תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה
20 באוגוסט 2013
אנו מתארים כאן את הפעולה של מכשיר microfluidic המאפשר הדמיה מיקרוסקופית רציפה ורזולוציה גבוהה של תאי שמרי ניצנים בודדים במהלך replicative המלא ו / או תוחלת החיים כרונולוגית.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לעקוב אחר תאי שמרים הפלואידיים בודדים לאורך כל תקופת חייהם הרפליקטיבית. השלב הראשון הוא ייצור שבב מיקרופלואידי המכיל מערך של רפידות מיקרו (micro pads). לאחר מכן, תאי השמרים נטענים אל תוך השבב המיקרופלואידי, ומכיוון שהאזור שמתחת לרפידות המיקרו הוא בגובה הדומה לקוטרו של תא שמרים, התאים ישקעו שם.
בשלב הבא, מיושם זרימה רציפה של מצע טרי מעל תאי השמרים הלכודים, ותאי הבת המופיעים נשטפים על ידי זרימת המצע במיקרוסקופיה בשדה בהיר (brightfield) ובפלואורסצנציה. המיקרוסקופיה משמשת להדמיית שינויים במורפולוגיה של התא או האבון, ביטוי חלבונים ובמיקום החלבונים שעשויים להתרחש בתאי שמרים מזדקנים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטת המיקרו-דיסקציה הקלאסית הוא שהיא פחות עתירת עבודה ומאפשרת קבלת תמונות מיקרוסקופיות רציפות לטווח ארוך של כל אורך החיים של תאי שמרים בודדים.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הזדקנות רפליקטיבית, ניתן להשתמש בה גם למחקרים הדורשים תצפית מיקרוסקופית רציפה לאורך תקופות זמן ממושכות. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקושי, מכיוון שיש לנקוט זהירות בשלבים מסוימים של ייצור שבב ה-micro feic. בנוסף, טעינת התאים אל שבב ה-micro feic עשויה לדרוש ניסיון מסוים.
תבנית פרוסת הסיליקון מיוצרת באמצעות ליתוגרפיה רכה. לפרטים על ייצורה, אנא עיינו בפרוטוקול המצורף. חתכו חתיכה של תג קשח לרצועות דקות של כ-0.5 מילימטר על שלושה מילימטרים.
בעזרת סקלפל, הניחו את הרצועות בזהירות על תבנית פרוסת הסיליקון, מעט מעל מבנה התעלה שבין תעלות הכניסה למיקרו פדרה (micro padre). לאחר מכן, כסו צלחת פטרי מזכוכית בשכבה כפולה של נייר אלומיניום והניחו את הפרוסה בצלחת הפטרי. נייר האלומיניום ימנע מה-PDMS לזלוג בין הפרוסה לבין צלחת הפטרי במהלך ייצור השבבים המיקרופלואידיים.
כדי להתחיל בהליך להכנת שבבים מיקרופלואידיים, הניחו כוס פלסטיק ריקה על המאזניים ואפסו אותם. שפכו 40 גרם של בסיס PDMS לתוך כוס הפלסטיק. הוסיפו חומר מקשה של PDMS ביחס משקלי של 1:10, שבמקרה זה הוא כארבעה מיליליטרים.
ערבבו היטב למשך מספר דקות באמצעות פיפטה פלסטית חד-פעמית; חשוב שהתערובת תהיה מעורבבת היטב כדי להבטיח פולימריזציה תקינה של ה-PDMS בהמשך. שפכו את ה-PDMS על גבי ה-wafer בתוך צלחת הפטרי מזכוכית. תערובת ה-PDMS בצלחת הפטרי תכיל בועות רבות שיש להוציאן בתהליך Degas.
