוז של אחד כפול 10 עד החמישי עד אחד כפול 10 לתאים השביעיים למיליליטר מומלץ לבדיקה, אם כי הריכוז לא חייב להיות מדויק. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של מגיב אדום של תאים מתים. לאחר מכן מערבולת קצרה לערבוב, דגירה על מגיב הצביעה ותערובת התאים בטמפרטורת החדר בחושך למשך דקה עד חמש דקות.

לאחר הדגירה, המשך מיד לניתוח על הציטומטר המבוסס על תמונת טלי. הספירה משתמשת בשקופיות ניתוח סלולריות חד פעמיות מפלסטיק שתוכננו במיוחד עבור המכשיר. הקפד תמיד להחזיק את השקופית בקצוות כדי לטעון את השקופית.

פיפטה 25 מיקרוליטר של דגימה לאט לתוך אחד מאזורי טעינת הדגימה בצורת חצי ירח. כאן, תאי בקרה לא מוכתמים נטענים בתא A ותאי ביטוי ה-GFP המוכתמים נטענים בתא B.To לבצע בדיקת כדאיות בתאים המבטאים GFP, לגעת ב-G-F-P-R-F-P במסך הבית של הציטומטר. אפשרויות הבדיקה יופיעו לאחר מכן בצד ימין בחר GFP פלוס כדאיות.

לאחר מכן המכשיר ישאל אם יש לקרוא לסדרת הדגימה כדי לתת שם לסדרת הדגימות. לחץ על שם עכשיו. לאחר מכן, באמצעות מסך המגע, הקלד את שם סדרת הדוגמאות ולחץ על שמור, ציטומטר המספרים יתקדם אוטומטית למסך המדידה.

לאחר מכן, כדי למדוד את הקרינה ברקע, לחץ על לשונית הרקע בחצי הימני התחתון של מסך המדידה כפי שניתן לראות כאן. הגדרת ברירת המחדל מציינת שתשעה שדות תאים יוצגו בהדמה. כעת, כאשר דגימת הבקרה פונה הרחק מהמכשיר, הכנס את השקופית ליציאת הטעינה עד שהיא נעצרת.

אל תפעיל כוח על מסך הרקע לחץ על מגע כדי להכניס פקד תא חדש לא מוכתם. השקופית תימשך אוטומטית לתוך המכשיר ותמונה חיה של התאים תוצג על המסך. באמצעות כפתור המיקוד, הביאו את התאים למישור הראייה הנכון תוך כדי מיקוד.

החלק את לחצן הזום האדום לארבע x או 16 x. כדי לראות טוב יותר את אוכלוסיית התאים, התאים צריכים להיות כהים באופן אחיד עם הילה בהירה סביב כל אחד מהם. כפי שמוצג כאן, תאים עשויים להיות לא נספרים כאשר המעבר בין הרקע לקצוות התאים מטושטש כך שגבולות התא אינם מוגדרים היטב.

תאים עשויים להיספר יתר על המידה כאשר יש להם מרכזים בהירים והיקפים כהים. לאחר שהתאים הובאו למיקוד, גע, לחץ כדי להפעיל בקרת תאים לא מוכתמת. כדי למדוד את הקרינה ברקע, הציטומטר יצלם תמונות באופן אוטומטי ויציג תמונות ממוזערות של כל שדה ראייה.

סרגל ההתקדמות מספק עדכון שוטף של הניתוח. לאחר השלמת לכידת התמונה, הציטומטר מוציא אוטומטית את השקופית ומספק את הנתונים מניתוח התמונות שצולמו. נתונים מאוחסנים מוצגים בתפריט הנפתח של כרטיסיית הרקע.

לדגימת בקרת הרקע יוקצה שם זהה לזה שניתן לניסוי. כדי להפעיל את הדגימה המוכתמת של GFP המוכתמת PI, הסר את השקופית מהמכשיר, הפוך אותה והכנס אותה מחדש כשהדגימה המומרת פונה הרחק מהמכשיר. לחץ על הכרטיסייה דוגמה ולאחר מכן גע בלחץ כדי להוסיף דוגמה חדשה.

כאשר התמונה מופיעה על המסך, השתמש בכפתור המיקוד כדי להביא את התאים למיקוד. כמו קודם, לאחר מכן גע בלחץ כדי להפעיל את הדגימה. לאחר השלמת לכידת התמונה, הנתונים מהניתוח מופיעים תחת הכרטיסייה לדוגמה והציטומטר מוציא את השקופית באופן אוטומטי כראוי.

השלך את שקופית הניתוח הסלולרית של הספירה. כפסולת מסוכנת ביולוגית, לא ניתן לעשות שימוש חוזר בשקופיות אלה. לאחר הפעלת הדגימה, ניתן להחיל ספים על המדגם.

כדי לנתח אוכלוסיות תאים ספציפיות כאן, נתאים את הספים כדי לקבוע את אחוז התאים החיים והמתים. בתאים המבטאים GFP תחת לשונית המדגם, מספר ואחוז התאים המבטאים GFP תאים חיים ומתים המבטאים את הכדאיות הכוללת של GFP. גודל תא ממוצע, מספר תאים שנספרו וריכוז התאים מוצגים.

בנוסף, תרשימי היסטוגרמה המציגים את גודל התא, פלואורסצנטיות ירוקה ופלואורסצנטיות אדומה מוצגות בתחתית המסך. כדי להגדיר את שער גודל התא, גע בתמונה הממוזערת של גודל התא כדי לפתוח את ההיסטוגרמה של גודל התא כדי לא לכלול פסולת. הזז את פסי המחוון הכחולים כדי לא לכלול אירועים גדולים וקטנים כאחד.

