מכתים שלילי אופטימלי: פרוטוקול תפוקה גבוהה לבחינת מבנה חלבון קטן וסימטרי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

יותר ממחצית מחלבונים הם חלבונים קטנים (מסה מולקולרית <200 KDA) שקוראים תיגר על שתי הדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים ושחזורים תלת ממדים. מכתים שלילי אופטימלי הוא פרוטוקול תפוקה גבוהה חזקה ולהשיג ניגודיות גבוהה ויחסית ברזולוציה גבוהה (~ 1 ננומטר) תמונות של חלבונים סימטריים קטנים או מתחמים בתנאים פיסיולוגיים שונים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות חלבון קטן וא-סימטרי באמצעות פרוטוקול אופטימלי בתפוקה גבוהה של מיקרוסקופ אלקטרונים צביעה שלילית. זה מושג על ידי דגירה ראשונה של החלבון בתחנת דגירה מוכנה תוך הכנת תחנת עבודה לצביעה שלילית. השלב השני של ההליך הוא לשטוף במהירות את הדגימה על שלוש טיפות מים ברצף.

השלב השלישי הוא להכתים בזהירות את הדגימה על שלוש טיפות כתמים ברצף. השלב האחרון הוא הסרת התמיסה העודפת על ידי ספיגה מהצד האחורי של רשת ה- EM ולאחר מכן ייבוש עדין תחת גז חנקן. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות תמונות ברזולוציה גבוהה של חלבונים קטנים באמצעות הדמיית TEM בתנאי מיקוד נמוך.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני קריו אלקטרו-מיקרוסקופי נקבע. זה יכול לאפשר בדיקת תפוקה גבוהה והדמיה בניגודיות גבוהה של מבני חלבון קטנים וא-סימטריים תוך הפחתת חפצי המבנה מצביעה שלילית קונבנציונלית. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הבסיס המבני למנגנוני חלבון קטנים כמו חלבון העברת אסטר כולסטרול.

ניתן ליישם אותו גם על חלבונים אחרים כגון IgG one, נוגדן אחד, ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה ופרוטאזום, המשתנים מאוד בגודלם. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הכביסה והצביעה בגלל שונות בתזמון ואפילו כתמי דגימה יכולים לגרום להשפעות דרמטיות בחלבון המוכתם המוגמר הדגמת ההליך תחסר בקרב Z.עמית מחקר מהמעבדה שלי. כאשר מתכוננים לפרוטוקול זה, יש צורך להכין תמיסה של 1% משתנה משמונה עם תשומת לב מרבית למזעור החשיפה שלה לאור.

זה כולל עטיפת חלקי המסנן של המזרק N 0.2 מיקרון בנייר כסף כאשר הגיע הזמן לסנן תחילה את התמיסה. לאחר הסינון, אחסן שני בקבוקונים עטופים בנייר כסף בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס ביום הניסוי. הפשירו אליקוט באמבט מים בטמפרטורת החדר לאחר הפשרה מלאה.

מסננים אותו שוב דרך פילטר 0.02 מיקרון עם חלקים עטופים בנייר כסף. יש לעטוף את בקבוקון האיסוף גם בנייר כסף. העבירו את הכתם השלילי לקופסת קרח עד לשימוש.

צור יריעת אחיזת טיפות על ידי לחיצה על פרמטר באורך שמונה אינץ' על תומך קצה פיפטה. זה יוצר חריצי כביש המשמשים כבארות בקוטר חמישה מילימטרים. לאחר הכנת שש שורות של בארות, משטחים את הקרח על פני מגש קלקר, ואז מניחים את הסדין על הקרח.

לאחר מכן, הוסף 35 מיקרוליטר מי DI לשלוש הבארות הראשונות של הסדין בצד שמאל. לאחר מכן טען את שלושת הבארות הנכונות בסדין עם 35 מיקרוליטר מתמיסת הכתם השלילי המוכנה. כסה את המגש כדי למזער את החשיפה לאור לתמיסה.

זה ישמש כתחנת מכתים. כעת הכינו תחנת דגירה של רשת EM מקופסת קצה פיפטה ריקה עם חיבור שעליו ניתן להרכיב פינצטה. מלאו את הקופסה באמצע הדרך בקרח כך שמשטח הקרח יהיה קרוב לקצה הפינצטה כאשר הם מותקנים.

ראשית זוהר לפרוק את רשתות הנחושת הדקות המצופות פחמן 300 רשת EM למשך כ -10 שניות. לאחר מכן, הרם רשת עם פינצטה שמתחברת לתחנת הדגירה של רשת EM. תלו את הפינצטה עם הרשת, כך שהרשת תהיה בהטיה של 45 מעלות חצי סנטימטר מעל הקרח.

כעת יש לדלל את דגימת החלבון ב-DPBS ב-50 עד 100 מיקרוגרם חלבון למיליליטר תמיסה. יש למרוח מיד כארבעה מיקרוליטר מהדילול על רשת ה- EM. הניחו לדגימה לדגור כדקה.

