הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

המטרה הכוללת של הליך זה היא להיות מסוגל למדוד כמותית את תנועתיות התאים לאורך זמן באמצעות בדיקת תנועתיות תאים מבוססת ננו-חלקיקי זהב. זה מושג על ידי הכנת פתקי כיסוי זכוכית לציפוי של ננו-חלקיקי זהב. באופן ספציפי, תלושי כיסוי נטולי אנדוטוקסין מצופים בג'לטין ולאחר מכן נאפים.

השלב השני הוא הפחתת חומצה כלואורית, שתיצור ננו-חלקיקי זהב וציפוי הכיסוי המצופה ג'לטין מחליק באופן שווה בתמיסה. לאחר מכן, התאים מונחים על החלקות הכיסוי של ציפוי ננו-חלקיקי הזהב למסגרת הזמן הרצויה של תאי הניסוי. בהמשך, הג'לטין יחליף ננו-חלקיקי זהב ויוצר מסלולים.

השלב האחרון הוא ניטור וכימות של תנועתיות התאים באמצעות מיקרוסקופיה כדי לדמות את המסלולים שנוצרו על ידי התאים הנעים. בסופו של דבר, מדידות השטח של המסלולים מבוצעות באמצעות תוכנה זמינה בחינם. אחד היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הדמיית זמן-lapse, הוא שבדיקה זו דורשת רק מיקרוסקופ אור סטנדרטי, מצלמה סטנדרטית ומשתמשת בתוכנת הדמיה זמינה בחינם.

בנוסף, הבדיקה מאפשרת גם בקלות ניתוח והשוואה של דגימות מרובות באמצעות מתודיסט המסוגל לסנן תפוקה גבוהה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההשפעה של גורמים פיזיולוגיים שונים ותנועת תאים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כמו המחקרים על ההשפעות שיש לפתוגנים על התנועתיות של תאים נגועים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שהשיטות דורשות להקפיד על נפחים וטמפרטורות המצוינים בפרוטוקול.

בפרוטוקול זה מושם דגש על הערכת צבע התמיסה הסופית של ננו-חלקיקי זהב משקעים כדי להבטיח הצלחה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. כמו בדיקת התנועתיות הקינטית של FGO קשה ללמוד שלבים.

הם מכילים מספר הליכים שאינם בשימוש נפוץ במעבדות לביולוגיה תאית ומולקולרית. להכנת תלושי כיסוי מצופים ג'לטין, ראשית Resus השעו את הג'לטין והמים נטולי היונים כדי להכין את התמיסה בריכוז סופי של 0.5 גרם ל -300 מיליליטר ואז חיטוי התערובת למשך 15 עד 30 דקות. חשוב לעשות זאת תוך שעתיים מהוספת הג'לטין במכסה המנוע של תרבית רקמות.

הכן את פתקי הכיסוי לציפוי על ידי העברת שמונה עד תשע החלקות כיסוי שטופות בחומצה לכלי פלסטיק של 100 מילימטר. ודא שהחלקות הכיסוי אינן נוגעות זו בזו או בצידי המנה. פיפטה בזהירות שתיים עד שלוש טיפות ג'לטין על כל החלקה של המכסה והימנעו מהצפה על הצלחת.

לאחר מכן מכניסים את התבשיל המכיל את המכסה המצופה ג'לטין לתנור ואופים בחום של 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות מוציאים את התבשיל מהתנור ומחזירים אותו לרקמה. מכסה המנוע של התרבות.

יש להסיר בעדינות את עודפי הג'לטין. מחזירים את התבשיל לתנור ומייבשים את החלקות הכיסוי בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לאחר שהכיסוי יבש, הוציאו את התבשיל מהתנור והחזירו אותו לרקמה מכסה המנוע.

בעזרת מחט סטרילית בעדינות, הרם צד אחד של החלקת הכיסוי. לאחר מכן השתמש בפינצטה סטרילית כדי להסיר את החלקות הכיסוי המצופות ג'לטין מהצלחת ולהניח אותן בבארות נפרדות של צלחת 24 בארות. השלב הבא הוא הכנת פתקי כיסוי מצופים זהב קולואידי.

התחל בהכנת 10 מיליליטר של תמיסת נתרן ציטראט 0.5% הפועלת במכסה מנוע של תרבית רקמות משולב 1.5 מיליליטר מתמיסת חומצה כלורו ORIC של 14.5 מילי-מולרי, ו-13.5 מיליליטר מים נטולי יונים בבקבוק ארלנמאייר נטול אנדוטוקסין סטרילי עבור כל שמונה עד תשע החלקות כיסוי, התוצאה אמורה להניב תמיסה צהובה קלושה. חומצה כלורו אורית רעילה ויש לטפל בה בזהירות. הוא גם רגיש לאור, ולכן יש לבצע את שלב הרתיחה בתאורה חלשה.

כאשר התמיסה הגיעה לנקודת הרתיחה שלה, הוציאו את הבקבוק מהפלטה החמה והעבירו אותו לצלחת ערבוב. על מנת ליצור את חלקיקי הזהב הקולואידים בתמיסה, יש להוסיף 0.7 מיליליטר מתמיסת הנתרן ציטראט 0.5% לכל 15 מיליליטר מתמיסת החומצה הכלורו ORIC תוך כדי ערבוב, המשיכו לערבב כשתי דקות. במהלך תקופה זו, התמיסה תשתנה מצהוב קלוש לצלול לאפור לסגול לסגול עמוק.