הניחו את ה-PDMS, את צלחת הפטרי, בתוך דסיקטור המחובר למשאבת ואקום למשך כ-30 דקות, עד להסרת כל הבועות. פולמריזו את ה-PDMS על ידי הנחת צלחת הפטרי עם הפרוסה על גבי פלטה מחממת בטמפרטורה של 120 °C למשך שעה אחת, ולאחר מכן ב-65 °C למשך שעה נוספת. לאחר שעתיים, הסירו את פרוסת נייר האלומיניום ואת ה-PDMS הפולמרי מהצלחת הפטרי מזכוכית.
קלפו את רדיד האלומיניום אל תוך ה-PDMS מגב הפרוסה (wafer). לאחר מכן, הרימו בזהירות את שכבת ה-PDMS מעל הפרוסה. הניחו את שכבת ה-PDMS כשהיא הפוכה, כך שהתעלות פונות כלפי מעלה על השולחן, וגזרו בזהירות בעזרת סקלפל את תכנוני השבבים הבודדים שהוטבעו על ה-PDMS.
נסו להשאיר כ-three millimeters של PDMS מסביב לקצוות של התעלות. השלב הבא הוא ניקוב חורים ב-PDMS בקצות הכניסה, היציאה ותעלת הצד, כפי שמוצג בדיאגרמה זו. כדי לנקב חור, דחפו lure stub של 20 gauge עד סוף ה-PDMS בצורה ישרה.
הסיר את עמוד ה-PDMS בבליטת הפיתיון לפני משיכת הבליטה החוצה. שוב, פעולה זו מונעת מעמוד ה-PDMS לחסום את החור שנקדח זה עתה. לאחר שכל החורים נקדחו, נקה את משטחי השבב מחלקיקי אבק ושאריות PDMS על ידי הצמדת סרט דביק (scotch tape) אליו והסרתו המיידית.
באופן דומה, נקה את זכוכית הכיסוי שאליה יוצמד השבב. הנח את השבב ואת זכוכית הכיסוי תחת נורת ה-UV של מכשיר ניקוי UV-ozone שולחני, כאשר הצדדים שצריכים להיות מודבקים זה לזה פונים אל הנורה, וחשף אותם לקרינת UV למשך שש עד שמונה דקות, ולאחר מכן הנח את המשטחים שנחשפו זה על גבי זה. טפח בעדינות מסביב לדפנות השבב כדי לקדם את היצמדות ה-PDMS לזכוכית הכיסוי ולהוציא בועות אוויר.
אין להקיש על גבי מבנה התעלה, שכן הדבר עלול לגרום להיצמדות של המיקרו-פדים למכסה, וכך גם לזכוכית. יש להניח את מערך המיקרופלואידיקה שהוכן זה עתה על פלטה מחממת בטמפרטורה של 100 °C למשך שעה אחת.
לאחר מכן, בדוק את ההדבקה של זכוכית הכיסוי לשבב ה-PDMS על ידי הרמה קלה של קצוות שבב ה-PDMS. אם פעולה זו אינה אפשרית, ההדבקה הצליחה והשבב מוכן לשימוש. כדי להכין את השבב המיקרופלואידי להעמסת תאים, הנח את השבב במחזיק המתכת עם ג'ל סיליקון בין זכוכית השבב לבין חלקי המתכת של המחזיק.
כדי ליצור איטום עמיד למים, הדקו את האומים בעדינות כדי למנוע שבירה של הזכוכית. חברו צינורות דקים לתעלת הצד ולתעלת היציאה של השבב. שימוש בפינצטה מקל על הכנסת הצינורות לחורים הנקבים.
מלאו מזרק Luer-lock בנפח 50 milliliter במצע תרבית. הוציאו את האוויר מהמזרק וחברו אותו באופן רצף למזרק. סננו Luer stub בכיול 20 gauge, צינור קצר ועבה וצינור דק.
הניחו את המזרק במשאבת המזרקים והאיצו את פעולת המשאבה עד שהצינור הדק יתמלא לחלוטין במצע. דחפו את הצינור הדק המחובר למזרק אל תוך תעלת הכניסה של השבב והניחו למצע לזרום דרכו בקצב של 10 µL לדקה. אספו את המצע היוצא מהשבב אל תוך צלחת פטרי.
המצע יזרום החוצה דרך תעלת הצד. זאת בשל הפרש ההתנגדות בין תעלת הצד העשויה תג עמיד וגדול לבין תעלת היציאה. הנח את השבב על במת המיקרוסקופ וכוון את פוקוס המיקרוסקופ אל הפדים.
כדי להתחיל בפרוצדורה זו, חברו מזרק עם קצה לוטר בנפח 5 milliliters לסטאב לוטר בכיול 20 gauge ולצינור עבה. מלאו את המזרק בכ-1 milliliter של תגלוש התאים המיועד להטענה לשבב. ספירת התאים המועדפת להטענה היא בין 1 ל-5 כפול 10⁶ תאים ל-milliliter.
הפחית את קצב הזרימה של משאבת המזרק ל-0.5 microliters per minute. החלק המורכב ביותר בפרוצדורה זו הוא טעינת התאים אל תוך השבב המיקרופלואידי. שלב זה דורש בדרך כלל תרגול.
חברו את המזרק המכיל את תרחיף התאים לצינור של תעלת היציאה. העמיסו את התאים על ידי לחיצה על בוכנת המזרק. עקבו בעדינות אחר כניסת התאים והתיישבותם מתחת לרפידות המיקרו (micro pads) באמצעות העינית או מסך המחשב.
הפעיל לחץ על הבוכנה עד שמספיק תאים ישקעו מתחת לרפידות. העומס האופטימלי הוא תא אחד עד שלושה תאים לרפידה. נתק את המזרק ששימש לטעינת התאים ושטוף את תעלת הצד למשך מספר דקות בקצבי זרימה גבוהים יותר כדי להסיר בועות אוויר ו/או תאים שטרם יצאו מהשבב.
הפחית שוב את קצב הזרימה של משאבת המזרק ל-0.5 microliters per minute, וסגור את התעלה הצדדית על ידי חיבורה לצינור עבה שבקצהו פקק לקטטר. הגדל את קצב הזרימה של משאבת המזרק לקצב זרימה סופי של one to five microliters per minute. קצבי הזרימה עשויים להשתנות בהתאם למצע ולזן השמרים.
התחילו צילום וידאו עם הגדרות מיקרוסקופ ומצלמה המתאימות למטרת הניסוי. זהו דוגמה לסרטון time-lapse של תא E מסוג wild type בודד הגדל על YPD. תמונות של המצע צולמו מדי 10 דקות, וסרגל המقياس המוצג מייצג five micrometers.
התא מייצר סך הכל 30 ניצנים לפני שהוא מת. ניתן לקבוע את תוחלת החיים השכפולית על ידי ספירת מספר הניצנים שמיוצרים על ידי תא אם בודד. נתונים אלו מומרים לעקומת תוחלת חיים על ידי שרטוט אחוז התאים החיוניים אל מול מספר הניצנים שיוצרו או מספר הדורות.
איור זה מציג דוגמה לעקומות תוחלת חיים שהתקבלו עבור זן שמרים מסוג בר ושני זני מוטנטים. מחיקה של הגן SER2 גורמת לתוחלת חיים קצרה יותר, בעוד שמחיקה של הגן FOB1 גורמת לתוחלת חיים ארוכה יותר. ניתן לחקור את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית כפונקציה של הגיל באמצעות ההתקן המיקרופלואידי.
ניסוי הזדקנות בוצע עם תאי שמרים מסוג פרא (wild type) BY 7 42 המבטאים ILV 3G FP, המכוון למיטוכונדריה. באיור זה, דוגמה מייצגת של שינויים במורפולוגיה של המיטוכונדריה הקשורים לגיל בתא בודד מסומנת על ידי החץ הלבן. כל התמונות עברו קנה מידה זהה וסרגל הקנה מייצג חמישה micrometers.
סרט ה-time lapse השני הוא של תא בודד המבטא ILV 3G FP מתוך הניסוי שבו נצפתה המורפולוגיה המיטוכונדריאלית כפונקציה של הגיל. התמונות צולמו מדי 30 דקות וסרגל המقياس מייצג חמישה מיקרומטרים. איור סופי זה מציג את המורפולוגיות המיטוכונדריאליות שנצפו באותה קבוצה של תאים בגילים רפליקטיביים שונים לפני ייצור הניצן הראשון שלהם, לאחר 10 ניצבים ולפני המוות.
תמונה לדוגמה של כל מחלקת מורפולוגיה נכללה: צינורית (tubular), צינורית מפורקת (fragmented tubular), וכתמים וכתמים גדולים (spots and large spots). השינויים המורפולוגיים שנצפו בתאים בגיל בינוני דומים לאלו שדווחו בעבר על ידי ניטור רציף של תאים במהלך חלוקתם. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע להזדקנות רפליקטיבית של שמרים, כגון מדוע תא שמר מזדקן, אילו שינויים פנוטיפיים מתרחשים, וכיצד אלו משפיעים על תוחלת החיים הרפליקטיבית של השמר?
לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם לדעת כיצד ליצור שבבים זעירים (micro chips) משלכם ולחקור הזדקנות רפליקטיבית בתאים באמצעות כמעט כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר התקן מיקרופלואידי שתוכנן לדמיון רציף וברזולוציה גבוהה של תאי שמרים בודדים בתהליך ניבוב לאורך כל תקופת חייהם הרפליקטיבית. הטכניקה מאפשרת מעקב אחר שינויים תאיים לאורך זמן, ובכך מספקת תובנות לגבי תהליכי הזדקקות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- ביולוגיה של התא
- טכניקות דימוי
רקע
- מעקב אחר תאי שמרים הפלואידיים בודדים במהלך תקופת חייהם הוא קריטי להבנת ההזדקנות התאית.
- שיטות מסורתיות כמו מיקרו-דיסקציה הן עתירות עבודה ופחות יעילות למחקרים ארוכי טווח.
- טכנולוגיה מיקרו-פלואידית מציעה חלופה יעילה יותר לתצפית רציפה.
- מיקרוסקופיית שדה בהיר (Brightfield) ופלואורסצנציה יכולות לחשוף שינויים מורפולוגיים ושינויים בביטוי חלבונים החשובים למחקר.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה למעקב אחר תאי שמרים בודדים לאורך כל תקופת חייהם.
- הדמיה של שינויים במורפולוגיה של התאים ובמיקום החלבונים במהלך ההזדקנות.
- שיפור טכניקות קלאסיות על ידי אספקת גישה הדורשת פחות עבודת כפיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יצירת שבב מיקרופלואידי עם מערך של רפידות מיקרו (micro pads).
- טעינת תאי שמרים לתוך השבב המיקרופלואידי.
- החלה של זרימה רציפה של מצע טרי לשמירה על חיוניות התאים.
- שימוש במיקרוסקופיה למעקב אחר שינויים תאיים לאורך זמן.
תוצאות עיקריות
- מעקב מוצלח אחרי תאי שמרים בודדים לאורך כל תקופת חייהם הרפליקטיבית.
- תצפית על שינויים במורפולוגיה של התא והאורגנלות.
- תיעוד של וריאציות בביטוי חלבונים ובמיקומי הלוקליזציה שלהם בתאים מזדקנים.
- הדגמת היתרונות של טכניקות מיקרופלואידיקה על פני שיטות מסורתיות.
מסקנות
- ההתקן המיקרופלואידי מאפשר דימיון ברזולוציה גבוהה של תאי שמרים.
- שיטה זו מספקת תובנות בעלות ערך לגבי תהליך ההזדקנות של תאים.
