בידול יעיל של תאים עכבר גזע עובריים לתוך הנוירונים המנוע

המטרה הכוללת של הליך זה היא להבדיל תאי גזע עובריים של עכברים לנוירונים מוטוריים. עכבר תרבית ראשון, תאי גזע עובריים על פיברובלסטים עובריים ראשוניים של עכברים, ותוספת עם גורם מעכב לוקמיה. לאחר מכן שפר את תהליך הנורמליזציה על ידי הוספת noggin BFG F ו-FGF שמונה מפרט נוירונים מוטוריים על ידי דגירה עם חומצה רטינואית ואגוניסט מוחלק, שלאחריו התארכות אקסון והתבגרות נוירונים מוטוריים.

לבסוף, השתמש במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית כדי לבחון תאי MES מובחנים המבטאים פלואורסצנציה חזקה של GFP יצירת כמויות גדולות של נוירונים מוטוריים הקלה על מחקר במחלות נוירונים מוטוריים בהשוואה לפרוטוקולים הקיימים כיום. גישה זו של התמיינות תאי גזע עובריים של עכברים לנוירונים מוטוריים יעילה יותר. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ניוון שרירים בעמוד השדרה.

ניתן ליישם אותו גם על מחלות נוירונים מוטוריות אחרות כגון טרשת אמיוטרופית צידית לצלחת פיברובלסטים עובריים ראשוניים של עכברים מצפים ארבעה, 100 מילימטר צלחות תרבית רקמה עם שמונה מיליליטר של תמיסת ג'לטין של 0.1%. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, השליכו את עודפי הנוזלים. כעת יש לדלל בקבוקון אחד של מיטומיצין C ב-PMEF מופעל ל-40 מיליליטר של לוחית מדיה PMEF על ארבע הצלחות ולתרבית עד שבוע.

לאחר מכן, הפשירו בקבוקון אחד של תאי MES באמבט מים של 37 מעלות. שוטפים את התאים עם חמישה מיליליטר של מדיה E ES בצינור של 15 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה ב 800 סל"ד למשך חמש דקות.

שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש תאי MES ב-20 מיליליטר של מדיה ES עם גורם מעכב לוקמיה שנוסף לאחרונה. המשך להסיר מדיה של 10 מיליליטר מתרביות ה-PMEF והחלף ב-10 מיליליטר של תרחיף תאי HBG שלושת תאי ES. עקוב אחר התקדמות תאי MES לאורך זמן ממושבות קטנות ב-24 שעות למושבות בקוטר של כ-100 מיקרומטר ב-72 שעות לאחר הציפוי.

החלף מדיה מדי יום כדי לשמור על שגשוג תאים לאינדוקציה של תאי MES. התמיינות לנוירונים מוטוריים. תחילה יש להפריד את תאי הגזע העובריים של העכבר מתאי ההזנה של PMEF ולאחר מכן לגדל אותם בסביבת השעיה ביום האינדוקציה.

לכל תרבית ES של 100 מילימטר, הכינו בקבוק T אחד 50 מצופה בג'לטין 0.1% לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, הסירו את עודפי הג'לטין ושטפו שלוש פעמים עם PBS. המשיכו לשאוב בזהירות את התקשורת מתרבות ה-ES, והקפידו לא לעקור מושבות מחוברות באופן רופף. לאחר מכן יש לשטוף פעם אחת עם 10 מיליליטר PBS.

כעת כדי להפריד בין תאי MES ל-PMEF, הוסף שלושה מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA ודגר למשך שלוש עד חמש דקות. בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ודא שתאי הגזע וה-PMEF התנתקו מהצלחת. לאחר מכן הוסף 15 מיליליטר של מדיה ES טרייה ושבש מושבות על ידי פיפטינג.

העבירו את תרחיף התאים לתוך דגירה מצופה ג'לטין T אחד 50 בקבוק למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי ש-PFS יתחבר למשטח הג'לטיני. כעת קצרו את תאי ה-MES הצפים בצינור של 50 מיליליטר וגלולה על ידי צנטריפיקציה. השעו מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של התמיינות עצבית.

בינוני סופר באמצעות ציטומטר המו ולאחר מכן צלחת על צלחת תרבית תרחיף 100 מילימטר על התמיינות. ביום הראשון, ודא במיקרוסקופיה שתאי MES יצרו אגרגטים צפים קטנים הנקראים גופים עובריים. מכיוון שכל PMEF מועבר המחובר לצלחת, העבירו את תאי המתלה והמדיה של ES לצינור של 15 מיליליטר, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-500 סל"ד למשך שלוש דקות.

