Name: לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: למדו לחקור חוסר יציבות גנומי תלוי גיל ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות מבחני תוחלת חיים כרונולוגית ותדירות מוטציות DNA. שיטה זו מאפשרת לזהות מנגנונים המקשרים בין הזדקנות לבין אי-יציבות גנומית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ס Jinks רוברטסון וא Heidenreich למתן פלסמידים זני שמרים, פ &#39;פאם גודמן MF עבור assay לעזור withthe TLS. עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי הפדרציה האמריקאית לחקר הזדקנות מענק על ידי AG20642 NIH, AG025135.

<ol><li>Longo, V. D., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+medicine%3A+from+dwarf+model+systems+to+healthy+centenarians%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolutionary medicine: from dwarf model systems to healthy centenarians.</a> Science. 299, 1342-1346 (2003).</li>
<li>Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+healthy+life+span--from+yeast+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extending healthy life span--from yeast to humans.</a> Science. 328, 321-326 (2010).</li>
<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183, 1751-1752 (1959).</li>
<li>Muller, I., Zimmermann, M., Becker, D., Flomer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calendar+life+span+versus+budding+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Calendar life span versus budding life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech. Ageing Dev. 12, 47-52 (1980).</li>
<li>Jazwinski, S. M., Egilmez, N. K., Chen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+control+and+cellular+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Replication control and cellular life span.</a> Exp. Gerontol. 24, 423-436 (1989).</li>
<li>Pohley, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formal+mortality+analysis+for+populations+of+unicellular+organisms+%28Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A formal mortality analysis for populations of unicellular organisms (Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech Ageing Dev. 38, 231-243 (1987).</li>
<li>Longo, V. D., Gralla, E. B., Valentine, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+activity+is+essential+for+stationary+phase+survival+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Mitochondrial+production+of+toxic+oxygen+species+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae. Mitochondrial production of toxic oxygen species in vivo.</a> J Biol Chem. 271, 12275-12280 (1996).</li>
<li>Longo, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.+Studies+of+superoxide+dismutase%2C+Ras+and+Bcl-2+%5B%5D%22">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Studies of superoxide dismutase, Ras and Bcl-2 [dissertation]</a>. , University of California Los Angeles. California Los Angeles. (1997).</li>
<li>Fabrizio, P., Pozza, F., Pletcher, S. D., Gendron, C. M., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+longevity+and+stress+resistance+by+Sch9+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of longevity and stress resistance by Sch9 in yeast.</a> Science. 292, 288-290 (2001).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2, 73-81 (2003).</li>
<li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li>
<li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+extension+by+calorie+restriction+depends+on+Rim15+and+transcription+factors+downstream+of+Ras%2FPKA%2C+Tor%2C+and+Sch9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Life span extension by calorie restriction depends on Rim15 and transcription factors downstream of Ras/PKA, Tor, and Sch9.</a> PLoS Genet. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Fabrizio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166, 1055-1067 (2004).</li>
<li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tor1%2FSch9-regulated+carbon+source+substitution+is+as+effective+as+calorie+restriction+in+life+span+extension%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tor1/Sch9-regulated carbon source substitution is as effective as calorie restriction in life span extension.</a> PLoS Genet. 5, e1000467-e1000467 (2009).</li>
<li>Capizzi, R. L., Jameson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+table+for+the+estimation+of+the+spontaneous+mutation+rate+of+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A table for the estimation of the spontaneous mutation rate of cells in culture.</a> Mutat Res. 17, 147-148 (1973).</li>
<li>Heidenreich, E., Novotny, R., Kneidinger, B., Holzmann, V., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-homologous+end+joining+as+an+important+mutagenic+process+in+cell+cycle-arrested+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Non-homologous end joining as an important mutagenic process in cell cycle-arrested cells.</a> Embo J. 22, 2274-2283 (2003).</li>
