ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

לנתח את המנגנונים התאיים של הפנמה של ננו-חלקיקים וחיידקים על ידי ציטומטריית זרימה מולטי-ספקטרלית. מקרופאגים מטופלים תחילה ב-cyto klain D כדי לעכב פילמור אקטין. ננו-חלקיקים או סלמונלה מתווספים למקרופאג, חד-שכבתיים ומודגרים.

לאחר מכן המקרופאגים נקצרים, מקובעים ומתויגים לניתוח באמצעות זרם תמונה. תאי ציטומטר זרימת הדמיה מולטי-ספקטרלית שיש להם ננו-חלקיקים מופנמים ו/או סלמונלה נבדלים מאלה עם ננו-חלקיקים קשורים למשטח ו/או סלמונלה. הנתונים המתקבלים מצביעים על כך שגם סלמונלה וגם ננו-חלקיקים מופנמים רק על ידי תאים שלא טופלו בציטו קליין.

D המרמז על כך שהפנמה תלויה באקטין. לטכניקה זו מספר יתרונות על פני שיטות קיימות כגון ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה קונפוקלית. בעיקר, הוא מספק מדידה מדויקת של עוצמות אות פלואורסצנטיות ורזולוציה מרחבית בין תכונות סלולריות שונות במהירות גבוהה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הן עבור מחקר חיסונים ביו-חומרים והן עבור מחקר אספקת תרופות, כמו גם שורה של מחקרי אינטראקציה עם פתוגנים. זה כולל תיחום מסלולי ההפנמה המשמשים ננו-חלקיקי פולי אנהידריד וחיידקים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו נאבקים לעתים קרובות.

חשוב להקדיש זמן לטיטרציה של הצבעים על מנת לקבל אותות פלואורסצנטיים אופטימליים. כמו כן, היכרות עם התוכנה ויצירת תבניות ניתוח לוקחת זמן. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר גילינו שננו-חלקיקי פולי הידרו מציגים מאפיינים של חיקוי פתוגן תוך שימוש במיקרוסקופיה וטכניקות אחרות.

לאחר מכן רצינו מערכת תפוקה גבוהה כדי להשוות את תהליכי ההפנמה המשמשים את הסלמונלה ואת ננו-חלקיקי האבקה הידריד לפני ביצוע הבדיקה. יש לקצור את כל תרביות תאי היונקים והחיידקים ולהכין תרחיפי ננו-חלקיקים. התחל בקצירת תאי RA W2 64.7 קונפלואנטים באמצעות מגרד תאים.

קבע את מספר התא באמצעות ציטומטר המו. לאחר מכן צלחו את התאים בצלחת תרבית של 24 בארות בצפיפות של חמש פעמים 10 עד התאים החמישיים לבאר ב -0.5 מיליליטר. דגירה מלאה של DMEM למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ואינקובטור של 5% CO2.

כדי להכין את הסלמונלה טריקה, יש לדלל טרנספורמציה סלמונלה ב- C-D-M-E-M כדי להשיג ריבוי זיהום של מאה לכל RA W2 64.7 תאים בצינור תרבית זכוכית מכסה בורג 16 על 125 מילימטר. לאחר מכן, באמצעות נייר מי גבינה מעוקר, שקלו חמישה מיליגרם של ננו-חלקיקי פולי אנהידריד טעונים 1% FITC שנוצרו כפי שתוארו על ידי עמיתיהם בשנת 2009 במחקר התרופות שלהם בצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הוסף את הננו-חלקיקים ל-0.5 מיליליטר של מי מלח חוצץ פוספט קר, והניח אותו על קרח.

שמירה על הצינור על קרח. השתמש במעבד נוזלי קולי עם קצה מיקרו כדי לסוניזציה של המתלה למשך כ-25 שניות בארבעה עד שישה ג'אול. כעת, כשכל התאים והריאגנטים הדרושים מוכנים, ניתן לבצע את בדיקת הפגוציטוזיס.

