תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב אחר תאי שמרי הפלו בודדים לאורך כל תוחלת החיים המשכפלת שלהם. הצעד הראשון הוא ליצור שבב מיקרופלואידי, המכיל מערך של רפידות מיקרו. לאחר מכן, תאי השמרים נטענים לתוך השבב המיקרופלואידי, ומכיוון שלאזור שמתחת לרפידות המיקרו יש גובה דומה לקוטר של תא שמרים, התאים ישקעו שם.

לאחר מכן, זרימה רציפה של מדיום טרי מוחלת על תאי השמרים הלכודים, ותאי הבת המתהווים נשטפים על ידי זרימת שדה בהיר בינוני ופלואורסצנטי. מיקרוסקופיה משמשת להמחשת שינויים במורפולוגיה של תאים או אברונים, ביטוי חלבונים ולוקליזציה של חלבונים שעלולים להתרחש בתאי שמרים מזדקנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטת המיקרו-דיסקציה הקלאסית הוא שהיא פחות אינטנסיבית לעבודה ושהיא מאפשרת תמונות מיקרוסקופיות רציפות לטווח ארוך של כל תוחלת החיים של תאי שמרים בודדים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הזדקנות משוכפלת, היא יכולה לשמש גם למחקרים הדורשים תצפית מיקרוסקופית רציפה לאורך תקופות זמן ממושכות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיש לנקוט בזהירות בשלבים מסוימים של ייצור שבב המיקרו פייק. בנוסף, העמסת התאים לשבב המיקרו פייק, עשויה לדרוש ניסיון מסוים.

תבנית פרוסות הסיליקון מיוצרת על ידי ליתוגרפיה רכה. לפרטים על ייצורו, עיין בפרוטוקול הנלווה. טקסט חותך חתיכת תג קשיח לרצועות דקות של כ-0.5 מילימטרים על שלושה מילימטרים.

בעזרת אזמל, הניחו את הרצועות בזהירות על תבנית פרוסת הסיליקון מעט על גבי מבנה התעלה בין תעלות הכניסה למיקרו פאדרה. לאחר מכן, מכסים צלחת פטרי מזכוכית בשכבה כפולה של נייר אלומיניום ומכניסים את הוופל לצלחת הפטרי. רדיד האלומיניום ימנע מ-PDMS לרוץ בין הפרוסה לצלחת הפטרי במהלך ייצור השבבים המיקרופלואידיים.

כדי להתחיל בהליך להכנת שבבים מיקרופלואידיים, הניחו פלסטיק ריקה על האיזון וקרעו את האיזון. יוצקים 40 גרם בסיס PDMS לכוס הפלסטיק. הוסף חומר ריפוי PDMS ביחס משקל למשקל של 1 עד 10, שבמקרה זה הוא כארבעה מיליליטר.

באמצעות פיפטת הפלסטיק החד פעמית המעורבבת היטב במשך מספר דקות, חשוב שהתערובת תהיה מעורבבת היטב כדי להבטיח פילמור נכון של ה-PDMS מאוחר יותר. יוצקים את ה-PDMS על גבי הוופל בצלחת פטרי הזכוכית. תערובת ה-PDMS בצלחת הפטרי תכיל הרבה בועות לדגה.

מקום ה-PDMS, צלחת הפטרי בחומר ייבוש המחובר למשאבת ואקום למשך כ-30 דקות כאשר כל הבועות הוסרו. פילמרו את ה-PDMS על ידי הנחת צלחת הפטרי עם הוופל על גבי פלטה חמה בחום של 120 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן 65 מעלות צלזיוס למשך שעה נוספת. לאחר השעתיים, הסר את פרוסת נייר האלומיניום ואת ה-PDMS הפולימרי מצלחת הזכוכית של פטרי.

קלף את נייר האלומיניום לתוך PDMS מגב הוופל. לאחר מכן הרם בזהירות את שכבת ה- PDMS מהחלק העליון של הוופל. הנח את שכבת ה-PDMS הפוכה כשהתעלות פונות כלפי מעלה וספסל וחתוך בזהירות את עיצובי השבבים הבודדים המוטבעים על ה-PDMS בעזרת האזמל.

