ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

מטרת הליך זה היא לדמיין תגובות של תאי חיסון לרעלנים חיידקיים. ראשית, הרעלן מתבטא בתאי זהב BL 21 ומטוהר מהם. לאחר אישור פעילות וריכוז הרעלן, הרעלן מועבר לתאי מערכת החיסון.

באמצעות מזרק מיקרו ומיקרוסקופ תאים חיים במהירות גבוהה מתבצעת. ניתוח התמונות המתקבלות חושף את הקינטיקה בזמן אמת של תגובות תאי החיסון לרעלן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון מנגנון ההפעלה הדלקתית.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תגובות תאי חיסון בתיווך רעלנים, ניתן ליישם אותה גם על גירויים אחרים כולל טרקטורים כימוטקטיים. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כאשר חקרנו את האינטראקציה של חיידקים עם תאי חיסון מתורבתים, וצפינו באינטראקציות משתנות מאוד בין חיידקים לתאי החיסון. התחל את הטיהור של סטרפטוקוס ליזין O או SLO עם תרבית של תאי זהב BL 21 המכילים PAG 3 SLO.

הפלסמיד שלו גדל ל-OD של כ-0.6. כדי לגרום לביטוי חלבון, הוסף לתרבית חמישה מיליליטר של 20% של OSes ונער ב-2 25 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות. לאחר מכן, העבירו את החיידקים לבקבוק צנטריפוגה של 500 מיליליטר.

לאחר מכן סובב את התרבית ב-12,000 פעמים G למשך 12 דקות של ארבע מעלות צלזיוס לאחר הסיבוב. הסופינט מאחסנים את הכדור במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה או יותר במידת הצורך. כדי לטהר את ה-SLO המבוטא הוסף מאגר כביסה של 10 מיליליטר בתוספת טריטון X 100 ליזוזים ופניל מתיל גופרית פלואוריד לפיפטה הגלולה הקפואה למעלה ולמטה למשך כ-15 דקות.

כדי להחזיר את הכדור, השעו את הכדור תוך שמירה על הדגימה על הקרח. העבירו את הגלולה המושעה לצינור פוליפרופילן תחתון עגול של 50 מיליליטר. סוניקט את הליזאט באמצעות סוניקט בדיקה בתפוקה של 40% חמש פעמים למשך 30 שניות כל אחת במרווחים של 30 שניות עם 30 שניות על קרח ביניהן.

לאחר מכן סובב את הליזאט הסוניקט ב 39, 000 פעמים G למשך 20 דקות של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, הוסף את החיידק למיליליטר אחד של ניקל NTA ארוס. דגרו את הניקל NTA aros וליזה יחד למשך 2.5 שעות בארבע מעלות צלזיוס עם ניעור עדין לאחר הדגירה.

גלולה את החרוזים על ידי סיבוב ב -400 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שימו לב שכל השטיפות והפליטה הנוספות מבוצעות עם הגדרות הצנטריפוגה הללו ופחות צוינו אחרת. בעקבות הצנטריפוגה.

שלב 30 מיקרוליטר של הסופינט עם 10 מיקרוליטר ארבע פעמים מאגר דגימת SDS בצינור מיקרו צנטריפוגה ושמור אותו על קרח לניתוח טוהר. לאחר מכן השליכו את שארית חומר השכיבה ושטפו את החרוזים ארבע פעמים במאגר שטיפת כינים. וברגע שריבית צנטריפוגה של חיץ מלח בין כל שטיפה מנקודה זו ואילך, הקפד לשמור את הדגימה על הקרח כל הזמן.

SLO הוא חלבון רגיש מאוד לחמצון חיזור והוא יאבד במהירות את פעילותו אם יתחמם ל-37 מעלות צלזיוס, גם אם לפרק זמן קצר. כדי לסלק את חלבון ה-SLO, הוסף מיליליטר אחד של מאגר פליטה וחמישה מיקרוליטרים של DTT מולארי אחד לחרוזים, דגירה על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה ואוספים את הסופינט בצינור פוגה המסומן במספר האלוציאני.

חזור על תהליך זה שלוש פעמים ואז כדי לרוקן את האנדוטוקסין מחלבון ה-SLO, הוסף לדגימה 200 מיקרוליטר של חרוזי אגרו מצומדים שטופים, מאגר מלח תלוי ולנער בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן סובב ב -10, 000 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, אספו את הסופרנטנט בצינורות מיקרו צנטריפוגות חדשים עם תווית.

