מכתים שלילי אופטימלי: פרוטוקול תפוקה גבוהה לבחינת מבנה חלבון קטן וסימטרי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לדמות חלבון קטן ואסימטרי באמצעות פרוטוקול אופטימלי בעל תפוקה גבוהה של מיקרוסקופיה אלקטרונית בצביעה שלילית. דבר זה מושג תחילה על ידי דגירה של החלבון בתחנת דגירה מוכנה, תוך כדי הכנת תחנת עבודה לצביעה שלילית. השלב השני של הפרוצדורה הוא שטיפה מהירה של הדגימה על שלוש טיפות מים באופן רצופים.

השלב השלישי הוא צביעה זהירה של הדגימה על שלוש טיפות צבע באופן רציף. השלב האחרון הוא הסרת עודפי התמיסה על ידי ספיגה מגב רשת ה-EM ולאחר מכן ייבוש עדין תחת זרם גז חנקן. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להציג תמונות ברזולוציה גבוהה של חלבונים קטנים באמצעות דימות TEM תחת תנאי defocus נמוך.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני מיקרוסקופיה אלקטרונית קריוגנית הוא היכולת לאפשר בדיקה בתפוקה גבוהה ודימוי בניגודיות גבוהה של מבני חלבון קטנים ואסימטריים, תוך הפחתת ארטיפקטים מבניים המאפיינים צביעה שלילית קונבנציונלית. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הבסיס המבני של מנגנונים של חלבונים קטנים, כגון חלבון העברת אסטרי כולסטרול.

ניתן ליישם זאת גם על חלבונים אחרים, כגון נוגדן IgG1, ליפופרוטאין בעל צפיפות גבוהה (HDL) ופרוטאוזום, הנבדלים מאוד בגודלם. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי השטיפה והצביעה קשה ללמוד בשל השונות בעיתוי, ואף ספיגה (blotting) של הדגימה עלולה לגרום להשפעות דרמטיות על החלבון הצבוע הסופי. הדגמת הפרוצדורה תועבר עבור עמיתי מחקר Z.A מהמעבדה שלי. בעת ההכנה לפרוטוקול זה, יש להכין תמיסת 1% urea-formaldhyde תוך תשומת לב מרבית לצמצום חשיפתה לאור.

זה כולל עטיפת חלקי המסנן של המזרק בנקבים של 0.2 micron בנייר אלומינום כאשר מגיע הזמן לסינון ראשון של התמיסה. לאחר הסינון, יש לאחסן מנות (aliquots) של שני מיליליטר בבקבוקוני vial עטופים בנייר אלומינום בטמפרטורה של 80- degrees Celsius ביום הניסוי. יש להפשיר מנה אחת במקלחת מים בטמפרטורת החדר עד להפשרה מלאה.

סננו זאת שוב באמצעות מסנן של 0.02 micron כאשר החלקים עטופים בנייר אלומיניום. יש לעטוף בנייר אלומיניום גם את מבחנת האיסוף. העבירו את צבע השלילה (negative stain) לקופסת קרח עד לשימושו.

הכינו דף להחזקת טיפות על ידי לחיצת רצועת Parafilm באורך של שמונה אינץ' על תומך לקלפיות פיפטה. פעולה זו יוצרת שקעים המשמשים כבארות בקוטר של 5 mm. לאחר יצירת שש שורות של בארות, השטיחו את הקרח על פניו של מגש סטירופור, ולאחר מכן הניחו את הדף על הקרח.

בשלב הבא, הוסיפו 35 µL של מים מזוקקים (DI water) לשלושת הבארות הראשונות בלוח בצד שמאל. לאחר מכן, מלאו את שלוש הבארות הימניות בלוח ב-35 µL של תמיסת הצביעה השלילית שהוכנה. כסו את המגש כדי למזער את החשיפה של התמיסה לאור.

זה ישמש כתחנת צביעה. כעת הכינו תחנת אינקובציה של רשתות EM מקופסה ריקה של טיפים לפיפט עם תוספת שעליה ניתן להרכיב פינצטה. מלאו את הקופסה עד מחציתה בקרח, כך שפני השטח של הקרח יהיו קרובים לקצה הפינצטה כאשר היא מורכבת.

ראשית, בצעו פריקה חשמלית (glow discharge) לרשתות נחושת 300 mesh מצופות פחמן דק למשך כ-10 שניות. לאחר מכן, הרימו רשת באמצעות פינצטה שנתפסת בתחנת ההדגרה של רשתות ה-EM. תלו את הפינצטה עם הרשת, כך שהרשת תהיה בנטייה של 45 מעלות, במרחק של חצי אינץ' מעל הקרח.

כעת יש לדלל את דגימת החלבון ב-DPBS לריכוז של 50 עד 100 micrograms של חלבון ל-milliliter של תמיסה. יש להעביר מיד כ-four microliters מהדילול אל רשת ה-EM. יש להמתין לדגימה בזמן אינקובציה של כדקה אחת.

לאחר דקה אחת, טפחו במהירות על הרשת בעזרת נייר סינון כדי להסיר עודפי תמיסה. לאחר מכן, בתחנת הצביעה, געו עם הרשת בטיפת המים הראשונה על ה-para film. חזרו במהירות על תהליך ייבוש המסנן והרטבתו עם הטיפה הבאה.