<li>Heidenreich, E., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-dependent+and+selection-induced+mutations+in+respiration-competent+and+respiration-deficient+strains+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Replication-dependent and selection-induced mutations in respiration-competent and respiration-deficient strains of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 260, 395-400 (1998).</li>
<li>Chen, C., Kolodner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+chromosomal+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+replication+and+recombination+defective+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants.</a> Nat Genet. 23, 81-85 (1999).</li>
<li>Datta, A., Adjiri, A., New, L., Crouse, G. F., JinksRobertson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+crossovers+between+diverged+sequences+are+regulated+by+mismatch+repair+proteins+in+Saccaromyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic crossovers between diverged sequences are regulated by mismatch repair proteins in Saccaromyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16, 1085-1093 (1996).</li>
<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1%2FPolzeta-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li>
<li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+recombinant+genes+and+preparation+of+cell-free+extracts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast.</a> Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Pletcher, S. D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronological+aging-independent+replicative+life+span+regulation+by+Msn2%2FMsn4+and+Sod2+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).</li>
<li>Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+quiescent+and+nonquiescent+cells+from+yeast+stationary-phase+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures.</a> J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).</li>
<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+mutation+in+SCH9+prevents+recombination+errors+and+premature+genomic+instability+in+a+Werner%2FBloom+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system.</a> J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תרבויות הזדקנות נוזלי מתישהו התערוכה לצמיחה מחודשת / פנוטיפ מתנשם 13, אשר מסבך את ניתוח CLS. לצמיחה מחודשת מתרחשת בדרך כלל כאשר יותר מ 90-99% מכלל האוכלוסייה איבדה את יכולת הקיום. פנוטיפ זו קשורה לעיתים קרובות עם סטרס חמצוני מוגבר ו / או הגנה ירד בתא. לדוגמה, תדירות פנוטיפ זה יותר מאשר מכפיל בתאים חסר superoxide dismutase cytosolic ו מקטינה באופן משמעותי על חיים ארוכים מוטנטים (למשל, או ras2 sch9 Δ Δ) או superoxide מוטנטים overexpressing dismutases 22. למעשה, אנו מגדירים לצמיחה מחודשת כמו גידול הכדאיות או התייצבות הכדאיות עבור 3 דגימות רצופות בשלב תמותה גבוה במהלך ההזדקנות הכרונולוגי. גיל תלויי תדרים של מוטציות DNA שונה להשתנות במידה רבה בהתאם ברקע זן, מניפולציה גנטית, בתנאי תרבות, כמו גם לצמיחה מחודשת / מתנשפת הישרדות נמוכים מאוד. טרום ניסויים אמור להתבצע בנקודות זמן כמו ההישרדות הממוצע ומקסימום עם צפיפות ציפוי שונים עבור מבחני מוטציה כדי לקבוע תדירות טווח מוטציה לפני performingthe חיים מלאים ניתוח בקנה מידה תוחלת. המתח סוג בר תמיד צריך להיות כלול תוחלת חיים או תדירות מוטציה ללמוד במקביל כל טיפול או מוטציה גנטית, כך הניסוי בין-וריאציות ניתן להסביר. העתקים מרובים ביולוגי יש לכלול במחקר וכן, גם נוזלי וגם כדאיות / מוטציה מבחני באתרו צריך להתבצע כדי לאשש את התוצאות. במקום להתמקד בסוג אחד מסוים של מוטציה בדנ&quot;א, אפיון של חוסר יציבות גנומית תלויי גיל באמצעות מבחני מרובים שילוב, עשוי לשפוך אור על נזק לדנ&quot;א ספציפי נזק לדנ&quot;א תיקון המערכת (ים) אשר תורמים לחוסר יציבות גנומית תלויי גיל. לדוגמה, עלייה משמעותית rearrangements כרומוזומליות הגולמי (GCRs), בהשוואה לאלו של מוטציות DNA אחרות, הוא ציין בשמרים סוג בר מציע לשבור elevationof גדיל כפול ו / או ליקוי בסופו שאינם הומולוגיים שהצטרף (NHEJ) במהלך שמרים הזדקנות כרונולוגי (טבלה 2). ספקטרום מוטציה can1 (רצף של הגן CAN1) שהושגו שמרים wild-type ההזדקנות הציע עלייה נזק חמצוני במהלך ההזדקנות הכרונולוגי מועדת לטעויות תיקון DNA, ואילו, על חיים ארוכים sch9 מוטנטים Δ, נזק לדנ&quot;א חמצוני פחות מופחת בהרבה נוטה שגיאה סינתזה translesion נצפו 20. שיטות המתואר כאן ניתן ללמוד עוד הגדילו גיל תלויי חוסר יציבות גנומית. לדוגמה, תאים שקט ולא שקט יכול להיות מבודד נייח שלב תרבויות שמרים באמצעות שיפוע צפיפות השיטה המתוארת על ידי Allen et al. 23. בשילוב עם מבחני המוטציה המתוארת כאן, יש לנו דיווח כי חלק גדול תלויי גיל מוטציות נובעת תאים שקט, ולא, חלוקת תאים פגומים או אפופטוטיים 20,24.

לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

מחקרים באמצעות מודל cerevisiae Saccharomyces הזדקנות חשפו תוחלת החיים המסלולים רגולטוריות אשר נשמרת חלקית אאוקריוטים גבוה 1-2. הפשטות והכוח של המודל שמרים הזדקנות יכול גם להיחקר ללמוד נזק לדנ&quot;א ותחזוקה הגנום, כמו גם תרומתם מחלות במהלך ההזדקנות. הנה, אנחנו מתארים מערכת ללמוד בגיל תלויי מוטציות DNA, כולל החלפות בסיס, מסגרת משמרת מוטציות, rearrangements כרומוזומליות ברוטו, ו הומולוגיים / homeologous רקומבינציה, כמו גם פעילות גרעינית תיקון DNA על ידי שילוב של כרונולוגי שמרים תוחלת החיים עם ה-DNA פשוטה נזק מבחני מוטציה. השיטות שתוארו כאן יש להקל על זיהוי של גנים / מסלולים המווסתים יציבות גנומית ואת המנגנונים העומדים בבסיס תלויי גיל מוטציות DNA וסרטן אצל יונקים.

כאן אנו מתארים קבוצה של מוטציה מבחני DNA כי ניתן בשילוב עם המודל הכרונולוגי שמרים תוחלת החיים כדי לחקור את הגנים / מסלולים המווסתים או לתרום יציבות הדנ&quot;א הגנומי במהלך ההזדקנות.

מחקרים המשתמשים במודל ההזדקנות של *Saccharomyces cerevisiae* חשפו מסלולי בקרה של תוחלת חיים השמורים באופן חלקי באיקריוטים גבוהים יותר1-2. ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור חוסר יציבות גנומית תלוית-גיל בשמרים, באמצעות שילוב של תוחלת חיים כרונולוגית עם קבוצה של בדיקות פשוטות לנזקי DNA ומוטציות. דבר זה מושג תחילה על ידי דגימה של תרביות הזדקנות כרונולוגית מדי יומיים ובדיקת חיות באמצעות ספירת יחידות יוצרות מושבות או CFU. השלב הבא בפרוצדורה הוא בחינת מוטציות ב-DNA על ידי דגימת תרביות מזדקנות וזריעת תאים על מצע ברירה ספציפי למוטציות.בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות שינויים במוטציות של DNA במהלך הזדקנות כרונולוגית של שמרים, באמצעות נורמליזציה של תוצאות בדיקת המוטציות ביחס לחיוניות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההזדקנות, כגון המנגנונים הקושרים בין הזדקנות לאי-יציבות גנומית. כדי לבצע בדיקה של תוחלת חיים כרונולוגית של שמרים או CLS, ראשית יש להחדיר מושבה בודדת של שמרים לתוך מילליטר אחד של תווך גלוקוז סינתטי מלא, או תווך SDC, ולהדגיר למשך לילה עם ניעור בטמפרטורה של 30 °C. למחרת, יש לדלל את תרבית הלילה לתוך 10 מיליליטר של תווך SDC טרי עד ל-OD 600 של 0.05 עד 0.1, ולהדגיר עם ניעור בטמפרטורה של 30 °C למשך שלושה ימים.ביום השלישי, כאשר התאים נמצאים בשלב התחנה (stationary phase), דללו כל דגימה של Eloqua פי 10,000 במים שעברו אוטוקלאב, לאחר מכן הוציאו שני מנות (aliquots) של 10 µL מהבקבוק והעבירו 10 µL מכל תרבית מדוללת לצלחת A-Y-E-P-D. הדגרירו את הצלחת בטמפרטורה של 30 °C עד להופעת מושבות. מספר המושבות שהופיעו או יחידות יוצרות מושבות (CFU) מהתרבית של היום השלישי ייחשבו כ-100% הישרדות.המשיכו להוציא אליקוטיות מהתרבית המזדקנת בימים הבאים לצורך זריעה. התאימו את גורמי הדילול בהתאם כדי להבטיח קבלת כ-20 עד 100 מושבות בבדיקת ה-CFU. את הדגימה מפסיקים כאשר חיוניות התרבית יורדת מתחת ל-1% (בדרך כלל בין הימים 11 ל-13); ניתן לבחון את חיוניות התאים גם בתאים שהזדקנו על צלחות.כדי להתחיל במבחן זה, יש להחדיר מושבה בודדת לתוך מיליליטר אחד של מצע גלוקוז סינטטי מלא (synthetic complete glucose medium), ולדגרה למשך לילה עם ניעור בטמפרטורה של 30 °C. כאשר התרבית תגיע לצפיפות של כ-10⁸ תאים למיליליטר, יש לדלל את התרבית במים שעברו אוטוקלאב לריכוזים של 100 עד 200 תאים ל-10 µL ו-1000 תאים ל-10 µL. עבור כל זן, יש להכין סט של 8 עד 20 צלחות SDC ללא טריפטופאן, המסומנות בהתאם לצפיפות הזריעה.כדי להבטיח שניתן יהיה לספור בין 10 ל-100 מושבות, ובצפייה לירידה בחיוניות במהלך ההזדקנות, פזרו שתי מנות של 10 עד 30 µL של תרבית מדוללת על כל צלחת. דגרו את סט הצלחות בטמפרטורה של 30 °C למשך משך ניתוח אורך החיים; ביום הזריעה ובכל יומיים לאחר מכן, הוציאו צלחת אחת והוסיפו בטיפות 0.5 mL של trytophan כדי לאפשר לתאים חיוניים לגדול. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 30 °C למשך 48 עד 72 שעות נוספות.לאחר 48 עד 72 שעות, ספרו את ה-CFU לבדיקת החיוניות ביום הוספת הטריפטופן, כדי לבחון נזק ל-DNA ותדירות מוטציות במהלך הזדקנות כרונולוגית. מספר זנים בעלי תכונות מיוחדות גודלים במקביל עם זן הבר (wild type) עבור בדיקת CLS של השמרים.ניתן להעריך את תדירות המוטציות הספונטניות על ידי מדידת תדירות העמידות ל-L-Canavanine בתרבית המזדקנת כרונולוגית. מוטציות בגן can1, המקודד עבור פרמיאז ארגינין של הפלזמה, הופכות את התאים לעמידים לאנלוג של ארגינין, L-Canavanine. תאים העמידים ל-L-Canavanine יגדלו על מצעים סינתטיים מלאים עם השמטת ארגינין, המועשרו ב-L-Canavanine sulfate. מדידה של תדירות רברסיה חיובית של trip, בזן המכיל מוטציית amber ברצף המקודד של trip1, מאפשרת להעריך את קצב החלפת הבסיסים במהלך הזדקנות כרונולוגית של שמרים.