שלב 30 מיקרוליטר מכל פליטה עם 10 מיקרוליטר, ארבע פעמים מאגר דגימת SDS. לניתוח דפי SDS, אחסן את פתרונות ה-SLO על קרח. קבע את ריכוזי החלבון והפעילות המוליטית אם משביע רצון, משוך את ה-SLOE בחמישה עד 10 מיקרוליטר קוואט, ואז הקפיאו על קרח יבש ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן קבע את הליזיס הספציפי. ריס. השעו את התאים לבדיקה פעמיים. מרכז את ששת התאים למיליליטר במאגר RB עם 20 מיקרוגרם למיליליטר.

פרופידיום יודיד. כאן נבדקים תאי T 27 A. הוסף 100 מיקרוליטר תאים לכל באר של צלחת תחתונה של 96 באר V בצינורות מיקרו צנטריפוגה נפרדים.

יש לדלל SLO באופן סדרתי עד פי שניים מהריכוז הסופי ב-buffer rb. לאחר מכן הוסיפו לתאים 100 מיקרוליטר רעלן או 100 מיקרוליטר RB ודגרו למשך חמש דקות של 37 מעלות צלזיוס. הריכוזים הסופיים האופייניים נעים בין 2000 יחידות למיליליטר ל-31.25 יחידות למיליליטר.

הפעל תאים על ציטומטר זרימה ואסוף נתונים עם מסננים עבור fi, cethrin או pe. הזזת לוג אחת מייצגת תאים חדירים באופן חולף ואילו הזזת שלושה לוג מציינת תאים מתים. חשב את הליזה הספציפית של התאים על ידי הפחתת אחוז התאים המתים בביקורת מהניסוי באמצעות המשוואה המוצגת כאן יום אחד לפני לוח הניסויים, פעמיים מרכז את חמשת המקרופאגים על זכוכית מצופה קולגן.

כלים תחתונים 35 מילימטר. המיקרוסקופ המשמש להעברת רעלנים צריך להיות מצויד בבמה הפוכה, במה מחוממת, קוביות מסנן פליטת עירור מתאימות, ואם יש עדשת ברטנד. החלק הקשה ביותר בהליך זה הוא הורדת המחט שלמה לתאים.

כדי להבטיח הצלחה, אנו משתמשים בעדשת ברטרנד, המשמשת בדרך כלל ליישור כדי לדמיין את המחט כשאנחנו מעבירים אותה דרך מישורי המוקד. המיקרוסקופ צריך להיות מחובר למזרק מיקרו וצריך להיות נשלט על ידי מחשב עם מספיק זיכרון כדי לאסוף ולאחסן נתונים, להפעיל את המיקרוסקופ ומזרק המיקרו ולאפשר לזמן השלב המחומם להתחמם ל-37 מעלות צלזיוס בזמן ההמתנה לחימום הבמה. סמן את התאים למשך 30 דקות עם צבע ב -37 מעלות צלזיוס.

בהתאם לתיוג הבדיקה עשוי להיעשות עם חמישה מיקרוליטר, ארבעה או 2:00 לפנות בוקר במיליליטר אחד, HBSS או שני מיקרוליטר סידן במדיום מלא אחד כאן, נעשה שימוש בארבעה או שניים. הסר את מדיום התא ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS. שאפו את ה-PBS והחליפו אותו ב-RPMI מיליליטר אחד בתוספת שני מילי-מולרי סידן כלורי.

הרכיבו את הצלחת על המיקרוסקופ, הביאו את התאים למיקוד עם שדה בהיר, ואז התאימו למיקוד מעט מעל התאים. לאחר מכן, שלבו מיקרוליטר אחד של רעלן SLO ארבעה מיקרוליטר, 10 מיליגרם למיליליטר, DEXTRA 5 55 ושישה מיקרוליטר מים. לאחר מכן צנטריפוגה את 20,000 פעמים G למשך 10 דקות של ארבע מעלות צלזיוס.

דקסטרן משמש כדי לוודא שקצה הפמטו אינו סתום G. השתמש במעמיס מיקרו כדי להעמיס שני מיקרוליטר של רעלן מדולל לקצה הפמטו מאחור. טען את קצה הפמטו על מזרק המיקרו.

לאחר מכן כוונן את זווית המזרק כך שהקצה יישב מעל מרכז התאים עם מקום לנוע לכל הכיוונים, נקה את ההגדרות הקודמות עבור גבול Z המגביל את הנמוך שקצה מזרק המיקרו יכול לרדת. הגדר את מזרק המיקרו להזרקה למשך 0.5 שניות ב-120 PSI עם לחץ אחורי של 20 PSI. ואז הורד את הקצה עד שהוא נכנס למדיום.