תווית 24, צלחות תרבית רקמות באר המכילות תאי RA W2 64.7 מתורבתים כהכנה לבדיקה בצלחת הראשונה. כל אחת מהדגימות הבאות תיבדק במשולש, ציטו ו-D עם ננו-חלקיקים, ציטו ו-D עם סלמונלה, מדיום עם ננו-חלקיקים, מדיום עם ננו-חלקיקי סלמונלה בלבד, סלמונלה בלבד, ו-AF שישה תאי כתמים של 60 מעלות צלזיוס בלבד ייבדקו בצלחת השנייה ויכללו מדיום פלוס ננו-חלקיקים ומדיום פלוס סלמונלה דגירה בטמפרטורה נמוכה זו, תהליכים תאיים איטיים כגון פגוציטוזיס שעה לפני הזירוז. הוסף חמישה מיקרוגרם למיליליטר ציטו ו-D ו-C-D-M-E-M לבארות המתאימות ודגר את התאים ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, מערבל את תרחיף הננו-חלקיקים והוסף 10 מיקרוליטר לבארות המתאימות. לאחר מכן מערבלים את הסלמונלה ומוסיפים אותה לבארות המתאימות ב-MOI של 100. הקש על הצלחת כמה פעמים כדי לערבב.

לאחר מכן הניחו את לוחות הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס ואת לוחות הבקרה השליליים ב-4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לאחר הדגירה, הניחו את הצלחות על קרח, שטפו את התאים פעמיים עם PBS קר כקרח ללא סידן ומגנזיום על ידי שאיבה והשלכה של המדיום הישן להסרת חלקיקים לא קשורים, סלמונלה ותאים מתים או מנותקים. שימוש במגנזיום עלי כותרת.

Pre PBS בשלב זה חיוני מכיוון שהוא מקל על ניתוק התאים מהמצע כדי לקצור את התאים, הוסף 250 מיקרוליטר PBS קר כקרח וגרד בעדינות את הבארות, פיפטה את התאים שנקטפו לצינורות מיקרו צנטריפוגות עם מכסה סיליקון ושמור אותם על קרח. שטפו את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר שטיפה קרה, ואז צנטריפוגה ב -250 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, הסר את המאגר הנותר על ידי הקשה על צינור המיקרו צנטריפוגה ההפוך על הנייר.

מגבת תלתה מחדש את כדור התא על ידי גריפה עדינה של צינור המיקרו צנטריפוגה על פני מתלה מבחנה. כדי לתקן את התאים, הוסף 100 מיקרוליטר של 4%para פורמלדהיד ב-PBS ואפשר לתאים לעמוד במשך 15 דקות. בטמפרטורת החדר יש לשטוף את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר שטיפת סלסול, ואז צנטריפוגה ב -250 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר השלכת הסופרנטנט, הסר את המאגר הנותר כמו קודם. לאחר מכן לצבוע את תאי RA W2 64.7. עבור אקטין, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר שטיפת סלסול המכיל Alexa Fluora foid בשש 60 למשך 15 דקות.

בטמפרטורת החדר, יש לדגור את הדגימות הלא מוכתמות בסלסול, לשטוף מאגר ללא פין. לאחר הצביעה, יש לשטוף ולצנטריפוגה שוב את התאים, ואז להשהות אותם מחדש ב-50 מיקרוליטר PBS המכילים 1% PFA ולאחסן אותם בחושך בארבע מעלות צלזיוס עד לרכישה. הפעל, הזרם תמונות והפעל.

עורר השראה ואתחל את הנוזלים בתפריט הקבצים. בחר טען תבנית ברירת מחדל. בגלריית התמונות, הצג תפריט, בחר הכל ולחץ על הפעל הגדרה כדי להתחיל לדמות את החרוזים במידת הצורך, התאם את מעקב הליבה כדי למרכז תמונות לרוחב.

