Name: מכתים שלילי אופטימלי: פרוטוקול תפוקה גבוהה לבחינת מבנה חלבון קטן וסימטרי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: למד פרוטוקול מכתים שלילי אופטימלי לדימוי חלבונים קטנים ואסימטריים במיקרוסקופית אלקטרונים. שיטה זו מאפשרת בחינה בתפוקה גבוהה והפקת תמונות ברזולוציה גבוהה עם ניגודיות משופרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לד&quot;ר מיקי יאנג לעריכה והערות, ובני זוג. ליי ז&#39;אנג ובו פנג לקבלת סיוע. עבודה זו נתמכה על ידי משרד מדע, משרד אנרגיה של יסוד מדעי של ארצות הברית מחלקת האנרגיה (חוזה לא. DE-AC02-05CH11231), הלאומי ללב, הריאות ודם המכון של המכונים הלאומיים לבריאות (לא . R01HL115153), והמכון הלאומי לרפואה כללית מדעים של המכון הלאומי לבריאות (לא. R01GM104427).

.1 הכנת הפתרון מכתים שלילי טרי על 1% (w / v) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים אבקת 1 מ&quot;ג Uranyl Formate (UF) לבקבוק זכוכית המכיל 100 מ&quot;ל מים deionized בחדר או בתיבה כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את O הפתרון / N ב RT בחדר / קופסא חשוכה. לעטוף את בקבוק הפתרון עם נייר אלומיניום כדי למנוע אור מלהכות את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון בעדינות דרך 0.2 מיקרומטר מסנן (גודל נקבובית) רכוב על מזרק 5 מ&quot;ל. הפתרון המסונן נאסף לכמה צינורות פלקון מכוסים בנייר אלומיניום. מזרק המסנן גם חייב להיות עטוף בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון שוב דרך 0.02 מסנן מיקרומטר (גודל נקבובית) רכוב על מזרק 1 מ&quot;ל. הפתרון המסונן נאסף וaliquot לתוך 2 מ&quot;ל בקבוקונים. המזרקים והבקבוקונים להיות מכוסים ברדיד אלומיניום לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את בקבוקוני aliquot באמצעות מלקחיים ארוכים טיפלו הצללה הבקבוקונים לתוך מיכל חנקן מלא בנוזל באופן מיידילאחר הפתרון היה מסונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המבחנות הקפואות ל-80 ° C מקפיא לאחסון ושימוש עתידי. </li></ol> 2 הכנת Workstation מכתים שלילי והדגירה Workstation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוקון של 1% פתרון UF באמבט מים שנקבע ב RT. ודא שנייר האלומיניום נשאר כרוך סביב הבקבוקון כדי למנוע חשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון לאחר שזה מופשר לחלוטין על ידי שימוש בנייר אלומיניום עטוף מזרק 1 מ&quot;ל רכוב עם מסנן 0.02 מיקרומטר. לאסוף את הפתרון המסונן לתוך רדיד אלומיניום חדש עטוף בקבוקון, והניח אותה על הקרח בתוך קרח תיבת כובע מכוסה מחכה לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך צלחות פתרון על ידי אצבע דוחפת גיליון Parafilm הארוך ~ 8 אינץ על פני השטח של צלחת התגבשות חלבון ריקה. זה יהיה ליצור שורות של צלחות עגולות בקוטר של מ&quot;מ ~ 5. הפוך 6 צלחות בכל מקום שורת צלחות Parafilm על משטח של קרח שטוח בתוך קרח להכילמכסה אה, כתחנת עבודה צביעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ~ 35 μl deionized מים על כל אחת משלוש צלחות שנותרו בכל שורה, ופיפטה ~ μl 35 מסונן פתרון UF על שלוש צלחות הנכונות בכל שורה. כסה תחנת העבודה הצביעה עם מכסה כדי למנוע חשיפה לאור לפני צביעת חלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תחנת דגירה רשת EM על ידי מילוי באמצע הדרך תיבה ריקה עם קרח, ודבקת בסמוך לקולב שיכול להיות מותקן על בסיס תמיכה. הנח את פינצטה המדגם בקולב, שבו הטיפים &#39;פינצטה נמצאים בקרבת מקום משטח הקרח. מחצית לכסות הטיפים &#39;פינצטה על ידי גובה מס השפתיים תיבה. תיבת קרח אידיאלית לעשות תחנת דגירה היא באמצעות מיכל טיפים pipet ריק. </li></ol> .3 OpNS מבצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוהר פריקה פחמן הסרט הדק מצופה 300 רשתות EM נחושת רשת עבור 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים רשת עם פינצטה ולהתחבר פינצטה לקולב על ידי שמירה על הרשת באינץ 45 ° הטיה ו1 לעיל הקרחפני השטח בתוך תחנת הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מדגם החלבון עם בופר פוספט של Dulbecco (DBPS) בריכוז חלבון סופי של ~ 0.01 ל~ 0.005 מ&quot;ג / מ&quot;ל. ההפקדה ~ 4 μl דילול מדגם מייד לאחר הדילול בצד פחמן של רשת EM. (ניתן לשינוי DPBS לחיץ אחר אם החלבון הוא רגיש לDPBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המדגם ברשתות EM ל~ 1 דקות בתוך תחנת הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון העודף באמצעות נגיעה בקצה הרשת עם נייר סינון במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גע ברשת במהירות לירידה הראשונה (~ 35 μl) של פני מים טהורות על גבי גיליון Parafilm מייד אחרי הפתרון העודף הוסר על רשת EM. ולאחר מכן להסיר את עודפי המים מייד עם נייר סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.6 לעוד שתי פעמים על ידי שטיפת רשת EM בשתי טיפות מים שנותרו על Parafilm (שלב 3.6 ו3.7 ניתן לדלג אם המדגם הוא מאוד רגיש למים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצוף GRI EMd מייד על פני השטח של הטיפה הראשונה של זכות פתרון UF אחרי המים העודפים על רשת EM הוסר. ואז דגירה של 10 שניות. הקפד לסיים את הליכי שטיפת מים בתוך 3 שניות לפני צף הרשת על פני השטח של פתרון UF. זמן כביסה קצר יותר, באיכות טובה יותר תהיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את פינצטה על ידי חדירת הטיפים לנייר סינון ל~ 2 - 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון העודף על הרשת באמצעות יצירת קשר עם קצה הרשת עם נייר הסינון, ולאחר מכן לצוף הרשת על הירידה השנייה של UF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך מעל צעד 3.10 על הטיפה השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצוף הרשת על הטיפה השלישית של פתרון UF ולכסות את תחנת הצביעה ל~ 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב אופציונאלי: לשטוף את הרשת במהירות בחלק עליון של מים כפי שמתואר ב3.6. צעד נוסף זה יועיל דגימות המכילות מעל חלקיקים טעונים חופשיים זהב או רקע כתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון העודף על ידי נגיעה בנייר הסינון לthכל ישבן דואר רשת (מול צד פחמן). ייבש את הרשת הקיימת, בזרם עדין של גז חנקן ב RT מייד אחרי התבוננות פתרון קליטה לנייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרשת על גבי גיליון נייר סינון בתוך צלחת פטרי, ולכסות את הצלחת באופן חלקי עם כובע להתייבש במשך דקות לפחות 30 תחת RT. עבור חלק מדגימות, למקם את הרשת בC חממת 40 ° אפייה לשעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הרשת לתוך תיבת רשת EM לEM עתיד בחינה. </li></ol> .4 EM בחינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר TEM כראוי לפני בדיקת EM של החלבונים הקטנים על הרשת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הרזולוציה של Thon-הטבעת גלויה הגבוהה ביותר שהיא כוח הספקטרום של סרט פחמן אמורפי כדי לקבוע אם TEM כבר מיושר כהלכה. מאז TEM משותף למשתמשים רבים ושונים, TEM לעתים קרובות אינו מכוון כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק היטב את כוח הספקטרום באזור סרט פחמן של הדגימה כדי להתאים את conditio היישורn של המכונה. Thon-הטבעות הגלויות הגבוהות ביותר הן טובות יותר מאשר ברזולוציה ממוקדת. הערה: כדוגמא ליישור נכון של TEM נימה LaB6 פעל תחת מתח גבוה 120 ק, ניתן דמיינו יותר מ -20 Thon-טבעות, שבו, ברזולוציה המקבילה יכול להיות טובה יותר מאשר 5.0 א. זה Thon-טבעת הושגה על ידי העברה פורייה של סרט פחמן אמורפי צילם תחת defocus של ~ 1.6 מיקרומטר ומינון של 20.4 אלקטרוני / A2 (איור 5). הערה: תצפית של רזולוציה הגבוהה Thon-הטבעת היא תנאי הכרחי, אך לא תנאי מספיק ליישור נכון. למעשה, כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהות, הרבה פרמטרים אחרים חשובים אף הם, כגון איכות דגימה, נזקי קרינה, טעינה ונסחף, כמו גם את שיעור מינון התאורה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא defocus חזרה לכמעט Scherzer מוקד להדמית החלבונים הקטנים באזור באופן אידיאלי מוכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיפוש לאזור &quot;מעונן&quot; להדדואר. אזור מוכתם באופן אידיאלי ממוקם בדרך כלל בסמוך לקצה של אזור כתם עבה, שנראה כמו אזור &quot;מעונן&quot; ברשת מאז העובי של הכתם הוא בדרך כלל לא מתחלק באופן שווה על הרשת מצופה פחמן (איור 6). בדרך כלל בהגדלה נמוכה (&lt;100x) הייתה לעזור למצוא האזורים המעוננים הללו הראשונים לפני התקרבות להדמיה. </li></ol>

אין לנו מה לחשוף.

בהשוואה לטכניקות NS קונבנציונליות, OpNS יכול למנוע חפצי rouleaux (איור 1 ו -9), המספקים רזולוציה גבוהה אמינה וסבירה (~ 1nm) פרטים מבניים של חלבונים קטנים (איור 2). בהשוואה לcryo-EM, OpNS מספק שיטת תפוקה גבוהה ויכול לבחון מגוון רחב של חלבונים ואינטראקציות בין חלבונים 6. עם זאת, OpNS עדיין יש חסרונות שלה. בהשוואה לNS הקונבנציונלי, OpNS כרוך: i) צעדים מסובכים יותר בהכנת דגימה; ii) באמצעות חומר רדיואקטיבי, UF; iii) שמירה על הכתם טרי בשל העוצמה קצרה יותר של כתם UF בגלל הרגישות לאור שלה; iv) כדי למנוע משקעים פתרון UF חייב להיות מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס ודורש הפשרה לפני השימוש; v) ולבסוף כל UF יש לטפל בם כפסולת מסוכנת. בהשוואה לcryo-EM, OpNS מספק תמונות ברזולוציה נמוכות יחסית ואין ערובה לכל חפץ שעדיין לא גילהבעתיד. השפעות פרוצדורליים פעולת NS על היווצרות rouleaux ליפופרוטאין פרוטוקולי NS להכנת חלבונים לבדיקה 16,29-36,55 ניתן לסווג לשלוש קבוצות עיקריות של שיטות 50: ערבוב 55, טיפה אחר טיפה 16, ונהלי כביסה 29. i) פרוטוקול הערבוב דורש הערבוב הראשוני של מדגם הכתם וחלבון ביחס ספציפי, ולאחר מכן להחיל את הפתרון המעורב על גבי סרט פחמן מצופה ברשת, סוף סוף הסרת פתרון עודף עם נייר סינון לפני ייבוש באוויר לבדיקת EM 55. ii) פרוטוקול טיפה אחר טיפה כרוך החלת (~ 4 μl) ירידת מדגם ישירות לרשת EM המצופה בכפיפות לתת פחמן לדקות ~ 1, לאחר מכן הסרת פתרון מדגם עודף לפני יישום ירידה (~ 4 μl) של כתם פתרון באותו הצד של רשת. לאחר דקות ~ 1 של דגירה, להסיר את excesכתם של באמצעות מגע עם נייר סינון נקי, לבסוף הגשה לייבוש אוויר 16,56-58. iii) פרוטוקול הכביסה (איור 7) שדורש מדגם יישום פתרון לרשת EM המצופה בפחמן 1 דקות, ואז לשטוף עם מים ללא יונים שלוש פעמים מייד אחרי הסרת הפתרון העודף בכל פעם על ידי נייר סינון 3,29,30. OpNS פרוטוקול היה שונה מהליך זה כביסה. סוגי כתם NS והשפעות על היווצרות rouleaux ליפופרוטאין בNS, פיזור אלקטרונים חזק יותר בשל כתמי מתכת כבדים מספק ניגוד מהחלבונים 17-20,59. דגימות NS יכולות לסבול בנוסף מינוני קרינה גבוהים יותר, ולשפר את תכונות חלבון על ידי ניגוד שלילי חדה 8,9,60. כתמים של מתכות כבדות יכולים להיות מסווגים כ: אניוני, כוללים חומצת phosphotungstic (PTA) 16, tungstate methylamine 14 וtungstate סיליקון 61; וקטיוןic, כגון אצטט Uranyl (UA) 62, UF 3,29,30, וחנק Uranyl (האו&quot;ם) 63. אחד כתמי NS אניוני שהוא נפוץ ביותר הוא הורים 33,64-67. ועד ההורים הוא חומצת heteropoly, המשמשת בדרך כלל סביב pH 7.0-7.5. גם ועד הורים יכולים לשמש לצביעה חיובית 3,16,68. המטענים השליליים של הורים עשויים לתווך אינטראקציות אלקטרוסטטיות עם שומנים בלתי רוויים מטען חשמלי חיובי קבוצות ראש, כמו POPC, על שני המשטחים ליפופרוטאין ויפוזום. ועד ההורים עלולים לגרום להיווצרות rouleaux באמצעות אינטראקציה זו 29,30 אפילו תחת 29,30 הרגיל מליחות חיץ (איור 1). כתמי uranyl, כגון UA, UF והאו&quot;ם הם בחירות חלופיות לכתמי קטיוני כבדים מתכות וUA בפרט משמשים לעתים קרובות לNS של מגוון רחב של דגימות ביולוגיות 62,69,70. ניסויים מצאו UF לא גורם rouleaux של ליפופרוטאין המכיל שומני חומצת שומן בלתי רוויים, כגון POPC. עם זאת, UF עדיין עשוי לגרום לרולהיווצרות aux על ליפופרוטאין המכיל שומנים רוויים חומצות שומן, כגון phosphatidylcholine dimyristoyl (DMPC) ו1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (PSPC). המנגנון מפורט של אינטראקציה זו אינו ידוע. UA / UF / האו&quot;ם יכול כל העבודה בערכי pH נמוכים יותר הנע 3.5-4.6. ערכי pH נמוכים יותר כגון אולי לא מתאים למקרומולקולות ביולוגיות מסוימות, כי הם רגישים לpH 14,71. מעניין, UA / UF יכול לתקן את מבנה חלבון בתוך כמה אלפיות דרך מנגנון לא ידוע 72. בניגוד להורים, UA / UF הוא יותר דומה למלח מאשר חומצה. UF דיווחים יכול לספק תוצאות טובות יותר מאשר UA 73, שבו, יש לי כתמי UF והאו&quot;ם גדלי גרגר קטנים יותר מUA (UF: 0.3 ננומטר, האו&quot;ם: ~ 0.5 ננומטר) 3,74. דוגמא מעניינת, פרטים כמו מבנה משניים של חלבון קטן (53 kDa CETP) ניתן דמיין ישירות מmicrographs הגלם כאשר UF שימש כמגיב שלילי כתם על ידי הבאמוקדם יותר דיווח cryo-חיובי מכתים (cryo-PS) שיטה (איור 8) 6. בcryo-PS, המדגם המוכתם היה הבזק הוקפא על ידי ביצוע הליך הכנת מדגם cryo-EM במקום הליך ייבוש בפרוטוקול OpNS, שעלול לגרום לקריסה המבנית המשנית. Cryo-PS הוא שיטה לניגודיות גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה של חלבונים קטנים 75. מאחר שתמונות cryo-PS שהתהפכו ניגוד בהשוואה לאלה מפרוטוקול cryo-NS דיווח 22, אבל יש לי ניגוד תמונה עקבי לאלה מתמונות cryo-EM קונבנציונליים, ולכן זה נקרא שיטת cryo-PS. תמונות cryo-PS מראות שמגיב מכתים, formate Uranyl, חודר את פני השטח המולקולריים, קורא תיגר על ההשקפה המקובלת שמכתים יכול לדמיין רק את מבנה פני השטח החיצוני. המנגנון של איך formate Uranyl חודר את פני השטח המולקולריים אינו ידוע. אפשרות אחת היא שקטיון Uranyl נקשר קבוצות carboxyl החלבון זמינות, ובכךמסביב קרח זגוגי הוא של צפיפות נמוכה מההכתמה של החלבון וקבוצות Uranyl, ובכך פועלים ככתם חיובי. שיטת cryo-PS היא דומה לשיטת החלפת isomorphous (MIR) מרובה, שהייתה גישה מקובלת כדי לפתור את הבעיה השלב בקריסטלוגרפיה רנטגן 76-78. במיר, דגימות קריסטל הם ספוגים עם פתרון אטום כבד, כוללים אורניום, כדי לקבל צורה דומה בצורתה לצורה המקורית שלו. התוספת של אטום הכבד לפעמים אינה משפיעה על ממדי תא היווצרות גבישים או יחידה אך מספקת מידע נוסף של קביעת מבנה גביש 76-78. על ידי נהנה מהתבואה הקטנה של UF, cryo-PS יכול לספק ניגודיות גבוהה ותמונה ברזולוציה גבוהה של חלבון יחיד, וזה חשוב ללימודי מבנה חלבון, במיוחד כאשר בהתחשב בכך שכמעט כל החלבונים באופן טבעי דינמיים והטרוגנית בפתרון. לאימות של שיטת cryo-PS זה, אנחנו פותחים לכל מבחן עיוור משדה EM. </<html> p&gt; השפעות ריכוז מלח על היווצרות rouleaux ביפופרוטאינים באמצעות מגיב מכתים שלילי עד הורים מסורתיים, היווצרות rouleaux נצפה היא סביר יותר שקשורות לאינטראקציות שומנים במקום אינטראקציה חלבון. ההדמיה הדגימות של שלפוחית ​​יפוזום POPC הוכנה תחת מליחות ניכרת (0.5 M NaCl), מליחות מתונה (0.25 M NaCl), יחסית מליחות חלשה (0.1M NaCl), ומים טהורים (איור 9), micrographs האלקטרונים להראות היווצרות rouleaux הייתה בקורלציה לריכוז מלח (איור 9 א - ד). באמצעות מגיב מכתים שלילי כUF, לא rouleaux נצפה במדגם POPC שלפוחית ​​יפוזום 30 (איור 2L), המצביעה על הליך הכביסה כדי להפחית את ריכוז מלח ממש לפני הצביעה היא הכרחית במהירות, אך לא באופן עצמאי צעד מספיק למניעת rouleaux בPOPC קשור דגימות. &quot;Jove_content&quot;&gt; חלבון קטן ההדמיה TEM דורש מצב פוקוס קרוב Scherzer. ההדמיה TEM המוצלחת של חלבונים קטנים ברזולוציה גבוהה יותר דורשת שני תנאים קריטיים, יישור קורה תקין ומצב רכישת התמקדות כמעט Scherzer. i) יישור קורה נכון יכול להישפט דרך מספר הצלצולים הגלויים Thon (ספקטרום כוח) על ההעברה פורייה של תמונת סרט פחמן שנרכשה במסגרת defocus הגבוה יחסית. טוב יותר את מצב היישור של הקורה, ניתן דמיינו יותר טבעות Thon ותמונה הניתנת למדידה .. ii) רכישה תחת התמקדות כמעט Scherzer היא עוד מצב קריטי. אסטרטגיה סטנדרטית מסורתית הדמיה דגימות ביולוגיות בדרך כלל מנצלת גבוה defocus (1 - מיקרומטר 2 ואפילו יותר), שיכול לשפר את הדגימה הביולוגית לעומת תמונת 79. אסטרטגיה זו היא משמעותית שונה מהאסטרטגיה הטיפוסית הדמיה מבנה רזולוציה אטומית של חומרים קשים, שלעתים קרובותמנצל מוקד ליד Scherzer (~ 50 ננומטר defocus). למרות, defocus גבוה יותר יכול לחזק את ניגוד מדגם ביולוגי, אותות ברזולוציה גבוהה יחוסלו באופן חלקי. כתוצאה מכך, שיתוף הפעולה של אות ברזולוציה גבוהה יהיה נמוך יותר במצב הדמיה defocus גבוה יותר. הסיבה לכך היא ש, תמונת TEM היא פיתול של מבנה המדגם וCTF המכשיר. CTF הוא עקומת נדנוד נגד התדירות, שבו העקומה לעתים קרובות נעה חציית אפס משרעת בתדר גבוה. בכל פעם כאשר CTF פני אפס, מדגם האות המבנית בתדר הספציפי הזה יבוטל (אפס פעמים כל מספר יהיה אפס). האות בוטלה בתדר זה אף פעם לא יכול להיות התאוששה על ידי כל אלגוריתם תיקון CTF (אפס מחולק באפס יכול להיות כל מספר במקום האות המבנית המקורית אקראי). תחת ההדמיה defocus גבוהה יותר, CTF יהיה להתנדנד הרבה יותר אגרסיווי, וכך CTF חוצה אפס משרעת בתדירות גבוהה יותר, כתוצאה מכך,האותות המבניים במספר רב יותר של תדרים ספציפיים יבוטלו. אותות יותר שבוטלו, התמונה תהיה פחות השותפות לפשע. יש לציין, בשיתוף הפעולה של תמונה לא ניתן לשחזר או לתקן על ידי כל תיקון CTF. עם זאת, מספר תמונות incompleted שנרכשו במסגרת defocuses שונה ניתן להשתמש כדי למלא את הפערים שלהם זה לזה כדי להשיג אות מבנית הושלמה במבנה המדגם באמצעות שיטת מיצוע, שבו ניתן להשיג גם ברזולוציה אטומית 9-12. שיטת המיצוע היא גישה רבת עוצמה כדי להשיג את המבנה של חלבונים מסוימים סימטריים מאוד, וחלבונים נוקשה קשורים מבחינה מבנית. עם זאת, זה עדיין נותר מאתגר במחקר המבני של חלבונים קטנים וסימטריים, במיוחד לדינמיקה מבנית וחלבונים גמישים, כגון נוגדנים וHDLs. מיצוע מבוסס על ההנחה שחלקיקי חלבון זהים במבנה ובקונפורמציה אבל different באורינטציות, חלבונים ואולם רבים ידועים לעבור תנודות תרמודינמיים בפתרון. על ידי יישום שיטת המיצוע בלי לדעת בעבר תנודות תנודות תרמודינמיים החלבון, מבנה הממוצע יכול לעתים קרובות לגרום חסר תחומים 10,80 או וריאציה מקומית ברזולוציה 81 בשחזורי cryo-EM. ההצלחה בהשגת שחזור 3D של חלבון קטן, כגון 53 kDa CETP, ומבנה 3D של חלבון בודד, כגון 160 נוגדן kDa IgG1, יתרונות משימוש במצב ההדמיה מוקד הקרוב Scherzer תחת מצב יישור נכון. למרות ניגוד התמונה נראה נמוך בכמעט Scherzer תמונות מוקד, לעומת זאת ניתן לשפר בקלות פשוט על ידי החלת סינון מעביר נמוך כדי להפחית את הרעש בתדר גבוה ברקע. אנו מאמינים, כמעט Scherzer להתמקד תמונות לשאת אותות מבניים המרביים, ויכול להגביר את הדיוק של יישור חלקיקים ולשפר את אפיבקיאות בשחזור 3D חלקיק יחיד ושחזור טומוגרפיה של האלקטרון בודד של חלקיקים.