נסה לשמור כשלושה מילימטרים של PDMS סביב שולי התעלות. השלב הבא הוא לנקב חורים ב-PDMS בקצות יציאת הכניסה והתעלה הצדדית כפי שמוצג בתרשים זה. כדי לנקב חור, דחוף בדל פיתוי בגודל 20 עד הסוף דרך ה-PDMS בצורה ישרה.

הסר את עמודת ה-PDMS בבדל הפיתוי לפני שתמשוך את הבדל החוצה. שוב, זה מונע מעמודת ה-PDMS לחסום את החור החדש שניקב. לאחר ניקוב כל החורים, נקה את משטחי השבב מחלקיקי אבק ושאריות PDMS על ידי הנחת סקוטש עליו והסרה מיידית של הסרט.

באופן דומה, נקה את זכוכית הכיסוי שאליה יחובר השבב. הנח את השבב וזכוכית הכיסוי מתחת למנורת ה-UV של שואב אוזון UV עם הצדדים שצריך לחבר זה לזה, מול המנורה החשופה לאור UV למשך שש עד שמונה דקות, והניח את המשטחים החשופים זה על גבי זה. הקש בעדינות סביב דפנות השבב כדי לקדם את הצמדת ה-PDMS לזכוכית הכיסוי, וכדי להסיר בועות אוויר.

אל תקיש על גבי מבנה התעלה מכיוון שהדבר עלול לגרום לרפידות המיקרו להתחבר לכיסוי. גם זכוכית. הנח את ההתקנה המיקרופלואידית החדשה שנוצרה על פלטה חמה בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר מכן, בדוק את ההדבקה של זכוכית הכיסוי לשבב ה-PDMS על ידי הרמה קלה של הקצוות של שבב ה-PDMS. אם זה לא אפשרי, ההדבקה מוצלחת והשבב מוכן לשימוש. כדי להכין את השבב המיקרופלואידי להעמסת תאים, הנח את השבב במחזיק המתכת עם ג'ל סיליקון בין זכוכית השבב לחלקי המתכת של המחזיק.

כדי ליצור אטימה עמידה למים, הברג את האומים בעדינות כדי למנוע שבירת הזכוכית. חבר צינורות דקים לתעלה הצדדית ולתעלת היציאה של השבב. השימוש בפינצטה מקל על הכנסת הצינורות לחורים המנוקבים.

מלאו מזרק נעילת פיתוי של 50 מיליליטר במדיום תרבית. הסר את האוויר מהמזרק וחבר אותו ברצף למזרק. מסננים בדל פיתוי בגודל 20, צינור קצר ועבה וצינור דק.

הנח את המזרק במשאבת המזרק והר קדימה את המשאבה עד שהצינור הדק מתמלא לחלוטין במדיום. דחוף את הצינור הדק המחובר למזרק לתוך תעלת הכניסה של השבב ותן למדיום לזרום דרך השבב בקצב של 10 מיקרוליטר לדקה. אוספים את המדיום ומשאירים את הצ'יפס בצלחת פטרי.

המדיום ייגמר דרך הערוץ הצדדי. בגלל הפרש ההתנגדות בין התג הקשוח הגדול שנעשה ערוץ צד לבין תעלת היציאה. הנח את השבב על במת המיקרוסקופ והגדר את מוקד המיקרוסקופ על הרפידות.

כדי להתחיל בהליך זה, חבר למזרק קצה פיתיון של חמישה מיליליטר לבדל פיתוי בגודל 20 וצינור עבה. טען את המזרק בכמיליליטר אחד של מתלה התא לטעינה בשבב. ספירת התאים המועדפת לטעינה היא בין 1 ל-5 כפול 10 מתוך ששת התאים למיליליטר.

הפחת את קצב הזרימה של משאבת המזרק ל-0.5 מיקרוליטר לדקה. החלק הקשה ביותר בהליך זה הוא העמסת התאים לשבב המיקרום. זה בדרך כלל דורש תרגול מסוים.