בחרו בערוץ השדה הבהיר ולחצו על קביעת עוצמה. המתן עד שמקדם השינוי של מהירות הזרימה יהיה נמוך באופן עקבי מ-0.2%בכרטיסיית הסיוע, לחץ על התחל הכל כדי להפעיל כיולים ובדיקות ולוודא שכולם עברו בתוכנה. לחץ על טען מדגם.

לאחר מכן, כאשר תתבקש לעשות זאת, הנח את הבקבוקון המכיל את הדגימה הבהירה ביותר. עם כל הפלואורוכרומים במעמיס הדגימה, בחר הגדלה של פי 40. לאחר קביעת הגדרות המכשיר, אל תשנה אותן במשך כל הניסוי.

הפעל כל לייזר בניסוי על ידי לחיצה על סמלי הלייזר בתוכנה והגדר את עוצמת הלייזר כך שלכל פלואורוכרום יש ערכי פיקסלים מקסימליים בין 104,000 ספירות, כפי שנמדד בתרשים הפיזור. כדי למנוע איסוף של אובייקטים לא רצויים, לחץ על חלון מסווג התאים בתוכנה. לאחר מכן כדי לאסוף רק נתוני תאים, בחר את ערוץ הגבול התחתון של האזור אחד עבור שדה בהיר, והגדר את הערך ל-50 מיקרומטר אובייקטים עם שטח של פחות מ-50 מיקרומטר ייחשבו לפסולת ולא יירכשו.

בחר ערוצים לאיסוף על ידי לחיצה על סמלי הערוצים המתאימים בתוכנה כאן. ערוצים 1, 2, 3, 4, 5 ו-6 נבחרים תחת לשונית ההגדרה. הזן את מספר הקובץ ואת תיקיית היעד.

הגדר את מספר הרצף ל-1 ואת מספר האירועים שיש לרכוש ל-5,000. לחץ על הפעלה, רכוש כדי לאסוף ולשמור את קובץ נתוני הניסוי הראשון. לחץ על FLL והפעל את הדוגמה הניסיונית הבאה.

חזור על הפעולה עד שכל דגימות הניסוי נאספו. לאחר מכן, כדי להפעיל את הפקדים, לחץ על הגדרות comp. זה יכבה את השדה הבהיר ויפזר את הלייזר ויאפשר איסוף של כל ערוצי הקרינה מתחת ללשונית הרכישה.

שנה את ערך הקלט ל- 500. לאחר מכן הנח את צינור הבקרה ולחץ על הפעל. רכוש כדי לאסוף 500 תאים חיוביים בבקרות מוכתמות בודדות.

חזור על כל פלואורוכרום בניסוי כדי לפתח מטריצת פיצוי. לאחר שכל התמונות לדוגמה נרכשו, הפעל את תוכנת ניתוח הרעיונות במחשב ניתוח נפרד על ידי לחיצה כפולה על סמל הרעיונות בשולחן העבודה. לחץ פעמיים על אשף ההפנמה וטען את אחד מקבצי ה-RIF לדוגמה של הבדיקה.

חלון מוקפץ יספק הוראות לטעינת קבצי הבדיקה. עקוב אחר ההוראות ולחץ על הכפתור הבא. לאחר מכן, לחץ על מטריצה חדשה.

פעולה זו תפעיל את אשף הפיצוי. כשתתבקשו, בחרו בקובצי הנתונים של פקדי הצבע היחיד כדי להוסיף אותם. לחץ על הבא באשף בהתאם להוראות עד שקובץ מטריצת הפיצוי יישמר וייטען בתיבה בשלב השני של אשף ההפנמה.

לחץ על הבא ופעל לפי ההוראות עד ליצירת קובץ DAF. קבעו מאפייני תצוגת תמונה באמצעות בחירת ערוצי התמונה שנעשה בהם שימוש במהלך הרכישה. לחץ על ערוץ 2 עבור FITC ועל ערוץ 5 עבור AF 60.

