טכניקות לעיני עיבוד מושתלים בתותב רשתית למותאם למקום Histopathological ניתוח: חלק 2 Epiretinal שתלים עם נעצי רשתית
14 בפברואר 2015
כאן אנו מתארים טכניקות היסטולוגיות להדמיית רקמת עין הסמוכה ישירות למתכת אפירטינלית ותותבת רשתית.
פרוטזות רשתית עם רכיבי מתכת קשיחים אינן תואמות לתהליכים היסטולוגיים מסורתיים. כאן אנו מתארים טכניקות להערכת בריאות העין בסמוך ישירות לשתל רשתית המקובע באופן אפי-רטינלי באמצעות T ממתכת. הדבר מתבצע תחילה על ידי גרעין וקיבוע של העין לפי הפרוטוקול המתואר בסרטון נלווה, ולאחר מכן על ידי חיתוך דגימת רקמה, הכוללת את השתל ואת ה-T הרטינלי. השלב השני הוא ייבוש הדרגתי של דגימת הרקמה ולאחר מכן שיבוכה בשרף אפוקסי בכיוון הרצוי באמצעות תהליך שיבוש דו-שלבי. לאחר מכן, בלוק השרף הסופי מורכב במחזיק מיוחד ונשחקים באופן הדרגתי עד לחשיפת חתך רוחבי דרך השתל ורקמת העין שמסביבו ברמה הרצויה.
השלב הסופי הוא ביצוע צביעת שטח של הרקמה החשופה, ולאחר מכן הדמיה וצילום באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה בעוצמה גבוהה כדי להדמיות את הארכיטקטורה התאית הסמוכה לפרוטזה שהושתלה. שלבים אלו חוזרים על עצמם מספר פעמים לפי הצורך. בסופו של דבר, נאספת סדרה של תמונות בחתך רוחב דרך דגימת הרקמה, כולל השתל in situ, אשר עשויות לשמש לשיפור עיצוב המכשיר או הניתוח, וכן לסייע בהערכת הבטיחות של הפרוטזה הספציפית.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו היסטולוגיה מסורתית המבוססת על חיתוך בעזרת להב, הוא שניתן להשאיר עצמים שהושתלו בלב הרקמה, כולל רכיבים מתכתיים, במקומם (in situ) במהלך הפרוצדורה, מה שמאפשר ויזואליזציה של הממשק שבין השתל לרקמה. שיטה זו יכולה להשיב על שאלות מפתח בתחום הפרוטזות הרטינליות, כגון הערכת השלמות המבנית של רקמת העין העדינה הסמוכה לפרוטזה רטינלית מושתלת. לאחר עקירת העין (enucleation) וקיבוע כפי שמתואר בסרטון JoVE נלווה, בצעו ויזואליזציה של השתל ושל הנקודה שבה הוא מקובע לחלק החיצוני של העין.
השתמשו בלהב של 15 מעלות. בצעו חתך היקפי דרך הקרנית והסירו את כיפת הקרנית כדי לחשוף את פנים גלגל העין. שימו לב כי העדשה הוסרה קודם לכן במהלך ה-lensectomy vitrectomy, המהווה חלק מההליך הכירורגי עבור שתל אפי-רטינלי זה.
לאחר מכן, בצעו דיסקציה, והסירו את הקשת ואת שאריות סיבי ה-Z של העדשה כדי לחשוף את הלשכה האחורית עם השתל האפי-רטינלי (epiretinal) ואת ה-T המתכתי במקומם. בהתאם להשתל ולמחקר המבוצע, הסירו רכיבים מיותרים לפני המשך הדיסקציה. בדוגמה הנוכחית, המערך האפי-רטינלי הנבחן מורכב מאב-טיפוס של חבילת אלקטרודות יהלום הרמטית ואלקטרוניקה, השוכנים בתוך נשא סיליקון קונפורמי.
בצעו דיסקציה זהירה של דגימה הכוללת את ה-tack והרקמה שסביבו בכיוון הרצוי. השתמשו במספרי דיסקציה עדינים כדי לחתוך רצועות בעובי מלא מחלקו האחורי של העין, כולל ה-sclera, ה-choroid והרשתית. בשלב זה, הוציאו בזהירות את מארז אלקטרודת היהלום באמצעות דיסקציה עדינה עם סכין מנתחים.
השאירו את גוף הסיליקון של השתל יחד עם סיכת הרשתית ושאריות חיווט הפלטינה. קחו דגימה המעניקה חתךlongitudinal של הסיכה, המראה את כל שכבות הרשתית הסמוכות לסיכה. לאחר מכן, החזירו את הדגימה ל-70%Ethanol.
בצעו דהידרטציה לדגימה במשך שלושה ימים בשלבי אתנול הדרגתיים. ראשית, בצעו דהידרטציה לדגימה ב-70% ethanol למשך שעתיים, פעמיים. לאחר מכן, בצעו דהידרטציה לדגימה ב-80% ethanol למשך שעתיים פעמיים, ולאחר מכן, למשך הלילה של היום הבא, בצעו דהידרטציה לדגימה ב-90% Ethanol למשך שעתיים פעמיים; המשיכו בדהידרטציה של הדגימה ב-100% ethanol למשך שעתיים פעמיים, ולאחר מכן למשך הלילה.