חבר את המזרק המכיל את מתלה התא לצינור של תעלת היציאה. טען את התאים על ידי לחיצה על הבוכנה של המזרק. התבונן בעדינות בתאים הנכנסים ומתיישבים מתחת לרפידות המיקרו דרך מסך העין או המחשב.

שמור על לחץ על הבוכנה עד שמספיק תאים ישקעו מתחת לרפידות. העומס האופטימלי הוא תא אחד עד שלושה תאים לכל רפידה. נתק את המזרק המשמש להעמסת תאים ושטוף את התעלה הצדדית למשך מספר דקות בקצבי זרימה גבוהים יותר כדי להסיר בועות אוויר ו/או תאים שעדיין לא יצאו מהשבב.

הפחת שוב את זרימת משאבת המזרק ל-0.5 מיקרוליטר לדקה, וסגור את התעלה הצדדית על ידי חיבורה לצינור עבה המכיל תקע קטטר בקצהו. הגדל את זרימת משאבת המזרק לקצב זרימה סופי של אחד עד חמישה מיקרוליטר לדקה. קצבי הזרימה עשויים להשתנות בהתאם לזן המדיום והשמרים.

התחל סרט עם הגדרת המיקרוסקופ והמצלמה המתאימה למטרת הניסוי. זהו סרט דולג זמן לדוגמה של תא E מסוג E בודד שגדל על YPD. תמונות בינוניות צולמו כל 10 דקות וסרגל קנה המידה שהוצג זה עתה מייצג חמישה מיקרומטרים.

התא מייצר בסך הכל 30 ניצנים לפני שהוא מת. ניתן לקבוע את תוחלת החיים המשכפלת על ידי ספירת מספר הניצנים המיוצרים על ידי תא אם יחיד. נתונים אלה הופכים לעקומת תוחלת חיים על ידי התוויית אחוז התאים ברי קיימא מול מספר הניצנים המיוצרים או מספר הדורות.

איור זה מציג דוגמה לעקומות תוחלת חיים שהתקבלו עבור זן שמרים מסוג בר ושני זנים מוטנטיים. מחיקת הגן SER 2 מביאה לתוחלת חיים קצרה יותר בעוד שמחיקת הגן FOB 1 מביאה לתוחלת חיים ארוכה יותר. ניתן לחקור את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית כפונקציה של גיל באמצעות המכשיר המיקרופלואידי.

בוצע ניסוי הזדקנות עם BY 7 42 תאי שמרים מסוג בר המבטאים ILV 3G FP, המכוון למיטוכונדריה. באיור זה, דוגמה מייצגת לשינויים הקשורים לגיל במורפולוגיה המיטוכונדריאלית בתא בודד מסומנת על ידי החץ הלבן. כל התמונות זהות וסרגל קנה המידה מייצג חמישה מיקרומטרים.

הסרטון השני הוא של תא בודד המבטא ILV 3G FP מהניסוי שבו נצפתה מורפולוגיה מיטוכונדריאלית כפונקציה של גיל. התמונות צולמו כל 30 דקות וסרגל קנה המידה מייצג חמישה מיקרומטרים. איור אחרון זה מציג את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית שנצפתה באותה קבוצת תאים בגילאי שכפול שונים לפני יצירת הניצן הראשון שלהם לאחר 10 ניצנים ולפני המוות.

תמונה לדוגמה של כל מחלקת מורפולוגיה כוללת צינורית, צינורית מקוטעת וכתמים וכתמים גדולים. השינויים המורפולוגיה שנראו בתאים בגיל העמידה דומים לאלה שדווחו בעבר על ידי ניטור רציף של תאים בזמן שהם מתחלקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהזדקנות שכפול שמרים, כגון מדוע תא שמרים מזדקן, אילו שינויים פנוטיפיים מתרחשים וכיצד אלה משפיעים על תוחלת החיים המשכפלת של השמרים?

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור לדעת כיצד ליצור מיקרו-שבבים משלך ולחקור הזדקנות משוכפלת בתאים באמצעות כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי.