לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור חוסר יציבות גנומית תלוית גיל בשמרים על ידי שילוב תוחלת החיים הכרונולוגית עם קבוצה של מבחני נזק ומוטציות פשוטות ל-DNA. זה מושג על ידי דגימה ראשונה של תרביות הזדקנות כרונולוגיות כל יומיים ובדיקת כדאיות על ידי יחידת יצירת מושבה או היווצרות CFU. השלב הבא בהליך הוא לבחון את מוטציות ה-DNA על ידי דגימת תרביות הזדקנות וציפוי תאים על מדיום בחירה ספציפי למוטציה.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים במוטציות ה-DNA במהלך הזדקנות כרונולוגית של שמרים באמצעות נורמליזציה של תוצאות בדיקת המוטציות לכדאיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההזדקנות, כגון המנגנונים המקשרים בין הזדקנות וחוסר יציבות גנומית באריה כדי לבחון את תוחלת החיים הכרונולוגית של השמרים או CLS יש לחסן תחילה מושבת שמרים בודדת למיליליטר אחד של גלוקוז מלא סינתטי, או מדיום SDC ולדגור למשך הלילה עם טלטול ב-30 מעלות צלזיוס למחרת. מדללים את תרבית הלילה ל-10 מיליליטר של מדיום SDC טרי ל-OD 600 של 0.05 עד 0.1 דגירה עם טלטול ב-30 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים.

ביום השלישי, כאשר התאים נמצאים בשלב נייח, יש לדלל כל Eloqua 10,000 פעמים במי חיטוי, ואז להסיר שני ליטרים של 10 מיקרוליטר מהבקבוק וצלחת 10 מיקרוליטר מכל תרבית מדוללת על צלחת A-Y-E-P-D. דגרו על הצלחת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד שנוצרו מושבות. מספר המושבות שנוצרו או יחידות יוצרות מושבות מהיום השלישי נחשב ל-100% הישרדות.

המשך להסיר אליקוטים מתרבית ההזדקנות בימים שלאחר מכן לצורך ציפוי. התאמת גורמי הדילול בהתאם כדי להבטיח כ-20 עד 100 מושבות בבדיקת CFU. הדגימה נעצרת כאשר כדאיות התרבית ירדה מתחת ל-1% בדרך כלל בין הימים 11 ל-13, ניתן לחקור את כדאיות התאים גם בתאים המיושנים על צלחות.

כדי להתחיל בבדיקה זו יש לחסן מושבה בודדת למיליליטר אחד של מדיום גלוקוז מלא סינתטי, ולדגור למשך הלילה עם טלטול ב-30 מעלות צלזיוס. כאשר התרבית גדלה לכ-10 עד שמינית תאים למיליליטר, יש לדלל את התרבית במי חיטוי ל-100 עד 200 תאים ל-10 מיקרוליטר ו-1000 תאים ל-10 מיקרוליטר. עבור כל זן, הכינו סט של שמונה עד 20 צלחות SDC נשירה של טריטופן המסומנות לפי צפיפות הציפוי.

כדי להבטיח שניתן לספור 10 עד 100 מושבות בציפייה לירידה בכדאיות במהלך ההזדקנות, צלחת שתי כמויות של 10 עד 30 מיקרוליטר של תרבית מדוללת על כל צלחת. דגרו את הצלחת שנקבעה על 30 מעלות צלזיוס למשך ניתוח תוחלת החיים ביום הציפוי וכל יומיים לאחר מכן, הסירו צלחת אחת והוסיפו 0.5 מיליליטר טריטופן כדי לאפשר לתאים ברי קיימא לצמוח. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 48 עד 72 שעות נוספות.

לאחר 48 עד 72 שעות. ספרו את ה-CFU עבור הכדאיות ליום מהדורת הטריפטופן כדי לבחון ארבעה נזקי DNA ותדירות מוטציות במהלך הזדקנות כרונולוגית. מספר מוזרים עם מאפיינים מיוחדים גדלים במקביל לזן מסוג הבר לבדיקת CLS של שמרים.

ניתן להעריך את תדירות המוטציות הספונטניות על ידי מדידת תדירות ההתנגדות ל-canna vanning בתרבית מזדקנת כרונולוגית. מוטציות בגן הפחית אחד המקודד את פרמז ארגינין בפלזמה הופכות תאים לעמידים לאנלוגי ארגינין L Canavan תאים עמידים לקנוואן יגדלו על נשירה של ארגינין צלחות בינוניות שלמות סינתטיות בתוספת מדידת L Canavan sulfate של תדירות החזרה חיובית לטריפ בזן המכיל מוטציה ענבר בטריפ. רצף ציפוי אחד מאפשר להעריך את קצב החלפת הבסיס במהלך טיול הזדקנות כרונולוגי של שמרים.

תאי היפוך חיוביים יגדלו על צלחות נשירה של טריפטופן. הזן השלילי של הליז EH one 50 מכיל שינוי פלוס ארבע במסגרת הקריאה הפתוחה, מה שמביא לניוון שור עבור ליזין, וזה יכול להיות הפוך על ידי מוטציות החדרה או מחיקה קטנות. המחזירים ייבחרו על לוחות נשירה של ליזין כדי לזהות סידורים מחדש כרומוזומליים גסים או gcr.

נעשה שימוש בזן מוטנטי שבו HX T 13 ממוקם 7.5 קילובסיסים טלומריים לאחד על כרומוזום חמש מופרע על ידי מוטציות U שלוש קלטות בשני הגנים יכול אחד ו-U שלושה הופכים תאים לעמידים ל-L Canavan וחמישה חומצה אורוטית פלואורו, בהתאמה. מכיוון שתדירות המוטציות הנקודתיות המתרחשות בשני הגנים נמוכה, ניתוח של תדירות העמידות הן לאל קנוואן והן לחומצה אורוטית פלואורו מספק הערכה של gcr כדי לנטר את רמת הרקומבינציה ההומולוגית וההומולוגית. במהלך ההזדקנות הכרונולוגית נוצרות מוטציות הנושאות 100% חזרות הפוכות הומולוגיות או 91% הומולוגיות.

מס הכנסה בשלושת המיקומים שלו רקומבינציה בין מס הכנסה מאפשר ביטוי תפקודי שלושת החלבונים שלו. לכן, תאים בהם התרחש רקומבינציה יגדלו על צלחות נשירה של היסטידין בתוספת גלקטוז. ביום השלישי, כאשר התאים נמצאים בשלב נייח וכמות מתאימה של תאים תוסר מכל תרבית הזדקנות.

מכיוון שאותו הליך משמש עבור כל הבדיקות, רק דגימה אחת תעובד. לצורך הסרטון הזה, גלולה את התאים על ידי סיבוב בצנטריפוגה על שולחן. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים במיליליטר אחד של כדור מים חיטוי.

שוב, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא ב-100 מיקרוליטר של תאי צלחת מים על הצלחות המתאימות כדי לבחור את ההחזרות הרצויות. דגירה של צלחות ב-30 מעלות צלזיוס לאחר שלושה עד ארבעה ימים של ספירת CFUs, תדירות המוטציות מנורמלת למספר התאים הקיימאים. גרף זה מציג תוצאות מייצגות ממבחן תוחלת חיים כרונולוגי טיפוסי כאשר משווים את ההישרדות הכרונולוגית של תאים מסוג בר לזו של S, CH, תשע דלתא, TOR דלתא אחת ו-RAs, שתי מוטציות דלתא.

בתרבית נוזלית, מוטציות חסרות TOR 1 s, CH 9 או RAs 2 מראות תוחלת חיים כרונולוגית ארוכה. יתר על כן, חוסרים ב-s CH 9 ו-RAs 2 מראים השפעה נוספת על הישרדות כרונולוגית לקידום אריכות ימים בנוכחות מקורות פחמן שונים. שימוש במבחן הכדאיות של NC 2 מוצג בגרף הבא הזה.

ביום הראשון, תרביות מסוג בר SDC דוללו וציפו על צלחות נשירה של טיול SC ללא מקור פחמן. צלחות נשירה של SC Tripp בתוספת גלוקוז, אתנול או צלחות גליצרול אוראטס הודגרו ב-30 מעלות צלזיוס כל יומיים. צלחת אחת נלקחה מכל קבוצה ונוספו חומרים מזינים מתאימים כדי לאפשר צמיחה ויצירת מושבה.

תדירות המוטציות תלויות הגיל משתנה מאוד בהתאם לזן, הרקע, המניפולציה הגנטית, התרבות, התנאים והגיל. טבלה זו מציגה תוצאות אופייניות המתקבלות בזן מסוג פראי. תוצאות מייצגות של סינתזת נגע טרנס מוצגות בתמונה הבאה.

העלייה בתדירות המוטציות התלויה בגיל עשויה לכלול שינויים בתיקון DNA שגוי באמצעות תמציות גרעיניות ותבניות DNA שונות. אנו יכולים להעריך את סינתזת התרגום או TLS בתאים המבוגרים מבחינה כרונולוגית. נותחו תמציות גרעיניות משלב נייח בן שלושה ימים, סוג פרא ותאי מוטציה של SCH תשע דלתא.

מוצרי TLS עם תבנית לא פגומה מסומנים בקווים מלאים ומוצרי TLS עם תבנית פגומה מסומנים בקווים מקווקוים. לא נצפתה סינתזת נגע טרנס בתמציות גרעיניות מ-s CH ארוך החיים, תשעה פריימרים חופשיים ממוטציה של דלתא מסומנים על ידי החץ הפתוח. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע תוחלת חיים כרונולוגית וניתוח מוטציות DNA בשמרים.