תאי רורסיה (reversion) חיוביים יגדלו על מצעים דלילי טריפטופאן. זן הליזה השלילי EH1-50 נושא הסטה של +4 במסגרת הקריאה הפתוחה, הגורמת לאטרופיה של lysine, וניתן להפוך זאת על ידי מוטציות של הכנסה או מחיקה קטנה. הרורסנטים ייבחרו על מצעים דלילי lysine כדי לזהות ארגון מחדש גס של הכרומוזומים או gcr.נעשה שימוש במאבב מוטנטי שבו HX T 13, הממוקם במרחק של 7.5 kilobases מהקצה הטלומרי של can one בכרומוזום חמישה, משובש על ידי קסטת U three. מוטציות בשני הגנים can one ו-U three הופכות את התאים לעמידים ל-L Canavan ול-five fluoro orotic acid, בהתאמה. מכיוון שתדירות מוטציות נקודתיות המתרחשות בשני הגנים היא נמוכה, ניתוח של תדירות העמידות הן ל-El Canavan והן ל-five fluoro orotic acid מספק הערכה של gcr לצורך ניטור רמת הרקומינציה ההומולוגית והבלתי-הומולוגית. במהלך ההזדקנות הכרונולוגית נוצרים מוטנטים הנושאים חזרות הפוכות בעלות הומולוגיה של 100% או 91%.ה-IRS ב-locus של his3 מאפשר, באמצעות רקומבינציה בין ה-IRS, ביטוי של חלבון his3 פונקציונלי. לפיכך, תאים שבהם התרחשה רקומבינציה יגדלו על מצעי histidine dropout שנוספו להם גלקטוז. ביום השלישי, כאשר התאים נמצאים בשלב סטציונרי, תסיר כמות מתאימה של תאים מכל תרבית הזקנה.כיוון שאותו הליך משמש לכל הבדיקות, יעובד דגימה אחת בלבד. לצורך סרטון זה, יש להשקיע את התאים על ידי סבוב במ centri-fuge שולחני. הסר את הנוזל העליון (supernatant) ושחזר את התאים במיליליטר אחד של מי-אוטוקלאב.שוב, הסירו את הנוזל העליון וסספנדו מחדש את משקע התאים ב-100 µL של מים; פזרו את התאים על הפלטות המתאימות כדי לבחור את הרברטנטים (reverts) הרצויים. דגרו את הפלטות ב-30 °C, ולאחר שלושה עד ארבעה ימים ספרו את ה-CFUs; תדירות המוטציה מנורמלת למספר התאים החיוניים. גרף זה מציג תוצאות מייצגות מבדיקת תוחלת חיים כרונולוגית טיפוסית, כאשר הישרדות כרונולוגית של תאי wildtype מושווית לזו של מוטנטים מסוג S CH nine delta TOR one delta ו-RAs two delta.בתרבית נוזלית, מוטנטים החסרים את TOR one s, CH nine או RAs two מראים תוחלת חיים כרונולוגית מוארכת. יתרה מכך, חסרים ב-s CH nine וב-RAs two מראים אפקט מצטבר על קידום אריכות הימים והישרדות כרונולוגית בנוכחות מקורות פחמן שונים. שימוש בבדיקת חיוניות NC two מוצג בגרף הבא.ביום הראשון, תרביות של SDC מסוג פרא (wild type) דוללו ונזרעו על מצעי SC trip dropout ללא מקור פחמן. מצעי SC Tripp dropout שהוספו להם גלוקוז, אתנול או גליצרול (orates plates) דגרו בטמפרטורה של 30 °C מדי יומיים. מכל סט נלקח מצע אחד, ואליו הוספו חומרי תזונה מתאימים כדי לאפשר צמיחה ויצירת מושבות.שכיחות מוטציות התלויה בגיל משתנה מאוד בהתאם לזן, לרקע, למניפולציה גנטית, לתרבית, לתנאים ולגיל. טבלה זו מציגה תוצאות טיפוסיות שהתקבלו בזן מסוג בר (wild type). תוצאות מייצגות של סינתזת מעקף נגעים (trans lesion synthesis) מוצגות בתמונה הבאה.העלייה בתדירות המוטציות התלויה בגיל עשויה לכלול שינויים בתיקון DNA שגוי תוך שימוש בתמציות גרעיניות ובתבניות DNA שונות. ניתן להעריך את הסינתזה הטרנסלטיבית או TLS בתאים מזדקנים כרונולוגית. נותחו תמציות גרעיניות מתאי מסוג wild type ומתאי מוטנט SCH nine delta, שנמצאים בשלב סטציונרי בגיל שלושה ימים.מוצרי TLS עם תבנית לא פגועה מסומנים בקוים רציפים ומוצרי TLS עם תבנית פגועה מסומנים בקוים מקווקווים. לא נצפתה סינתזה חוצת נגע (trans lesion synthesis) בתמציות גרעיניות של המוטנט s CH nine delta ארוך החיים; פריימרים חופשיים מסומנים בחץ פתוח. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ביצוע ניתוח אורך חיים כרונולוגי וניתוח מוטציות ב-DNA בשמרים.