שדה בהיר ופיזור צדדי נבחרים כברירת מחדל. בחר את ערוץ Brightfield O אחד ליצירת גבול התא ואת הערוץ O2 שבו נאספו ננו-חלקיקים או חיידקים עבור הגשושית המופנמת כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים הבודדים, נוצרת עלילת פיזור של שטח שדה בהיר לעומת יחס גובה-רוחב של שדה בהיר של כל התאים. ניתוח תפוקה גבוהה של קובצי נתונים מרובים דורש קובץ תבנית, ולכן יש חשיבות קריטית להגדיר בקפידה את השערים בעת יצירת קובץ תבנית.

כל נקודה מייצגת את הערכים עבור תמונת תא בודדת. לחץ על סינגל. בתרשים כדי לבחור את התמונה של התא המסוים בגלריית התמונות.

לאחר מכן, צייר שער סביב תאים עם יחס השטח והגובה-רוחב המתאים לאירועי תא בודד. לתאים בודדים יש יחס גובה-רוחב של סיבוב אחד וכפולים. יש יחס גובה-רוחב של סביב 0.5.

לחץ על תאים מרובים כדי להבדיל בין האזור המכיל תאים בודדים לעומת תאים כפולים או פסולת. כדי ליצור היסטוגרמה של שורש שיפוע השדה הבהיר פירושו ריבוע של תמונת השדה הבהיר. לחץ על הכפתור הבא.

לאחר מכן, תחת הכרטיסייה אוכלוסייה, בחר באפשרות סל כדי להציג את הסל שנבחר. לחץ על הסלים כדי לקבוע היכן התאים והמיקוד הטוב ביותר. התחל וצייר אזור קו כדי ללכת על תאים ממוקדים.

ככל שהשיפוע RMS גבוה יותר, כך ממוקד יותר, דלג על השלב הבא אלא אם כן יש כתמים אחרים לשער. נוצרת תרשים פיזור חדש של עוצמת הערוץ השני על ציר ה-x לעומת הפיקסל המקסימלי של ערוץ שתיים על ציר ה-Y. לחצו על הנקודות וצפו בתמונות כדי לעזור לקבוע את האזור שיש לצייר סביב התאים החיוביים לננו-חלקיקים או לחיידקים.

היסטוגרמה של תכונת ההפנמה נוצרת עם אזור שמתחיל באפס, אותו יש להתאים על ידי התבוננות בתמונות. תכונת ההפנמה היא יחס בין העוצמה בתוך התא לעוצמת התא כולו. קנה המידה שלו הוא כך שבערך של אפס מחצית מהעוצמה נמצאת בפנים.

האשף יצר אזור בכל תא שמציין את החלק הפנימי על ידי יצירת מסכה המשמשת, קלט תמונת התא כדי למצוא את פני התא ושחק את זה בארבעה פיקסלים. שים לב שניתן להתאים מסכה זו באופן ידני לסוגי תאים שונים בעת הצורך על ידי יצירת מסיכת אובייקט בתמונת השדה הבהיר תחילה ושחיקה זו ביותר או פחות פיקסלים. תכונת ההפנמה מחושבת על סמך מסכת אובייקט נשחקת זו באמצעות אלגוריתם בתוכנה.

תכונה זו מאפשרת לנו להבחין בין חלקיקים וחיידקים מופנמים שיש להם את רוב האות הפלואורסצנטי שלהם בתוך גבול המסכה לבין חלקיקים וחיידקים הקשורים לפני השטח, שיש להם את רוב האות הפלואורסצנטי שלהם מחוץ לגבול המסכה כפי שמוצג בדוגמה זו, יוצרים היסטוגרמה חדשה עם תכונת הפנמה חדשה המבוססת על מסכת האובייקט שנשחק. צייר אזור לשער בתאים מופנמים על-ידי הצגת התמונות במצב סל שנבחר. הגדר את השער ב-0.3.כאן.