לפני שמגיעים סוף סוף ליין אדום או רצוי לצבע חלודה, ציירו את תמיסת הזהב הקולואידית בפיפטה של 10 מיליליטר והניחו לתמיסה להתקרר בפיפטה למשך דקה עד שתיים עד שהיא מגיעה לטמפרטורת החדר. לאחר מכן מוסיפים 0.5 עד מיליליטר אחד על גבי החלקות הכיסוי המצופות ג'לטין בצלחת 24 הבארות מניחים את צלחת 24 הבארות המכילה את החלקות הכיסוי המכוסות זהב קולואיד באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ודוגרים למשך 30 דקות. לאחר שהחלקיקים הספיקו להתיישב על החלקות הכיסוי המצופות בג'לטין, בדוק את צפיפותם במיקרוסקופ אור.

הפיזור המתאים של ננו-חלקיקי זהב מסייע להבחין בקלות וביעילות בין הקצוות של משאיות סולאריות. הצפיפות האופטימלית משתנה בהתאם לגודל התא. ריכוז של חלקיקי זהב גבוה מדי פוגע ביכולת של תאים לנוע בעוד שריכוז של חלקיקי זהב, זהב נמוך מדי מגביל את היכולת לשרטט מסלול מדויק של תנועתיות.

מסיבה זו, יש להשתמש רק בהחלקות כיסוי שנעשו באותה אצווה או שיהיו בעלות אותה צפיפות בניסויים בודדים. אם ריכוז חלקיקי הזהב אינו מספיק, הוסף 0.5 עד מיליליטר אחד נוסף של תמיסת הזהב הקולואידית להחלקות הכיסוי המצופות ג'לטין. עם זאת, אם ריכוז חלקיקי הזהב גבוה מדי, כמו המקרה המוצג כאן, הבחירה היעילה היחידה היא ליצור מחדש את תמיסת הזהב הקולואידית ולצפות פתקי כיסוי חדשים.

אם צפיפות החלקיקים נכונה, החזירו את הצלחת לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ודגרו למשך שעה כדי לשטוף למשך הלילה חלקיקי זהב לא קשורים על ידי טבילת החלקות הכיסוי שלוש פעמים במי מלח סטריליים עם פוספט. לאחר מכן אחסן את פתקי הכיסוי המצופים זהב קולואידיים בבארות מלאות PBS של צלחת נקייה של 12 בארות בארבע מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לשימוש. אין לאפשר לפתקי כיסוי להתייבש ויש להשתמש בהם תוך חודשיים-שלושה מיום ייצורם.

השלב הבא הוא הכנת פתקי הכיסוי המצופים זהב קולואידיים לתרבית תאים. התחל בהנחתם לבארות בודדות של צלחת 24 בארות שנוספו להן כ-0.3 מיליליטר של מצע תרבית לפני הוספת הכיסוי פתקים מעבירים כ-5,000 עד 50,000 תאים על כל תלוש כיסוי מצופה זהב קולואידי. מספר התא ישתנה בהתאם לסוג התא, אך צפיפות התאים חייבת להיות נמוכה מספיק כדי למנוע חפיפה של מסלולי תאים ממספר תאים באותו אזור.

מכסים את הצלחת ומניחים אותה בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שש עד 24 שעות בהתבסס על התנועתיות של סוג התא, יש לקבוע באופן ניסיוני את מסגרת הזמן האופטימלית עבור כל סוג תא לאחר הדגירה, לתקן את כל החלקות הכיסוי שלא ינותחו מיד על ידי טבילה ראשונה פעמיים ב-PBS ולאחר מכן דגירה ב-3%para פורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות תמונות לכידת אור של המסלולים שנוצרו על ידי תא נע בודד על פתקי כיסוי לא קבועים או קבועים. ההגדלה המשמשת לצילום מסלולים סלולריים משתנה בהתאם לסוג התא. עם זאת, יש להשתמש באותה הגדלה עבור כל מחקר על מנת להיות מסוגל להשוות תוצאות.

עבור מונוציטים, הגדלה של פי 40 עובדת היטב באמצעות התוכנה הזמינה בחינם כגון תמונה, תמונת JNIH או כלי תמונה קובעים את השטח הממוצע של זהב קולואידי שנוקה על ידי 10 עד 20 תאים או יותר עבור כל דגימה מהתמונות שנלכדו המוצגות כאן הוא הנתיב הנקי של חלקיקי זהב קולואידים על ידי מונוציט יחיד לא מגורה שצולם עם מטרה של פי 40. תאים לא נעים יוצרים מסלולים קטנים אופייניים בצורת אליפסה או עיגול סביב עצמם, מה שמעיד על רמת תנועה וסאלית נמוכה. לעומת זאת, תאים בעלי תנועה גבוהה מאופיינים בתנועה כיוונית כמסלולים מוארכים ושטחים כלליים גדולים יותר בשל צורתם הלא סדירה.

מסלולי תאים מנותחים בצורה הטובה ביותר על ידי שימוש בכלי היד החופשית בתוכנת Image J כדי לתאר את עוצמת הקול שלהם. לאחר מכן ניתן לבצע מדידות שטח כמותיות באמצעות כלי המדידה בתפריט הניתוח של תמונה J.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב בקפדנות אחר הנפחים והטמפרטורות המצוינים בפרוטוקול מכיוון שסטיות יכולות להשפיע מאוד על התוצאות הסופיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור פתקי כיסוי מצופים ג'לטין, כיצד להכין ננו-חלקיקי זהב וננו-חלקיקי זהב מצופים תלושי כיסוי מצופים, וכיצד לנטר ולהעריך כמותית את תנועת התאים באמצעות מיקרוסקופ אור.

אל תשכח שעבודה עם תמיסות הרתיחה על פלטה חמה, במיוחד אדים מהתמיסה הרותחת של פלואורו, חומצת AIC ונתרן ציטראט יכולים להיות אמצעי זהירות מסוכנים כמו עבודה במכסה המנוע ושימוש בהיגיון בריא יש לנקוט תמיד בעת ביצוע הליך זה.