שימוש בעדשת ברטרנד. מרכזו את הקצה ועקבו אחר הקצה כשהוא מונמך קרוב יותר לתאים. ברגע שהמחט יוצאת מהמיקוד, חזור לאופטיקה רגילה.

צל המחט צריך להיות גלוי בשטח. התמקדו מעל התאים והורידו את המחט עד שהיא נכנסת למיקוד. לאחר מכן הביאו את התאים למיקוד והביאו בזהירות את המחט הסמוכה לתא.

לאחר קביעת גבול Z להזרקה, התחל בהדמיה והזרקת רעלן. לאחר מכן הרם את המחט ועבור לאזור חדש של תאים. יש להזריק רעלן נוסף ולהמשיך בהדמיה לאחר ההזרקה.

העבר את המחט למצב הבית כדי למנוע דליפת רעלן לא רצויה מהמחט בשיטה המתוארת בסרטון זה, 10 עד 7 עד 10 עד שמונה יחידות למיליליטר. SLO מתקבל בדרך כלל עם ריכוז חלבון של ארבעה מיליגרם למיליליטר. ג'ל דף SDS זה מציג דגימות חיידקים לפני ואחרי השראת רעלן לאחר הטיהור, וכל אחד משלושת הצביעה הכחולה של אלוסיאנים קמאסי מגלה כי ה-SLO המושרה טוהר בהצלחה.

SLO היא הרצועה ב-69 קילודלטון כדי לקבוע את כמות הרעלן הנדרשת לליזה של שני תאים T 27 A או D. התאים אותגרו עם ריכוזים שונים של SLO במשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס בנוכחות פרופידיום יודיד ונבדקו על ידי ציטומטריית זרימה. ליזה ספציפית נקבעה כפי שמוצג כאן.

250 יחידות למיליליטר. SLO נותן 50% ליזה של שני תאים T 27 A ו-D. מינון תת-ליטי של 10% ליזה של רעלן יהיה 62.5 יחידות למיליליטר.

ערכים אלה חשובים לפעילות רעלן אמת מידה להערכת מוות תאים לאחר חשיפה לרעלן. פיברובלסטים עוריים אנושיים הודגרו עם סידן ואת'ריום הומודימר באמצעות ערכה חיה של טכנולוגיות חיים. בעקבות חשיפה מקומית לרעלן החיידקי, אנתרו ליזין O.In תמונה זו, סידן מוצג בירוק ואת'ריום ברומיד באזורים אדומים הקרובים למיקרוביום, מראים מוות תאים המאופיין באובדן סידן וספיגת הומודימר, בעוד שאזורים רחוקים יותר מהקצה לא יראו נזק.

אספקת הרעלן במיקרו מאפשרת גם בחינה של אירועים בזמן אמת כגון שטף סידן. ה-dcs האנושיים הללו עמוסים ב-4:02 AM נחשפו ל-SLO בקצב זרימה קבוע עם הסטת הדמיה חיה בו זמנית מירוק לכחול. צבע פסאודו מעיד על עלייה ברמות הסידן הציטוזולי.

SLO גורם לעלייה מהירה בסידן ציטוזולי, המופץ דרך אזור המנה עקב המסירה המקומית. עם זאת, רק תאים הקרובים לקצה המזרק המיקרו נתקלים ברעלן הכור. זה מדגים הן תגובה תאית אחת לרעלן והן את האזור המוגבל מרחבית של אספקת הרעלן כדי לפתור אירועים בממד zdi.

אספקת מיקרו שולבה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת מימדית במהירות גבוהה. קבוצת תמונות זו מציגה תאים דנדריטיים לאחר הזרקת רעלן. הם הודגרו מראש עם אנטי CD 11 C מצומד למחשב המוצג בירוק כדי לסמן את קרום הפלזמה.

כפי שניתן לראות כאן, מיקרו-שלפוחיות משתחררות לאחר מתן רעלן. כחלק מתהליך התיקון התאי, מולקולות הרעלן מרוכזות בבלבים, אשר נושרים כדי לסלק רעלן. לאחר המאסטר, ניתן לבצע את המיקרוסקופיה תוך 45 דקות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על הרעלן קר לפני ערבוב עם תאים ולבדוק את הפעילות המוליטית. טוב. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד למדוד קינטיקה בזמן אמת של תגובות תאי חיסון לרעלנים חיידקיים באמצעות מיקרוסקופ תאים חיים.