הבנת תפקוד חלבון דורשת ידע במבנה חלבון. נחישות מבנית מהווה אתגר עבור חלבוני המונים שמולקולריים נמצאים ב40-200 kDa. קריסטלוגרפיה רנטגן מוגבלת על ידי התגבשות חלבון; תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) מוגבלת להמונים מולקולריים פחות מ -40 KDA, בעוד מיקרוסקופ אלקטרוני cryo- (cryo-EM) יש קושי בשתי רכישת התמונה ושחזורים תלת ממדים (3D) של חלבונים קטנים, שהמונים מולקולריים פחות מ -200 kDa. יש לציין, יש להם יותר מ -50 חלבונים% מסה מולקולרית בטווח של 40-200 kDa 1,2, כשיטות הנוכחיות מאתגרים בלימוד חלבונים בגודל זה, יש צורך בשיטה חדשה. למרות שרוב מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEMs) מסוגלים רזולוציה אטומית, כלומר, טוב יותר מרזולוציה של 3 א &#39;, השיג אפילו מבנה רזולוציה ננומטר ליד מדגימות ביולוגיות הוא לא challenגינג 7. נזקי קרינה, ניגודיות נמוכה, סטיות מבניות, כמו גם חפצים כגון התייבשות כל לעכב הדמיה TEM ברזולוציה גבוהה 3,8. בין גישות TEM שונות, cryo-EM הוא שיטת קצה מתקדמת וחיתוך כדי להשיג מבנים ברזולוציה אטומיים של מקרומולקולות הגדולה סימטרית מאוד, בתנאים פיסיולוגיים ליד 9-12. מדגם cryo-EM הוא הבזק מוכן הקפאת פתרון המדגם, הטבעת מקרומולקולות בקרח זגוגי, אשר צילם לאחר מכן בקירור כגון טמפרטורות חנקן או הליום נוזלי 13. Cryo-EM יש יתרון בדגימות שאינם מהוות חפצים וכמעט ילידים במבנה 8-12. Cryo-EM עושה לי החסרונות שלה: i) התקנים נוספים נדרשים להיות מותקנים או נרכשו לשדרג מכשיר TEM סטנדרטי ליכולת cryo-EM. התקנים כוללים: אנטי contaminator, cryo-מחזיק, תוכנת מצב במינון נמוך וSensi במינון נמוךמצלמה המופרזת CCD, למרות שהמחירים של מכשירים אלה נמוכים בהרבה מהמחיר של מכשיר TEM עצמו; ii) פעולת cryo-EM זקוק לזמן ארוך יותר מפעולת NS. בחינת דגימת cryo-EM לעתים קרובות דורשת זמן רב יותר כדי להכין את הדגימות והפעלת מכשיר TEM מזה של NS כי cryo-EM דורש טיפול בקשיים נוספים, ביניהם: פעולה נוזלית בטמפרטורת חנקן, טעינת מדגם, להיסחף הדמיה, טמפרטורה הדרגתיים, במינון נמוך פעולת מודל, מדגם רגישויות קרינה ומגבלות מינון. צעדים נוספים אלה יהיו להאט את המהירות של רכישת מידע שימושי בהשוואה לרכישת נתונים NS, אם כי בהחלט ניתן להשיג כמה תמונות cryo-EM בשעה 1 או פחות מומחי cryo-EM עם המכשיר מוכן עם שיפוע טמפרטורה מאוזן על ידי; iii) משתמשים דורשים הכשרה נוספת, כגון טיפול בחנקן נוזלי, הקפאת רשתות cryo-EM, פעולה במינון נמוך, מדידת מינון, טיפול בגבייה, נסחף וידע בproc ההדמיהEssing; iv חוסר) של הדמיה לשחזור לאותו cryo-הדגימה במהלך פגישות TEM שונות. דגימות Cryo-EM נפגמים בקלות זיהום קרח במהלך טעינה ופריקה דגימה מ / אל מכשיר TEM. נזק זה הוא בעיקר דאגה כאשר הדגימות קשות להיות מבודד / מטוהר 14; v) חלבונים קטנים (&lt;200 kDa מסה מולקולרית) מאתגרים להיות צילם בגלל ניגודיות נמוכה; vi) ניגודיות הנמוכה ורעש גבוה של תמונות cryo-EM מפחית את הערך חוצה קשר בין תמונות, ולכן, הפחתת דיוק הכולל בקביעת אוריינטציות חלבון, תצורות וסיווגים, במיוחד עבור חלבונים שהן מבחינה מבנית גמישים ובאופן טבעי להשתנות בפתרון 4,5. מכתים שלילי (NS) הוא שיטה יחסית &quot;עתיקה&quot; והיסטורית שכל מעבדה, עם כל סוג EM, יכולה לנצל כדי לבחון את מבנה חלבון. ברנר והורן פיתחו o התפיסה ראשונהf מכתים שלילי לפני מחצית המאה לבחינת וירוסים 15. NS נעשה באמצעות ציפוי הדגימה עם מלחי מתכות כבדות טעונים. מושג זה מגיע במקור ממיקרוסקופ אור ואת הפרקטיקה של הטבעת חיידקים לפתרון כתם מתן חשכה סביב הדגימות, המאפשר לעומת תמונה גבוהה יותר בעת הצגת התמונה השלילית 16. מאז יש לי היונים של מתכות הכבדות יכולת גדולה יותר לפיזור אלקטרונים בהשוואה לאטומים פחות צפופים בחלבונים 17-20, וכתם ציפוי מתכת כבדה מאפשר הגבלת מינון גבוהה יותר עם ​​ניגודיות משופרת. דגימת NS יכולה לספק תמונות בחדות גבוהה 8 לקביעת אורינטצית חלקיקים קלה יותר ושחזור 3D מאשר תמונות מcryo-EM. NS המסורתי, למרבה הצער, יכול לייצר חפצים הנגרמים על ידי אינטראקציות כתם חלבון, כגון צבירה כללית, ניתוק מולקולרי, השטחה ולערום 8,21,22. להגנה של מחזור שומנים הקשוריםתוספות, כגון יפופרוטאינים 16,23-30, תוצאות חפץ נפוץ בחלקיקים שנערמים וארוזים יחד לתוך rouleaux (איור 1) 31-36. מחקרי ליפופרוטאין רבים, כגון ג&#39;ל אלקטרופורזה nondenaturing polyacrylamide שיפוע, cryo-EM לומד 13,29,37-40, ספקטרומטריית מסת 39,41, ונתונים עקיפה X-ray זווית קטנים 42 כל החלקיקים ליפופרוטאין המופע הם חלקיקים בודדים במקום שנערמו באופן טבעי יחד יוצר rouleaux 21,29,30,35,42-45. התצפית של היווצרות rouleaux ידי NS הקונבנציונלי נגרמה ככל הנראה על ידי אינטראקציות דינמיות בין ליפופרוטאינים מורכבים מapolipoproteins (apo) ופוספוליפידים שהן מבחינה מבנית גמישים בפתרון 13,29,30,46-49 ורגישות לפרוטוקול NS הסטנדרטי. לזהות חפץ זה, מדגם אפוליפופרוטאין E4 (apoE4) palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) שימש כמדגם בדיקה וcryo-תמונות EM לסטנדרטיים חפץ חופשי 29, הקרנת דגימות NS הוכנו תחת שורה של תנאים. על ידי השוואת הגדלים של חלקיקים וצורות המתקבלים מNS וcryo-EM, הסוג המסוים של מגיב מכתים וריכוז מלח נמצאו שני פרמטרים מרכזיים שגורמים לתופעות rouleaux הידועות. לפיכך, פרוטוקול מכתים שלילי מוטב (OpNS) דווח. על ידי OpNS, תופעת rouleaux הידועה של apoE4 HDL חוסלה על ידי OpNS (איור 2 א). ניתוח סטטיסטי הראה תשואות OpNS תמונות דומות מאוד (סטייה פחות מ -5%) בגודל ובצורה בהשוואה לאלה מcryo-EM, אולם הניגוד חוסל. האימותים של OpNS בוצעו על ידי בחינת ביטול חפץ rouleaux של כמעט כל מעמדות או subclasses של דגימות ליפופרוטאין 6,29,30,50,51, כוללים ננומטר apoA-אני 7.8 (איור 2), 8.4 ננומטר (איור 2 ג) , ד 9.6 ננומטרiscoidal מחדש HDL (rHDL) (איור 2 ד), 9.3 הכדורי rHDL (איור 2E) ננומטר, HDL האנושי פלזמה (איור 2F), apoA-I חופשי שומנים (איור 2G), HDL פלזמה (איור 2H), ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL ) (איור ט 2), ליפופרוטאין בצפיפות ביניים (IDL) (איור &#39;י 2), ליפופרוטאין בצפיפות נמוך מאוד (VLDL) (איור 2K), ויפוזום POPC (איור 2L) 30. אימותים נוספות בוצעו על ידי ההדמיה חלבונים קטנים וסימטריים, הכוללים חלבון 53 kDa העברת אסתר cholesteryl (CETP) (איור 3 א - ג) 6,29, ונוגדן IgG kDa גמיש מאוד 160 (איור 4 א &#39;וב&#39;) 4,5,29 , 52 ושני חלבונים, מבני ידועים, GroEL ופרוטאזום (איור 2M וN). לצורך באימות נוספת מגolleagues, אנחנו פתוחים לכל בדיקות עיוורים בשיטת OpNS זה. OpNS כפרוטוקול תפוקה גבוהה גם נעשה שימוש כדי ללמוד מנגנון חלבון באמצעות בחינת מאות דגימות של חלבונים קטנים, כגון CETP שמחייבים חלבונים שונים תחת תנאי סדרה (כולל CETP אינטראקציה ל4 סוגים של ליפופרוטאין, HDL recombined, הפלזמה HDL, LDL וVLDL, עם / בלי 2 נוגדנים, H300 וN13, תחת פעמים 9 דגירה, כוללים 3 דקות, 20 דקות, 1 שעה, 2 שעות, 4 שעות, 8 שעות, 24 שעות, 48 שעות ו72 שעה, מתחת לגיל 4 יחסים טוחנות, כלומר, 1: 0.5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, ו -3 דילולים, כלומר, 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 0.001 מ&quot;ג / מ&quot;ל, בתוספת דגימות בקרה נוספת 0.01 מ&quot;ג / מ&quot;ל ו, כוללים CETP לבד, LDL לבד, וVLDL לבד, עם בדיקות משולשים של ניסויים לעיל על ידי אנשים שונים) 6,29. OpNS תמונות של CETP סופקו תמונות עם ניגודיות גבוהות עם פרטים מבניים בסדר סביר; ומאפשרים לנו לשחזר את מפת צפיפות 3D של 53 kDa SMA בהצלחהחלבון ll CETP (איור 3D - F) על ידי שחזור חלקיק יחיד. יתר על כן, תמונות OpNS ניגודיות הגבוהה מספקות לנו אות מספיק מחלבון בודד (איור 4 א - ג), אשר אפשר לנו להשיג את החלטת ביניים ש( ~ 1.5 ננומטר) של יחיד (אובייקט אחד, לא ממוצע) מבנה IgG נוגדן 3D באמצעות שיטת טומוגרפיה של האלקטרון בודד חלקיקים (IPET) (איור 4E - J) 5. התיאור מפורט של אסטרטגית IPET שיקום, מתודולוגיה, תהליכי צעד אחר צעד וניתוח וריאציה מבניים שדווח בעבר 4. סרט על נהלי שחזור נוגדן IPET, כוללים תמונות גולמי ותוצאות ביניים, מפת צפיפות 3D ועגינה מבנית היה זמין גם לציבור על ידי שהועלה ליוטיוב 5. השוואה של 3D השחזורים מחלקיקי נוגדן בודדים שונים יכולה לחשוף את הדינמיקה של החלבונים וגשינויי onformational במהלך תגובות כימיות 4,5. בהתחשב בכך שמעל 50% מחלבונים יש מסה מולקולרית הנעה 40-200 kDa 1,2, ההצלחה בהדמית החלבונים הקטנים האלה מעידה כי שיטת OpNS היא כלי שימושי כדי לדחוף את גבול EM הקונבנציונלי כלפי קביעות מבניות קטנות וסימטריות ותגליות מנגנון . לפיכך, הפרוטוקול מפורט מסופק כלהלן.

<table><tbody><tr><td>כתם: Uranyl Formate</td><td>חטיבת האספקה של SPI של Structure Probe, Inc.</td><td>מזרק http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml 02545-AA</td><td></td></tr>: <tr><td>1 מ"ל NORM-JECT</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>מסנן</td></tr><tr><td>מזרק https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491: 0.2 &mu; מ&nbsp;</td><td>מסנן מזרק https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487 VWR</td><td>28145-487</td><td></td></tr>: <tr><td>0.02 &mu; מסנן m (אנוטופ 10)</td><td>Whatman</td><td>6809-1002</td><td>http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx</td></tr><tr><td>Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&region=US Parafilm: 4 אינץ' x 125 רגל.</td><td>VWR</td><td>470152-246</td><td></td></tr><tr><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A רשת TEM מצופה סרט פחמן: 300 רשת</td><td>Pacific Grid-Tech</td><td>Cu-300CN</td><td>http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon</td></tr><tr><td>רשת TEM מצופה סרט פחמן: 200 רשת</td><td>EMS (מדעי מיקרוסקופיה אלקטרו)</td><td>CF200-Cu</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx</td></tr><tr><td>פינצטה: פינצטה Dumont L5</td><td>EMS (מדעי מיקרוסקופיה אלקטרו)</td><td>72882-D</td><td></td></tr><tr><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5 Milli-Q Advantage A10 מערכת טיהור מים טהורים</td><td>במיוחד EMD Millipore</td><td>Milli-Q Advantage A10</td><td></td></tr><tr><td>http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117 נייר סינון: כיתה 1 מעגלים</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx</td></tr><tr><td>רדיד</td><td></td><td></td> אלומיניום <td>כל סוג</td></tr><tr><td>טיפים מסנן: טיפים מסנן אירוסול שמירה נמוכה עבור 10 ומיקרו; L Pipettors</td><td>VWR</td><td>89174-520</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>יחידת פריקת זוהר</td><td>Ted Pella</td><td>91000</td><td></td></tr><tr><td>http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm טיפים לסינון: טיפים לסנן אירוסול עם שמירה נמוכה עבור 40&micro; L פיפטורים</td><td>VWR</td><td>89174-524</td><td></td></tr><tr><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524 טיפים לסינון: VWR Signature 200 ומיקרו; L טיפים לפיפט</td><td>VWR</td><td>37001-528</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528</td></tr><tr><td>פיפט</td><td>פיפטמן</td><td>F161201 F167300</td><td>http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx</td></tr></tbody></table>

מכתים שלילי אופטימלי: פרוטוקול תפוקה גבוהה לבחינת מבנה חלבון קטן וסימטרי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

קביעה מבנית של חלבונים היא לא אתגר עבור חלבונים עם המונים מולקולריים בין 40-200 kDa. בהתחשב בכך שיותר ממחצית מחלבונים הטבעיים יש מסה מולקולרית בין 40-200 kDa 1,2, יש צורך בשיטה חזקה ותפוקה גבוהה עם יכולת רזולוציה ננומטר. מכתים שלילי (NS) במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) הוא גישה קלה, מהירה, ואיכותית אשר לעתים קרובות נעשתה שימוש במעבדות מחקר לבחינת אינטראקציות מבנה חלבון וחלבונים. לרוע המזל, פרוטוקולי NS קונבנציונליים לעתים קרובות ליצור חפצים מבניים בחלבונים, במיוחד עם יפופרוטאינים שבדרך כלל יוצרים הצגת חפצי rouleaux. על ידי שימוש בתמונות של ליפופרוטאין ממיקרוסקופ אלקטרוני cryo- (cryo-EM) כסטנדרט, הפרמטרים העיקריים בתנאי הכנת דגימת NS הוקרנו לאחרונה ודווחו כפרוטוקול מותאם NS (OpNS), פרוטוקול NS קונבנציונלי שונה 3. חפצים כמו rouleaux יכול להיות מוגבל במידה רבה על ידי OpNS, בנוסף מספק ניגודיות גבוהה יחד עם רזולוציה גבוהה באופן סביר (ליד ננומטר 1) תמונות של חלבונים קטנים ולא סימטריים. תמונות ברזולוציה גבוהה וניגודיות גבוהה אלה הן גם נוחים לחלבון בודד (אובייקט בודד, לא ממוצע) שחזור 3D, כגון נוגדני kDa 160, באמצעות השיטה של טומוגרפיה של אלקטרון 4,5. יתר על כן, OpNS יכול להיות כלי תפוקה גבוהה לבחון מאות דגימות של חלבונים קטנים. לדוגמא, המנגנון שפורסם בעבר של 53 חלבון העברת אסתר cholesteryl kDa (CETP) מעורב ההקרנה והדמיה של מאות דגימות 6. בהתחשב cryo-EM רק לעתים נדירות בהצלחה חלבוני תמונות פחות מ -200 kDa טרם לפרסם כל מחקר שכלל הקרנה מעל מאה תנאי מדגם, זה הוגן לקרוא לOpNS שיטת תפוקה גבוהה ללימוד חלבונים קטנים. אני מקווה שהפרוטוקול OpNS מוצג כאן יכול להיות כלי שימושי לדחוף את הגבולות של EM ולהאיץ מחקרי EM לתוך מבנה חלבון קטן, דינמיקה ומנגנונים.

יותר ממחצית מחלבונים הם חלבונים קטנים (מסה מולקולרית &lt;200 KDA) שקוראים תיגר על שתי הדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים ושחזורים תלת ממדים. מכתים שלילי אופטימלי הוא פרוטוקול תפוקה גבוהה חזקה ולהשיג ניגודיות גבוהה ויחסית ברזולוציה גבוהה (~ 1 ננומטר) תמונות של חלבונים סימטריים קטנים או מתחמים בתנאים פיסיולוגיים שונים.

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לדמות חלבון קטן ואסימטרי באמצעות פרוטוקול אופטימלי בעל תפוקה גבוהה של מיקרוסקופיה אלקטרונית בצביעה שלילית. דבר זה מושג תחילה על ידי דגירה של החלבון בתחנת דגירה מוכנה, תוך כדי הכנת תחנת עבודה לצביעה שלילית. השלב השני של הפרוצדורה הוא שטיפה מהירה של הדגימה על שלוש טיפות מים באופן רצופים.השלב השלישי הוא צביעה זהירה של הדגימה על שלוש טיפות צבע באופן רציף. השלב האחרון הוא הסרת עודפי התמיסה על ידי ספיגה מגב רשת ה-EM ולאחר מכן ייבוש עדין תחת זרם גז חנקן. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להציג תמונות ברזולוציה גבוהה של חלבונים קטנים באמצעות דימות TEM תחת תנאי defocus נמוך.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני מיקרוסקופיה אלקטרונית קריוגנית הוא היכולת לאפשר בדיקה בתפוקה גבוהה ודימוי בניגודיות גבוהה של מבני חלבון קטנים ואסימטריים, תוך הפחתת ארטיפקטים מבניים המאפיינים צביעה שלילית קונבנציונלית. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הבסיס המבני של מנגנונים של חלבונים קטנים, כגון חלבון העברת אסטרי כולסטרול.ניתן ליישם זאת גם על חלבונים אחרים, כגון נוגדן IgG1, ליפופרוטאין בעל צפיפות גבוהה (HDL) ופרוטאוזום, הנבדלים מאוד בגודלם. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי השטיפה והצביעה קשה ללמוד בשל השונות בעיתוי, ואף ספיגה (blotting) של הדגימה עלולה לגרום להשפעות דרמטיות על החלבון הצבוע הסופי. הדגמת הפרוצדורה תועבר עבור עמיתי מחקר Z.A מהמעבדה שלי. בעת ההכנה לפרוטוקול זה, יש להכין תמיסת 1% urea-formaldhyde תוך תשומת לב מרבית לצמצום חשיפתה לאור.זה כולל עטיפת חלקי המסנן של המזרק בנקבים של 0.2 micron בנייר אלומינום כאשר מגיע הזמן לסינון ראשון של התמיסה. לאחר הסינון, יש לאחסן מנות (aliquots) של שני מיליליטר בבקבוקוני vial עטופים בנייר אלומינום בטמפרטורה של 80- degrees Celsius ביום הניסוי. יש להפשיר מנה אחת במקלחת מים בטמפרטורת החדר עד להפשרה מלאה.סננו זאת שוב באמצעות מסנן של 0.02 micron כאשר החלקים עטופים בנייר אלומיניום. יש לעטוף בנייר אלומיניום גם את מבחנת האיסוף. העבירו את צבע השלילה (negative stain) לקופסת קרח עד לשימושו.הכינו דף להחזקת טיפות על ידי לחיצת רצועת Parafilm באורך של שמונה אינץ' על תומך לקלפיות פיפטה. פעולה זו יוצרת שקעים המשמשים כבארות בקוטר של 5 mm. לאחר יצירת שש שורות של בארות, השטיחו את הקרח על פניו של מגש סטירופור, ולאחר מכן הניחו את הדף על הקרח.בשלב הבא, הוסיפו 35 µL של מים מזוקקים (DI water) לשלושת הבארות הראשונות בלוח בצד שמאל. לאחר מכן, מלאו את שלוש הבארות הימניות בלוח ב-35 µL של תמיסת הצביעה השלילית שהוכנה. כסו את המגש כדי למזער את החשיפה של התמיסה לאור.זה ישמש כתחנת צביעה. כעת הכינו תחנת אינקובציה של רשתות EM מקופסה ריקה של טיפים לפיפט עם תוספת שעליה ניתן להרכיב פינצטה. מלאו את הקופסה עד מחציתה בקרח, כך שפני השטח של הקרח יהיו קרובים לקצה הפינצטה כאשר היא מורכבת.ראשית, בצעו פריקה חשמלית (glow discharge) לרשתות נחושת 300 mesh מצופות פחמן דק למשך כ-10 שניות. לאחר מכן, הרימו רשת באמצעות פינצטה שנתפסת בתחנת ההדגרה של רשתות ה-EM. תלו את הפינצטה עם הרשת, כך שהרשת תהיה בנטייה של 45 מעלות, במרחק של חצי אינץ' מעל הקרח.כעת יש לדלל את דגימת החלבון ב-DPBS לריכוז של 50 עד 100 micrograms של חלבון ל-milliliter של תמיסה. יש להעביר מיד כ-four microliters מהדילול אל רשת ה-EM. יש להמתין לדגימה בזמן אינקובציה של כדקה אחת.לאחר דקה אחת, טפחו במהירות על הרשת בעזרת נייר סינון כדי להסיר עודפי תמיסה. לאחר מכן, בתחנת הצביעה, געו עם הרשת בטיפת המים הראשונה על ה-para film. חזרו במהירות על תהליך ייבוש המסנן והרטבתו עם הטיפה הבאה.השתמשו בסך הכל בשלוש טיפות מים ובצעו זאת במהירות רבה ככל האפשר. יש לשטוף את הרשת במים במהירות כדי למנוע השפעה שלילית של שינוי הבופר על החלבון. לאחר ספיגת השטיפה האחרונה בתוך שלוש שניות, התחילו להניח את הרשת על הטיפה הראשונה של תמיסת הצביעה השלילית.השאירו את הדגימה לצוף שם למשך 10 שניות. בינתיים, נקו את הפינצטה על ידי לחיצת הקצוות על נייר סינון. לאחר צף של עשר שניות, ספגו את התמיסה בעזרת נייר סינון והחילו את הדגימה לצף בטיפת צבע נוספת למשך שתי שניות.נקה את הפינצטה במהלך שתי השניות. לאחר מכן, ייבש את הרשת בעזרת נייר סופג והנח אותה על הטיפה השלישית. במשך דקה שלמה, כסה את תחנת הצביעה במהלך שלב זה.יש להסיר את הצבע על ידי נגיעה בגבה של רשת ה-EM למשך זמן מדויק כדי להבטיח שהרשת תתייבש באופן אחיד. אם נייר הסינון יבוא במגע עם הצבע למשך זמן רב מדי, עלול להיות מוסר צבע רב מדי, מה שיוביל לאיכות דימוי נמוכה. לאחר מכן, המשיכו לייבוש הרשת.ראשית, הצמד את כל הצד שאינו מכוסה בפחמן לנייר סינון עד להעברת התמיסה. שנית, החל זרם עדין של גז חנקן. כעת העבר את הרשת לצלחית מרופדת בנייר סינון וכסה את הצלחת באופן חלקי.השאירו את הרשת להתייבש בצלחית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לחלופין, ניתן לאפות דגימות המכילות ליפידים ב-40 °C למשך שעה. לאחר ייבוש מלא, העבירו את רשת ה-EM לקופסת אחסון עבור רשתות EM לפני תחילת העבודה; ראשית, בצעו יישור ל-TEM.בדוק את הרזולוציה של טבעת ההפשרה (thaw ring) הגבוהה ביותר הנראית באמצעות ספקטרום ההספק (power spectrum) של אזור פילם הפחמן בסריג שנצבע בצביעה שלילית, אשר צריכה להיות טובה יותר מהרזולוציה המיועדת. לאחר מכן, כדי לכוונן את היישור, בדוק בקפידה את ספקטרום ההספק באזור פילם הפחמן של הדגימה. בתנאי יישור תקינים, ניתן להבחין ביותר מ-20 טבעות Thaw, מה שמתאים לרזולוציה טובה מחמישה אנגסטרומים.הטבעות נוצרו באמצעות התמרת פורייה של תמונת פחמן אמורפי תחת דפוקוס של 1.6 microns ומינון של 20.4 electrons per square Angstrom. כעת החזירו את המיקוד למצב שקרוב למיקוד שרצר (Scherzer focus), בסביבות 0.1 micrometers, לצורך דימוי של חלבונים קטנים במהלך בחינת רשת ה-EM. באופן אידיאלי, אזורים צבועים נמצאים בדרך כלל ליד הקצה של אזורי עננות צבועים ועבים יותר בהגדלה נמוכה.מבנה של דגימות ליפופרוטאין נבחנו באמצעות OPNS. דוגמאות כוללות HDL רקומביננטי, פלזמה אנושית, LDL, IDL מפלזמה אנושית ו-VLDL מפלזמה אנושית. מבנים קטנים יותר, כגון CETP במשקל 53 kilodalton, נבחנו אף הם.זהו אחד החלבונים הקטנים ביותר שניתן לצלם בהצלחה באמצעות eem. חפיפה של מבנה הגביש של CETP תואמת היטב את התמונה, באופן דינמי מאוד. חלבונים הטרוגניים נבחנו גם בנוגדני immunoglobulin G של 160 kilodalton.שלושה תתי-דומיינים היו גלויים בבירור. בבחינה מעמיקה יותר של הנוגדן IgG1, נעשה שימוש במבנה הגבישי שלו לצורך השוואה. המבנה הגבישי של הנוגדן IgG1 תואם לתצוגת ה-EM של נוגדיים אלו במובנים רבים, כגון במיקומי הדומיינים ובצורותיהם.מולקולות נוספות שנבחנו כוללות apo lipoprotein A one grow EL חסר ליפידים במשקל 28 kilodalton, ופרוטאוזומים. ביסודו של דבר, שיטת ה-OPNS מקדמת באופן משמעותי את גבולות הדימוי ב-EM למבנים א-סימטריים קטנים וכן למחקרים מכניסטיים נלווים. בעת ביצוע הפרוצדורה, חשוב לצמצם ככל האפשר את החשיפה לאור של ריאגנט הצביעה, לשטוף את הדגימה במהירות ולהשתמש במיקוד near treasure לצורך הדימוי לאחר ביצוע פרוצדורה זו.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון טומוגרפיה אלקטרונית, כדי לענות על שאלות נוספות כמו מבנים ברזולוציית ננומטר של מולקולות בודדות והשינויים הקונפורמציונליים ביניהן. לאחר פיתוח זה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה המבנית לחקור את המגנטים של העברת אסטרים בצביר בקרב ליפופרוטאינים של פלזמה אנושית.

optimized-negative-staining-high-throughput-protocol-for-examining

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

מאמר זה מתאר שיטה סטנדרטית לקבל תלת ממדי (3D) שחזור של מקרומולקולות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מכתים שלילי (EM). בפרוטוקול זה, אנו מסבירים כיצד לקבל את מבנה 3D של מורכבות exosome cerevisiae Saccharomyces ברזולוציה בינונית באמצעות שחזור אקראי חרוטי להטות את השיטה (RCT).

חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים שיקום במתחם Exosome שימוש בשיטה אקראיים הטיה חרוטי

דגימות חלבון חזותי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים שלילי כתם (EM) הפך פופולרי שיטת ניתוח מבניות. זה שימושי עבור ניתוח מבניות כמותיים, כגון חישוב שחזור 3D של מולקולות הנלמד, וגם לבחינה איכותית של איכות ההכנות חלבון. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים להכנת רשתות EM, מכתים את המדגם באופן חזותי את המדגם אלקטרון במיקרוסקופ. משתמשי המחשב השני יכול לעקוב אחר הפרוטוקולים הללו בקלות לנצל שלילי כתם EM כמו assay שגרתי, בנוסף מבחני ביוכימיים אחרים, להערכת דגימות חלבון שלהם.

לדמיין חלבונים מכלולים Macromolecular על ידי א.מ. כתמים שליליות: החל הכנה רשת הרכישה תמונה

סרטון זה מתאר הליך להכתמה שלילית של אקסוזומים מטוהרים. האקסוזומים המוכתמים באופן שלילי מצולמים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. טכניקה זו מסייעת לדמיין את המורפולוגיה של אקסוזומים.

צביעה שלילית של אקסוזומים מטוהרים: הליך להמחשת מורפולוגיה אקסוזום באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

חלבונים רבים מבצעים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטחי הממברנה. ניתן לדמות בעקיפין את הקישור של חלבונים חיצוניים על ממברנות ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנו מראים כי הערימה האופיינית (רולו) של ננו-דיסקים הנגרמת על ידי הכתם השלילי נתרן פוספוטונגסטט נמנעת על ידי קשירה של חלבון חיצוני.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

כתם שלילי EM היא טכניקה חזקה להמחשת המבנה macromolecular, אבל טכניקות צביעת שונים יכול לייצר תוצאות שונות באופן תלוי מדגם. הנה מספר גישות מכתימים שלילי מתוארים בפירוט כדי לספק זרימת עבודה ראשונית בהתמודדות עם הפריט החזותי של מערכות מאתגר.

וריאציות על שלילי כתם מיקרוסקופ אלקטרונים שיטות: כלים בהתמודדות עם אתגר מערכות

מכשיר ושיטות ההכנה של אמצעי אחסון מדגם בגודל nanoliter במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מוצג. אין מדרגות נייר סופג נדרשים, וכך להימנע ההשלכות מזיקה שיכולה להיות חלבונים, הפחתת הדגימה אובדן ולאפשר הניתוח של תא בודד lysate עבור פרוטאומיקס חזותי באופן משמעותי.

הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-קריואיפקס, בה חלבון ממברנה APEX2 מתויג יכול להיות מקומי על ידי שידור אלקטרון מיקרוסקופ בתוך מבנה מיטבי משומר התא.

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

קביעת מבנה של מתחמים מקרומולקולריים באמצעות cryoEM הפכה לשגרה עבור סוגים מסוימים של חלבונים ומתחמים. כאן, צינור זה מסוכם (הכנה לדוגמה, סינון, רכישת נתונים ועיבוד) והקוראים מופנים למשאבים ומשתנים מפורטים נוספים שעשויים להשתנות במקרה של דגימות מאתגרות יותר.

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

פרוטוקול זה מציג שיטה מעשית המשתמשת ב-Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) כדוגמה לטיפול בהתפלגות חלקיקים לא אחידה באמצעות אופטימיזציה של הכנת הדגימה, ומספק התייחסות לחוקרים להבהיר ביעילות מבנים מקרומולקולריים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryo-EM).

אופטימיזציה של הכנת דגימה למיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני

למד פרוטוקול מכתים שלילי אופטימלי לדימוי חלבונים קטנים ואסימטריים במיקרוסקופית אלקטרונים. שיטה זו מאפשרת בחינה בתפוקה גבוהה והפקת תמונות ברזולוציה גבוהה עם ניגודיות משופרת.

מכתים שלילי אופטימלי: פרוטוקול תפוקה גבוהה לבחינת מבנה חלבון קטן וסימטרי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

גלה סרטונים נוספים