studying-age-dependent-genomic-instability-using-s-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הזדקנות בשמרים כרונולוגית מתייחס לאובדן של כדאיות התא הקשורים זמן בשלב נייח. כאן אנו מתארים את שיטת תפוקה גבוהה עבור כמותית בקביעת תוחלת החיים בשמרים כרונולוגי.

כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני

במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת חיים replicative טווח של תאים אמא שמרים.

מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

אנו מתארים כאן את הפעולה של מכשיר microfluidic המאפשר הדמיה מיקרוסקופית רציפה ורזולוציה גבוהה של תאי שמרי ניצנים בודדים במהלך replicative המלא ו / או תוחלת החיים כרונולוגית.

תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה

שיעורי מוטציה בתאי cerevisiae Saccharomyces הצעיר נמדדו באמצעות בדיקות תנודות משמשים כדי לחזות תדרי מוטציה בתאי אמא של גילאי replicative שונים. מיון וcytometry זרימה מגנטי משמש לאחר מכן למדידת תדרי מוטציה בפועל וגיל של תאי אם לזהות כל חריגה מתדרי מוטציה חזו.

שילוב מיון מגנטי של תאי אמא ומבחני תנודות לנתח חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic ב Saccharomyces cerevisiae

מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם לייצור שבבי microfluidic ואת ההתקנה של ניסויים microfluidic כדי למדוד את אורך החיים פנוטיפים הסלולר של תאי שמרים בודד.

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

כאן נתאר שיטת עותקים משוכפלים, גישה באופן כמותי מודדים C. elegans תוחלת החיים/הישרדות, healthspan באופן תפוקה גבוהה וחזק, ובכך לאפשר הקרנה של מצבים רבים מבלי להתפשר על איכות הנתונים. פרוטוקול זה מפרט את האסטרטגיה, ומספק כלי תוכנה לניתוח של נתונים המשוכפלים.

השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

הנה פרוטוקול לזיהוי אינטראקציות גנטיות באמצעות מסך מדכא מספר עותק מוגבר ב Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות, לשבט ולבדוק מדכאי מוטנטים שמרים קצרי מועד. אנו בודקים את ההשפעה של הגדלת מספר עותק של SIR2 על תוחלת החיים במוטציה null autophagy.

מסך מדכא לאפיון קישורים גנטיים ויסות תוחלת חיים כרונולוגית ב Saccharomyces cerevisiae

פלטפורמת ההדמיה "מכונת תוחלת החיים" הופכת את התצפית לכל החיים על אוכלוסיות גדולות לאוטומטית. אנו מראים את השלבים הנדרשים לביצוע בדיקות תוחלת חיים, עמידות ללחץ, פתוגנזה והזדקנות התנהגותית. איכות והיקף הנתונים מאפשרים לחוקרים לחקור התערבויות בהזדקנות למרות נוכחות שונות ביולוגית וסביבתית.

מבחני הזדקנות ותוחלת חיים התנהגותיים בעלי תפוקה גבוהה באמצעות מכונת תוחלת החיים

אנו מתארים assay איכותי עבור הידבקות שמרים הפלישה אגר כאמצעי בידול פולשני pseudohyphal. Assay זה פשוט יכול לשמש כדי להעריך את פנוטיפ פולשני של מוטנטים שונים, כמו גם את ההשפעות רמזים סביבתיים איתות המסלולים על בידול שמרים.

Assay עבור הידבקות ואת הפלישה אגר ב cerevisiae ס

GFP-Fusion חלבונים נמצאים בשימוש נרחב כדי להמחיש האברונים ידי מיקרוסקופיה confocal. אולם, ההקרנה של מוטציות המשפיעות על המורפולוגיה של האברונים בדרך כלל דורש mutagenesis הפרט היא זמן רב. הנה, אנחנו מדגימים שיטה לשלב בו זמנית אברון-GFP סמנים כמעט 5,000 שאינם חיוניים גנים בשמרים.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

למדו לחקור חוסר יציבות גנומי תלוי גיל ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות מבחני תוחלת חיים כרונולוגית ותדירות מוטציות DNA. שיטה זו מאפשרת לזהות מנגנונים המקשרים בין הזדקנות לבין אי-יציבות גנומית.

לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים

גלה סרטונים נוספים