לאחר דקה אחת, טפחו במהירות את הרשת בנייר סינון כדי להסיר עודפי תמיסה. ואז בתחנת הצביעה, גע ברשת עד טיפת המים הראשונה על סרט הפרה. חזור במהירות על תהליך ייבוש המסנן והחזרתו עם הטיפה הבאה.

השתמש בסך הכל בשלוש טיפות מים ועשה זאת במהירות האפשרית. שטיפת הרשת במים חייבת להיעשות במהירות כדי למנוע השפעה שלילית של שינוי חיץ לחלבון. לאחר טבילת הכביסה האחרונה תוך שלוש שניות, התחל לצוף את הרשת על הטיפה הראשונה של תמיסת הצביעה השלילית.

תן לזה לצוף שם במשך 10 שניות. בינתיים מנקים את הפינצטה על ידי לחיצה על הקצוות לנייר פילטר. כמה פעמים לאחר הציפה של עשר השניות מחק את התמיסה בנייר פילטר והתחל ציפה נוספת בטיפת הכתם הבאה למשך שתי שניות.

נקו את הפינצטה במהלך שתי השניות. לאחר מכן, כתם את הרשת יבשה והניח אותה על הטיפה השלישית. למשך דקה שלמה כסו את תחנת הצביעה במהלך שלב זה.

הסרת הכתם חייבת להיעשות על ידי נגיעה בצד האחורי של רשת ה-EM למשך זמן מדויק כדי להבטיח שהרשת מיובשת באופן שווה. אם נייר הסינון נוגע בכתם זמן רב מדי, ניתן להסיר יותר מדי כתם מה שיוביל להדמיה לקויה. לאחר מכן, המשך בייבוש הרשת.

ראשית, גע בכל הצד שאינו פחמן בנייר הסינון עד שהתמיסה עוברת. שנית, מרחו זרם עדין של גז חנקן. כעת העבירו את הרשת לכלי מרופד בנייר פילטר וכסו חלקית את המנה.

הניחו לרשת להתייבש בכלי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לחלופין, ניתן לאפות דגימות המכילות שומנים בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר ייבוש מלא, העבר את רשת ה-EM לקופסת אחסון רשת EM לפני שתתחיל תחילה, יישר את ה-TEM.

בדוק את הרזולוציה של טבעת ההפשרה הגבוהה ביותר הנראית לעין עם ספקטרום ההספק של אזור סרט פחמן של הרשת המוכתמת שלילית, שאמורה להיות טובה יותר מהרזולוציה הממוקדת. לאחר מכן, כדי לכוונן את היישור, בדוק היטב את ספקטרום ההספק באזור סרט הפחמן של הדגימה. במצב מיושר כהלכה, ניתן לדמיין יותר מ-20 טבעות T, התואמת להדמיה טוב יותר מחמש אנגסטרומים.

הטבעות נוצרו על ידי העברה פרוותית יותר של תמונת פחמן אמורפית תחת מיקוד של 1.6 מיקרון ומינון של 20.4 אלקטרונים לריבוע. אנגסטרום. כעת החזירו את המיקוד למצב מיקוד קרוב של שרצר כ-0.1 מיקרומטר להדמיית חלבונים קטנים במהלך בדיקת רשת ה-EM. באופן אידיאלי, אזורים מוכתמים נמצאים בדרך כלל ליד הקצה של אזורים עכורים מוכתמים עבים יותר בהגדלה נמוכה.

המבנה של דגימות ליפופרוטאין נצפה עם OPNS. דוגמאות כוללות HDL רקומביננטי, פלזמה אנושית, LDL, IDL פלזמה אנושית ו-VLDL פלזמה אנושית. מבנים קטנים יותר כמו 53 קילודלטון, CETP נצפו גם הם.

זהו אחד החלבונים הקטנים ביותר שצולמו בהצלחה על ידי eem. הטלת סופר של מבנה הגביש CETP תואמת את התמונה בצורה טובה מאוד, דינמית מאוד. חלבונים הטרוגניים נצפו גם בנוגדנים של 160 קילו-דלטון אימונוגלובולין G.

שלושה תת-דומיינים נראו בבירור. בחינה מדוקדקת יותר של נוגדן IgG 1 שימשה להשוואה למבנה הגבישי שלו. המבנה הגבישי של נוגדן IgG אחד תואם את נקודת המבט של EM של נוגדנים אלה במובנים רבים, כגון במיקומי התחום וצורותיהם.

מולקולות אחרות שנצפו כוללות 28 קילודלטון, אפו ליפופרוטאין A ללא שומנים, אחד שגדל EL ופרוטאזומים. בעיקרו של דבר, שיטת OPNS מקדמת משמעותית את גבול הדמיית EM עבור מבנים אסימטריים קטנים כמו גם מחקרים מכניסטיים נלווים תוך כדי ניסיון ההליך. חשוב להפחית ככל האפשר את החשיפה לאור למגיב הכתם כדי לשטוף במהירות את הדגימה ולהשתמש במיקוד קרוב לאוצר להדמיה לאחר הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טומוגרפיה אלקטרונית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו מבני הרזולוציה הננומטרית של מולקולות בודדות והשינויים המאשרים ביניהן. לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה המבנית לחקור את המגנטים של העברת אסטר צביר בין ליפופרוטאינים בפלזמה האנושית.