- היא מהווה התקדמות משמעותית בחקר הביולוגיה התאית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
תצפית מיקרוסקופית רציפה ברזולוציה גבוהה של הזדקנות רפליקטיבית בשמרים בתנבוב (budding yeast) מאפשרת מעקב אורך מדויק של פנוטיפים של תאים בודדים תחת תנאים מוגדרים. פלטפורמה מיקרופלואידית זו תומכת בבדיקה חסונה של היפותזות לגבי מנגנוני הזדקנות תאית, ומספקת ביטחון חיזוי עבור תהליכי גילוי מוקדם ותיקוף מטרות. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות בנושאי פורטפוליו על ידי אספקת נתונים כמותיים הניתנים לשחזור על דינמיקה תאית ושל אברונים לאורך תקופת החיים הרפליקטיבית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של היפותזות הקשורות להזדקנות ברמת התא הבודד.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי ויזואליזציה של לוקליזציית חלבונים ושינויים מורפולוגיים לאורך זמן.
- מקל על תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות תצפית כמותית ורציפה של תוצאות פנוטיפיות.
- מספק נתונים בעלי תוכן גבוה להזנה של מודלים חיזויים ותעדוף תיקי פיתוח.
סקר ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין מערכות תאים חיים שעברו תיקוף לצורך סריקה המשכית של מודולטורים המשפיעים על תוחלת חיים רפליקטיבית.
- מספק פלט דימוג סטנדרטי וניתן לשחזור המתאים לפיתוח בדיקות כמותיות.
- מאפשר ניטור אוטומטי וניתן להרחבה של עד 50 תאים בודדים לכל ניסוי.
- תומך בהערכה אמינה של השפעת תרכובות על פנוטיפים של הזדקנות תאית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות שבהם הזדקנות תאית או סנסנצנס (senescence) מהווים מנגנון מרכזי.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות למעקב אורך של סמנים ביולוגיים.
- מפחית את הסיכון הטרנסלציוני באמצעות יצירת מערכי נתונים כמותיים המעוגנים מבחינה מנגנונית.
- תומך בקבלת החלטות מותאמות-סיכון לקידום תוכניות טיפוליות הקשורות להזדקנות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו של דימיון מיקרופלואידי משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות מוקדמת דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, שבהם רזולוציה של תא בודד ונתונים ארוכי טווח הם קריטיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת במחקרים מבוססי היפותזה של הזדקנות רפליקטיבית ובירור מסלולים ביולוגיים.
- סינון: מספקת מערכות הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה לצורך הערכת התערבויות על פנוטיפים של הזדקנות.
- אנליטיקה: מייצרת עקומי תוחלת חיים כמותיים ומדדים מורפולוגיים להשוואה סטטיסטית רחבה.
- מחקר תרגומי: מאפשרת התאמה לסממנים ביולוגיים של הזדקנות ולנקודות קצה מכניסטיות הרלוונטיות למודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה לסוגי תאים מגוונים ולשאלות ניסיוניות במחקר ההזדקנות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי הזדקנות.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה סטנדרטיות, ניתנות להרחבה ואוטומטיות לניטור תאים רציף.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) ויעילות הון על ידי אספקת נתונים בעלי תוכן גבוה וניתנים לשחזור.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מטרות ותוכניות הקשורות להזדקנות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור שבבים מיקרופלואידיים ובדימות תאים חיים.
- דורש גישה לתשתיות מיקרוסקופיה של שדה בהיר ופלואורסצנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים עבור ייצור השבבים וניתוח הנתונים.
- ניתן להתאמה למערכות מודל אחרות באמצעות אופטימיזציה מתאימה של ממדי השבב ופרמטרי הזרימה.
- שלבי הטעינה והטיפול עשויים לדרוש תרגול כדי להבטיח הדירות ולמזער שונות טכנית.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Production and Preparation of a Silicon Wafer Mold
2:14
Production of Microfluidic Chips
10:04
Conclusion
5:10
Preparing the Chip for Cell Loading
6:20
Loading of Yeast Cells into the Microfluidic Chip
7:53
Results: Observation of Replicative Aging of Budding Yeast