לבסוף, בצעו דהידרציה לדגימה באצטון 100% למשך שעתיים, פעמיים. הוציאו את הדגימה מהאצטון ו obserו אותה תחת מיקרוסקופ אור בזמן שהיא מתייבשת באוויר בטמפרטורת החדר. הסרת הנוזלים מהרקמות הרכות גורמת לקריסת התאים ולהתכווצות.
את הדגימה יעבירו לאפוקסי רגע לפני שהיא מתחילה להתקמט ולקרוס. ההערכה של המועד שבו מתרחשים קימטוט וקריסת הרקמה נרכשת עם הניסיון. כדי להטמיע את הדגימה בשרף אפוקסי שקוף, טבל את רקמת העין באפוקסי מנוזל בתוך מכל מתאים הניתן לאטימה.
בצעו ניקוי בועות (degas) בעדינות לאפוקסי בתא ואקום והשאירו אותו למשך לילה בטמפרטורת החדר כדי שיתקשה. הקפידו להטמיע את הדגימה בכיוון הרצוי על ידי חיתוך של האפוקסי שהתקשה והדגימה באמצעות מסור סרט וליטוש. טבלו את הבלוק החתוך המכיל את רקמת העין באפוקסי נוזלי טרי, כך שהציר הארוך של הפיניט (tack) יהיה מקביל לתחתית התבנית. השתמשו בנקודה של דבק מהיר (super glue) כדי לקבע את הדגימה החתוכה לתחתית מחזיק הדגימות.
מלאו את מחזיק הדגימה באפוקסי מנוזל ובצעו ניתון אוויר (degas) כפי שנעשה קודם לכן, והשאירו להתמצק למשך לילה. לאחר מכן, רכבו את השרף במחזיק דגימות לשליפה ושחקו את הדגימה באופן ידני ב-230 עד 250 RPM עם זרימת מים באמצעות נייר סיליקון קרביד. לצביעה, טבלו את המשטח השחוק בצבע toine blue למשך שלוש עד חמש דקות או עד להתפתחות הצבע.
לאחר שטיפת הדגימה במי ברז, דמיינו את פני השטח השחוקים של הדגימה באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה בהגדלה גבוהה יותר. כדי להדמיא את השכבות התאיות של הרשתית, טפטפו טיפה של מים מזוקקים על פני השטח העליונים של האפוקסי, בדיוק מעל הדגימה, כדי להחליק את העקיפה בממשק שבין האוויר לאפוקסי.
השתמשו במקור אור מסוג gooseneck עם סיב אופטי כדי להאיר את הדגימה. חזרו על שלבי השיוף והדימוי בכל פעם שמשייפים עובי קבוע מראש מהדגימה. מרווח השיוף המינימלי המדויק והניתן לשחזור של מחזיק הדגימות הוא 20 microns.
תהליך זה חוזר על עצמו באופן הדרגתי עד שסינב (cross section) דרך השתל ורקמת העין שסביבו נחשף במפלס הרצוי. מוצגות כאן תמונות לדוגמה של רקמת רשתית שהודגשה בסמוך ל-T רטינלי מטיטניום בנקודות שונות במהלך תהליך השיוף. התמונות מראות חתכים אורכיים של ה-tack חודר דרך העין ויוצא מהסקלרה, צמוד לסיליקון ולרשתית שצבעה ב-toluidine blue ורשתית שלא נצבעה.
ניתן לראות היפרדות רשתית וקיפולים שאינם ארטיפקטים משני צדי הסיליקון, הן בהגדלה נמוכה והן בהגדלה גבוהה. גוף הסיכה נראה כשהוא מוטמע בסיליקון, וראש הסיכה חדר דרך הרשתית והסקלרה. כאן ניכר כי קיימת היפרדות רשתית שאינה ארטיפקט ברשתית שאינה צבועה משני צדי הסיליקון, כפי שנצפה הן בהגדלה נמוכה והן בהגדלה גבוהה.
הדוגמה הראתה כי קיימת חוסר ארגון רשתיתי בסמיכות לסיכה ודחיסה של הרשתית בצד אחד עקב זווית השחלה אלכסונית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להטמיע, לכוון ולהשחית את הדגימה בזהירות, כך שהמשטחים השחוקים שיתקבלו יהיו מיושרים במישור הרצוי. יתרה מכך, יש לאסוף תמונות מרובות בכל שלב של השחקה, שכן לא ניתן לשחזר את הדגימות השחוקות לאחר מכן.
שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ההיסטולוגיה של תותב רשתית. ניתן ליישמה גם להדמיית הממשק בין המכשיר לרקמה במערכות אחרות המשתמשות ברכיבים מושתלים קשיחים, כגון שתלים במוח עמוק, סטנטים כלי דם או תותבים אורטופדיים.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקות היסטולוגיות להדמיה של רקמה עינית הסמוכה לסיכה (tack) אפי-רטינלית ממתכת ולפרוטזה רטינלית. שיטות אלו מאפשרות להעריך את בריאות העין ביחס לשתלים רטינליים, תוך התגברות על מגבלות של תהליכים היסטולוגיים מסורתיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- Oftalmology (רפואת עיניים)
- היסטולוגיה
רקע
- פרוטזות רשתית מכילות לעיתים קרובות רכיבי מתכת קשיחים.