כדי לקצור את הגופים העובריים שואבים מאמצעי זהירות מוסיפים בזהירות 10 מיליליטר של התמיינות עצבית טרייה, מדיום ל-ebs הגלולי, ולאחר מכן תאי צלחת בתרבית צלחת חיידקים חדשה למשך 24 שעות על התמיינות. ביום השני, סובבו את צלחת התרבית והעבירו את המדיה וה-EBS לתוך שפופרת של 15 מיליליטר. תן ל-EBS להתיישב על ידי כוח הכבידה, ואז שאב מהמדיום בזהירות והשהה מחדש את EBS ו-10 מיליליטר של התמיינות נוירונים מוטוריים.

תרבית בינונית EBS בצלחת חיידקים חדשה למשך חמישה ימים על התמיינות. ביום השביעי, ודא שקוטרו של EBS הוא כ-150 עד 200 מיקרומטר ומבטא אותות GFP חזקים בהתמיינות. ביום החמישי, יומיים לפני ניתוק EBS, הנח פתקי כיסוי עגולים של 12 מילימטר על תחתית צלחת 24 בארות.

לאחר מכן מוסיפים 0.5 מיליליטר של 100 מיקרוגרם למיליליטר, פולי DL אורניתין, ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. שאפו את הפלטות היבשות באוויר poly DL ornithine והחלקות כיסוי במכסה המנוע של תרבית רקמות. שוטפים את בארות הצלחת במים מזוקקים כפולים שלוש פעמים.

תן לאוויר להתייבש לציפוי החלקות הכיסוי. בצע דילול טרי של שני מיקרוגרם למיליליטר למינין עכבר בחמישה מיליליטר של קר קר אחד XPBS. מוסיפים 0.5 מיליליטר לבאר ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

שטפו פעמיים עם PBS על בידול. ביום השביעי, אספו את ה-EBS לתוך צינור של 15 מיליליטר ואפשרו ל-EBS להתיישב על ידי כוח הכבידה. לאחר ארבע כביסות עם PBS, הוסיפו מיליליטר אחד של ACU max ל-EBS ערבבו בעדינות ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שאפו עודפי ACU max המכסה את ה-EBS.

כעת הוסף שלושה מיליליטר של מדיום MND ונתק את EBS על ידי פיפטינג כ-20 פעמים באמצעות מיקרו פיפטה של מיליליטר אחד, ואז דגירה למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, העביר את תרחיף התא דרך מכסה מאמן תאים לתוך צינור בגודל 12 על 75 מילימטר. חזור על שלב דיסוציאציה זה עם הגושים והתאים הנותרים שנשמרו על ידי המסנן כדי להעשיר את התפוקה של תאים בודדים בתרחיף תא בודד סופי של שישה מיליליטר. מערבבים בעדינות את תאי ההשעיה והספירה של התאים הבודדים באמצעות תאים מדוללים של המו ציטומטר למדיום MND שלם לצפיפות של שניים כפול 10 לתאים החמישיים לצלחת מיליליטר.

מתלה תאים של 0.5 מיליליטר לבאר של 24 לוחות הבאר המוכנים המכילים החלקות כיסוי מצופות למינין פולי DL. התאים הממוינים מרחיבים נויריטים ארוכים לאחר יומיים. בתרבית, HBG 3 הוא קו תאי ES שמקורו בעכבר טרנסגני המבטא EGFP תחת שליטת מקדם ספציפי לנוירון מוטורי HB 9 עם פרוטוקול התמיינות מוגדר.

ניתן להשתמש בתאי MES כדי להפיק נוירונים מוטוריים. תאי ה-MES הלא ממוינים יוצרים מושבות עגולות על גבי שכבת הזנת פיברבלסטים. יש להם ביטוי GFP חלש.

תאי MES אלה הופרדו משכבות ההזנה וגודלו על צלחות הצמדה נמוכות ליצירת גופים עובריים. תאי MES מובחנים ביטאו פלואורסצנטיות GFP חזקה לאחר היום השביעי. התמיינות EBS הייתה מנותקת ומצופה על לוחות מצופים למינין פולי DL אורניתין.

התאים הממוינים מרחיבים נויריטים ארוכים מגופי התאים של התאים המצופים לאחר יומיים בתרבית, ניתן לאפיין את הנוירונים המוטוריים שמקורם בתאי MES על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית. תאים חיוביים אלה של GFP מבטאים את הנוירופילמנט של הסמן הפאן-עצבי ואת שני הסמנים הספציפיים לנוירונים המוטוריים. עפעף אחד וכולין אצטיל טרנספראז DPI מכתימים את הגרעינים שנלקחו יחד.

פרוטוקול ההתמיינות הדו-שלבי שלנו מספק דרך יעילה להבדיל תאי MES לנוירונים מוטוריים בעמוד השדרה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין כיצד להבדיל ביעילות תאי גזע עובריים של עכברים לנוירונים מוטוריים. לסיכום, זכרו שתכונות גבוהות של תאי גזע עובריים של עכברים הן הפרמטר הקריטי ביותר ליצירת נוירונים מוטוריים ביעילות.