השתמשו בסך הכל בשלוש טיפות מים ובצעו זאת במהירות רבה ככל האפשר. יש לשטוף את הרשת במים במהירות כדי למנוע השפעה שלילית של שינוי הבופר על החלבון. לאחר ספיגת השטיפה האחרונה בתוך שלוש שניות, התחילו להניח את הרשת על הטיפה הראשונה של תמיסת הצביעה השלילית.

השאירו את הדגימה לצוף שם למשך 10 שניות. בינתיים, נקו את הפינצטה על ידי לחיצת הקצוות על נייר סינון. לאחר צף של עשר שניות, ספגו את התמיסה בעזרת נייר סינון והחילו את הדגימה לצף בטיפת צבע נוספת למשך שתי שניות.

נקה את הפינצטה במהלך שתי השניות. לאחר מכן, ייבש את הרשת בעזרת נייר סופג והנח אותה על הטיפה השלישית. במשך דקה שלמה, כסה את תחנת הצביעה במהלך שלב זה.

יש להסיר את הצבע על ידי נגיעה בגבה של רשת ה-EM למשך זמן מדויק כדי להבטיח שהרשת תתייבש באופן אחיד. אם נייר הסינון יבוא במגע עם הצבע למשך זמן רב מדי, עלול להיות מוסר צבע רב מדי, מה שיוביל לאיכות דימוי נמוכה. לאחר מכן, המשיכו לייבוש הרשת.

ראשית, הצמד את כל הצד שאינו מכוסה בפחמן לנייר סינון עד להעברת התמיסה. שנית, החל זרם עדין של גז חנקן. כעת העבר את הרשת לצלחית מרופדת בנייר סינון וכסה את הצלחת באופן חלקי.

השאירו את הרשת להתייבש בצלחית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לחלופין, ניתן לאפות דגימות המכילות ליפידים ב-40 °C למשך שעה. לאחר ייבוש מלא, העבירו את רשת ה-EM לקופסת אחסון עבור רשתות EM לפני תחילת העבודה; ראשית, בצעו יישור ל-TEM.

בדוק את הרזולוציה של טבעת ההפשרה (thaw ring) הגבוהה ביותר הנראית באמצעות ספקטרום ההספק (power spectrum) של אזור פילם הפחמן בסריג שנצבע בצביעה שלילית, אשר צריכה להיות טובה יותר מהרזולוציה המיועדת. לאחר מכן, כדי לכוונן את היישור, בדוק בקפידה את ספקטרום ההספק באזור פילם הפחמן של הדגימה. בתנאי יישור תקינים, ניתן להבחין ביותר מ-20 טבעות Thaw, מה שמתאים לרזולוציה טובה מחמישה אנגסטרומים.

הטבעות נוצרו באמצעות התמרת פורייה של תמונת פחמן אמורפי תחת דפוקוס של 1.6 microns ומינון של 20.4 electrons per square Angstrom. כעת החזירו את המיקוד למצב שקרוב למיקוד שרצר (Scherzer focus), בסביבות 0.1 micrometers, לצורך דימוי של חלבונים קטנים במהלך בחינת רשת ה-EM. באופן אידיאלי, אזורים צבועים נמצאים בדרך כלל ליד הקצה של אזורי עננות צבועים ועבים יותר בהגדלה נמוכה.

מבנה של דגימות ליפופרוטאין נבחנו באמצעות OPNS. דוגמאות כוללות HDL רקומביננטי, פלזמה אנושית, LDL, IDL מפלזמה אנושית ו-VLDL מפלזמה אנושית. מבנים קטנים יותר, כגון CETP במשקל 53 kilodalton, נבחנו אף הם.

זהו אחד החלבונים הקטנים ביותר שניתן לצלם בהצלחה באמצעות eem. חפיפה של מבנה הגביש של CETP תואמת היטב את התמונה, באופן דינמי מאוד. חלבונים הטרוגניים נבחנו גם בנוגדני immunoglobulin G של 160 kilodalton.

שלושה תתי-דומיינים היו גלויים בבירור. בבחינה מעמיקה יותר של הנוגדן IgG1, נעשה שימוש במבנה הגבישי שלו לצורך השוואה. המבנה הגבישי של הנוגדן IgG1 תואם לתצוגת ה-EM של נוגדיים אלו במובנים רבים, כגון במיקומי הדומיינים ובצורותיהם.

מולקולות נוספות שנבחנו כוללות apo lipoprotein A one grow EL חסר ליפידים במשקל 28 kilodalton, ופרוטאוזומים. ביסודו של דבר, שיטת ה-OPNS מקדמת באופן משמעותי את גבולות הדימוי ב-EM למבנים א-סימטריים קטנים וכן למחקרים מכניסטיים נלווים. בעת ביצוע הפרוצדורה, חשוב לצמצם ככל האפשר את החשיפה לאור של ריאגנט הצביעה, לשטוף את הדגימה במהירות ולהשתמש במיקוד near treasure לצורך הדימוי לאחר ביצוע פרוצדורה זו.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון טומוגרפיה אלקטרונית, כדי לענות על שאלות נוספות כמו מבנים ברזולוציית ננומטר של מולקולות בודדות והשינויים הקונפורמציונליים ביניהן. לאחר פיתוח זה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה המבנית לחקור את המגנטים של העברת אסטרים בצביר בקרב ליפופרוטאינים של פלזמה אנושית.