גע ב- Apply כדי לכלול את התאים בתוך השערים. לאחר מכן כדי להוסיף את הקרינה של GFP לניתוח, גע בתמונה הממוזערת של ההיסטוגרמה של GFP. כדי לפתוח אותו.

הזז את פס המחוון הכחול כדי להגדיר את הסף מימין לשיא העמום ביותר. השתמש בדוגמת הבקרה כמדריך. זה מאפשר לניתוח לכלול את התאים החיוביים של GFP, אך לא לכלול תאים אוטו-פלואורסצנטיים.

אוטופלואורסצנציה נצפית לעתים קרובות כאשר מולקולות ביולוגיות בתוך תאים נמצאות במגע אקסל להחיל כדי לאשר ולחזור למסך הקודם. הנתונים המוצגים תחת הכרטיסייה לדוגמה אמורים כעת לשקף את השערים והסף שנקבעו עבור שני ערוצי הקרינה. לאחר מכן, כדי להפריד את תאי הצביעה PI מאוטופלואורסצנציה או כל רקע הקיים בדגימה, לחץ על התמונה הממוזערת של היסטוגרמה PI כדי לפתוח אותה שוב.

שיא דגימת הבקרה יוצג כשיא אפור בהיסטוגרמה. השיא האדום הוא הקרינה של הדגימה. הקרינה ברקע מוצגת כשיא הקרוב ביותר לערך ה-RFU האפס במכשיר זה.

כדי לבטל את הקרינה ברקע בערוץ PI, הזז את פס המחוון הכחול כדי לכוונן את הסף. כדי לא לכלול שיא זה, השתמש בשיא האפור מדגימת הבקרה כהפניה. כאשר הסף בערוץ PI מוגדר כראוי, גע בהחלה כדי לאשר ולחזור למסך הקודם, מכשיר הספירה ינתח מחדש את הנתונים באופן אוטומטי ויעדכן את התוצאות בכרטיסיית הדגימה.

לאחר מכן, כדי לאשר חזותית שכל תא מוקצה כהלכה, לחץ על הכרטיסייה זום ולאחר מכן בחר שדה ראייה שנלכד לסקירה על ידי לחיצה על התמונה הממוזערת של התמונה. לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה שכבות. לאחר מכן, לחץ על כפתור GFP או PI כדי להציג את התמונה שצולמה דרך ערוץ זה.

לחץ שוב על אותו כפתור כדי להסיר את השכבה מהתצוגה או כדי להניח שכבות, לחצני מגע המתאימים לכל ערוץ כדי לזהות כיצד התאים נספרים דרך ערוץ מסוים. מגע מעגל התאים שנספרו רק דרך ערוץ השדה הבהיר, שאינם מבטאים פלואורסצנטיות, יהיו מוקפים בעיגול כחול. זה מצביע על תא מסוים שהוא תאים חיים המתבטאים בתעלה הירוקה.

GFP יהיה מוקף בתאים ירוקים המתבטאים בערוץ האדום. מוכתמים בפאי יהיו מוקפים בעיגול אדום והם תאים מתים שנספרים בשניהם. הערוץ האדום והירוק יהיה מוקף בצהוב.

זה מצביע על כך שהתא מבטא GFP אך גם מוכתם ב-pi ולכן הוא מת. מדי פעם יופיע עיגול שחור על המסך. אלה אובייקטים שזוהו אך לא נכללו בניתוח על סמך גודל התא.

המשך לכוונן את הסף בהיסטוגרמה הקרינה באמצעות השלבים שתוארו זה עתה עד שכל תא המבטא פלואורסצנטי מוקף בעיגול בצבע המתאים. כל פרמטרי הניתוח נשמרים אוטומטית במכשיר. תחת הנתונים, הקש על

הספירה יכולה לאחסן קבצי נתונים מ-500 ריצות לדוגמה. כל קובץ המאוחסן בכרטיסיית הנתונים זמין לניתוח מחדש. על-ידי בחירת הקובץ מלשונית הנתונים, הוא ייפתח מחדש וכל ההיסטוגרמות והשכבות יהפכו לפעילות כדי לאחסן נתונים בארכיון ולהפיק דוחות.

הנתונים המאוחסנים במכשיר עשויים להיות מועברים למחשב באמצעות כונן USB. ארבעה סוגי תאים מייצגים הומרו עם אור תא ממוקד גרעיני, מבנה ויראלי GFP צבוע בערכת כדאיות ספירה באמצעות מגיב אדום של תאים מתים ונותח על ידי הספירה בציטומטר זרימה כפי שמוצג כאן. שתי השיטות דיווחו על אותו אחוז מהאוכלוסייה עבור כל סוג תא שביטא GFP, יחד עם האחוז מכלל האוכלוסייה שהיו גם ברי קיימא וגם ביטאו GFP.

נתונים אלה מוכיחים כי הציטומטר של טלי מסוגל להבחין בין ביטוי GFP כולל באוכלוסייה לבין ביטוי GFP באוכלוסייה החיה. זה עתה הדגמנו כיצד להשתמש בציטומטר מבוסס תמונת טלי כדי להעריך את ביטוי הקרינה והכדאיות בדגימת התא שלך. טכנולוגיה זו מגשרת על הפער בין מחקרי תאים בודדים לאוכלוסייה.

באמצעות הציטומטר מבוסס תמונת הספירה, אתה יכול לאסוף מידע חזותי כמותי ואיכותי על תאים בודדים כמו גם אוכלוסיות תאים גדולות יותר. באמצעות אותו הליך, ניתן לבצע מספר בדיקות נוספות כולל אפופטוזיס, ביטוי RFP וכדאיות תאים עבור תאים שאינם מבטאים את היישומים הפוטנציאליים כוללים הערכת ביטוי גנים למחקרים על יעילות התרופות.