- שיטות היסטולוגיות מסורתיות אינן תואמות שתלים אלה.
- הבנת הממשק בין הרקמה למשתבץ היא קריטית לבטיחותו ויעילותו של המכשיר.
- ייתכן ששיטות קיימות אינן מאפשרות הדמיה של השתבל במקומו (in situ).
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקות להערכת בריאות הרקמה העיןית הסמוכה לפרוטזות רשתית.
- ויזואליזציה של הארכיטקטורה התאית סביב מכשירים מושתלים.
- שכלול תכנון השתלי רשתית בהתבסס על ממצאים היסטולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הוצאה וקיבוע של העין.
- חיתוך דגימות רקמה הכוללות את השתל.
- התייבשות הדרגתית והטמעה בשרף אפוקסי.
- שיוף וצביעה של בלוקי השרף לצורך דימוי.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של רקמת העין הסמוכה לשבב הרשתית.
- איסוף תמונות בחתך רוחבי להערכת שלמות הרקמה.
- הדגמת יתרונות השיטה על פני היסטולוגיה מסורתית.
- תובנות לגבי השלמות המבנית של רקמות הסמוכות לשבבים.
מסקנות
- הטכניקות שפותחו מאפשרות הערכה יעילה של בריאות העין בסביבת פרוטזות רשתית.
- שיטות אלו יכולות להנחות תכנונים עתידיים וגישות כירורגיות עבור שתולי רשתית.
- ויזואליזציה של הממשק בין השתול לרקמה היא קריטית להבנת התאימות הביולוגית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח היסטופתולוגי מהימן של רקמה עינית סמוכה לפרוטזות רשתית הוא קריטי להפחתת סיכוני בטיחות של המכשיר ולעיצובו במהלך הפיתוח הפרה-קליני. טכניקה זו מאפשרת ויזואליזציה ישירה של הממשק בין השתל לרקמה, ובכך מתגברת על מגבלותיה של היסטולוגיה מסורתית עם רכיבי מתכת קשיחים. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי לגבי התאימות הביולוגית של המכשיר ומספקת בסיס לקבלת החלטות מותאמות סיכון עבור פורטפוליו של השתלי רשתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תגובת הרקמה להתקנים מושתלים ברמה התאית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי חשיפת שלמות הרקמה המקומית והארכיטקטורה התאית.
- מספק ראיות לתיקוף תפקודי של פרופילי בטיחות של השתלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מקל על הכנת דגימות רקמה מתוקפות לצורך הערכה היסטולוגית הניתנת לשחזור.
- מאפשר פלטי דימוג כמותיים להערכה סטנדרטית של אינטראקציות בין המכשיר לרקמה.
- תומך במוכנות הבדיקה לסריקת חומרים או עיצובים חדשים של שתלים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את ניתוח הרקמות הפרה-קליני עם פיתוח סממנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים לבטיחות מכשירים.
- מבטיח רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני על ידי אפשור הערכה in situ.
- מפחית את הסיכון הביולוגי בהעמדת מועמדים להשתלה להערכה קלינית.
שילוב זרימה ותהליכי עבודה
שיטה זו משולבת ברצף ההערכה הפרה-קלינית, ומגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים, אופטימיזציה של המכשיר והערכת בטיחות תרגומית עבור תבניות רשתית מלאכותיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי תאימות רקמות ומנגנוני פגיעה בממשק השתלה.
- סריקה: מספק תוצרים היסטולוגיים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך השוואה בין עיצובי מכשירים.
- אנליטיקה: מספק תמונות בחתך רוחב ברזולוציה גבוהה לניתוח סטטיסטי של שלמות הרקמה.
- מחקר תרגומי: מאפשר התאמה של ממצאים פרה-קליניים עם נקודות סיום של בטיחות קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר להערכת ממשקי השתלה אחרים ברקמות קשות, מעבר לרפואת עיניים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתאימות בין המכשיר לרקמה ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: מסמננ רקמה היסטולוגית עבור שתלים בעלי רכיבי מתכת קשיחים.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ומבצע אופטימיזציה של הקצאת משאבים בשרשראות פיתוח של מכשירים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות של מועמדים להשתלה בהתאמה לסיכון, על בסיס הערכת רקמה ישירה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של רקמות, הטבעה והדמיה היסטולוגית.
- נדרשת גישה לתשתית ייעודית להשחזה, צביעה ומיקרוסקופיה בעוצמה גבוהה.
- נדרש סטנדרד אחיד וקפדני בין צוותים כדי להבטיח כיוון דגימות והדמיה הניתנים לשחזור.
- ניתן להתאים לסוגי שתלים שונים, אך עשויים להידרש שינויים בפרוטוקול עבור רקמות שונות.
- הרס הדגימה במהלך ההשחזה מחייב תכנון קפדני ותיעוד של כל שלב.