תאים עם ציון נמוך מ-0.3 נחשבים לתאים חיוביים לחלקיקים הקשורים לפני השטח. כדי לחסל את התאים עם תיוג רקע וכדי לזהות ננו-חלקיקים או חיידקים מופנמים ספציפיים, בחר תכונות מתפריט הניתוח. לחץ על תפריט הניתוח.

לאחר מכן לחץ על תכונת ספירת הנקודות שליד כדי להוסיף את ספירת הנקודות הממוצעת לדוח הסטטיסטיקה. בתפריט הדוחות לחץ על סמל הדוחות. לאחר מכן הגדר דוח סטטיסטיקה, הוסף עמודות ולאחר מכן בחר את אוכלוסיית התאים המתאימה.

לחץ על אישור. אשף ההפנמה יוסיף באופן אוטומטי נתונים סטטיסטיים לדוח זה כדי לשמור את קובץ הנתונים כקובץ תבנית שישמש לניתוח אצווה של כל הקבצים הניסיוניים. לחץ על תפריט הקובץ ובחר שמור כתבנית.

קובצי תבנית. יש את הסיומת נקודה AST כדי לנתח קבצי נתונים מרובים בתוכנת הרעיון. לחץ על כלים ובחר קבצי נתוני אצווה והזן את כל קבצי ה-RIF.

הוסף את קובץ מטריצת הפיצוי ואת קובץ התבנית במקטעים המתאימים כדי לשלוח את האצווה לעיבוד, לחץ על שלח. לאחר שלב העיבוד, כל קבצי ה-RAF מנותחים ונוצרים קבצי DAF עבור כל אחד מהקבצים הגולמיים הבודדים. דוח סופי מופק עם נתונים סטטיסטיים עבור כל הדגימות כדי להשוות את ההשפעה של עיכוב אקטין וטמפרטורה נמוכה על הפגוציטוזיס של סלמונלה וננו-חלקיקים.

תאי RA W2 64.7 הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס במדיום, עם או בלי ציטו קליין D או הודגרו במדיום בארבע מעלות צלזיוס. גם הטמפרטורה וגם מניפולציות האקטין הפחיתו את ההפנמה של ננו-חלקיקים וסלמונלה. עם זאת, דגירה של התאים ב-cyto ו-D מגדילה את אחוז התאים עם ננו-חלקיקים קשורים לפני השטח תוך הפחתת אחוז התאים עם סלמונלה קשורה לפני השטח.

אחוז התאים החיוביים לננו-חלקיקים הקשורים לפני השטח עולה מכ-8% ב-37 מעלות צלזיוס ליותר מ-35% לאחר טיפול בציטו ו-D או ארבע מעלות צלזיוס. לעומת זאת, אחוז התאים עם סלמונלה קשורה לפני השטח ירד מ-35% ל-15% לאחר טיפול בציטו ו-D, הדגירה של תאי RA W2 64.7 עם סלמונלה בארבע מעלות צלזיוס, הפחיתה את ההפנמה ללא עלייה ניכרת בכמות החיידקים הקשורים לפני השטח בהשוואה לביקורת של 37 מעלות צלזיוס. יחד, נתונים אלה מדגימים כי סלמונלה וננו-חלקיקים מופנמים בתהליך תאי דומה הדורש אקטין ותלוי טמפרטורה.

יתר על כן, הנתונים מצביעים על כך שהצמדה מתמשכת של סלמונלה למקרופאגים דורשת פילמור אקטין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להוציא את ההפנמה התאית של ננו-חלקיקים וחיידקים על ידי ציטומטריית זרימת הדמיה מולטי-ספקטרלית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי מעכבים הם ציטוטוקסיים.

לכן, יש צורך בניסויי פרופיל ציטוטוקסיות קודמים כדי לקבוע את הריכוזים האופטימליים לשימוש. אל תשכח שעבודה עם סלמונלה עלולה להיות אמצעי זהירות מסוכנים, כגון לבישת ציוד המגן האישי המתאים והימנעות מיצירות אירוסולים יש להקפיד בעת ביצוע הליך זה.