ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין מבנים כגון F actin בסינפסה הליטית של תא NK באמצעות מיקרוסקופ TED. זה מושג על ידי סיכום הסינפסה על זכוכית באמצעות נוגדן מפעיל. השלב השני של ההליך הוא תיקון סלסול וצביעה של התאים למבנים מעניינים.

לאחר מכן, השקופיות מצולמות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת לייזר, ואחריה יישום של דלדול במקום לרזולוציית תמונה מוגברת. השלב האחרון הוא עיבוד התמונות באמצעות אלגוריתם דה-קונבולוציה. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות רזולוציה של פחות מ-100 ננומטר של מבנים תאיים הודות למיקום צבע כפול ואנדוסקופיה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, כגון קשר בין השלד הציטולוגי לאקסוציטוזיס. במקרה שלנו, אנו מעוניינים בהפרשת ליזוזומים מיוחדים הנקראים גרגירים ליטיים על ידי תאי הרג טבעיים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שישנם מספר משתנים שניתן להתאים ביישום לייזר הדלדול של TED.

יישום לא הולם של קרן הדלדול יביא להחמרה במקום שיפור ברזולוציה בהכנה, חם 30 מיליליטר של מדיה RPMI עם 10% FCS ובנפרד. מיליליטר אחד של BD CY משפיע על סלסול cyop שניהם עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן התחל בתהליך ציפוי החלקות הכיסוי בנוגדנים.

קח את פתקי הכיסוי מספר 1.5 והשתמש בעט PAP. צור ריבועים בגודל מטבע על החלקות הכיסוי. הכן ריבוע אחד לכל מצב שנבדק.

טען כל מעגל ב-200 מיקרוליטר נוגדנים בחמישה מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS. להפעלת תאי NK 92, השתמש בנוגדנים נגד CD 18 ואנטי NK P 30. דגרו את פתקי הכיסוי העמוסים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חצי שעה, ולאחר מכן שטפו אותם בטבילה בטמפרטורת החדר PBS המשיכו מיד בהוספת התאים לכל מצב שנבדק, 500,000 תאים חייבים להיות מוכנים לשימוש.

שטפו את התאים ב -10 מיליליטר של המדיה החמה מראש ואז השעו אותם באותה מדיה מחוממת. ב-2.5 מיליון תאים למיליליטר עם התאים בתרחיף מלא, שפכו 200 מיקרוליטר לכל ריבוע נוגדנים על הכיסוי החלקות דוגרות על החלקות הכיסוי עם תאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 במקרה זה. 20 דקות מספיקות כדי לקטב את הגרגירים בתאי ה- NK לאחר שטיפת הדגירה, הכיסוי מחליק בעדינות ב- PBS בטמפרטורת החדר.

התחל בהוספת מיקרוליטר של TRITTON X 100 למיליליטר של תמיסת ציטו סלסול חמה של אפקטים BD CY. ואז מערבולת. מרחו 200 מיקרוליטר של תמיסה זו על כל ריבוע מצב על החלקות הכיסוי.

לאחר מכן הניחו את התאים בחושך בטמפרטורת החדר והמתינו 10 דקות. בסיום הדגירה, שטפו בעדינות את החלקות הכיסוי במאגר מכתים. לאחר מכן יבש את שולי האזורים המוקפים בעזרת צמר גפן.

לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של הנוגדן העיקרי במאגר מכתים לאזורים המוקפים, ותן להחלקות הכיסוי לדגור בחושך למשך חצי שעה. כמה נוגדנים משניים טובים להדמיה במקום כוללים Alexa floor 4 88 Pacific orange ו-Horizon V 500. כל אחד מאלה עובד היטב בדילול של 1 עד 200.

לאחר שטיפת הדגירה, הכיסוי מחליק פנימה, חוצץ ומייבש אותם. כמו קודם, יש למרוח 200 מיקרוליטר של הנוגדן המשני על כל ריבוע מצב. לאחר מכן הניחו להם לשבת בחושך למשך 30 דקות נוספות.

בשלב זה, ניתן להוסיף נוגדנים נוספים לאחר שטיפות נוספות. לדוגמה, ניתן ליישם את Phin ב-1 עד 200 כדי לזהות f actin. עבור מדיום הרכבה, בחר להאריך מעל מגן וקטור, שאינו תואם למקום.

אם נעשה שימוש בכתמי פין, הימנע משימוש בשני אתנול שני תיו, בעוד שזה בסדר, כעת החל 10 עד 20 מיקרוליטר של מדיום הרכבה על מגלשה. כשהחלקת הכיסוי הפוכה, הורד אותו בעדינות לתוך המדיום, הימנע מבועות אוויר. לאחר מכן דגרו על המגלשה למשך 24 שעות.

עם הכיסוי, החליקו למחרת, אטמו את החלקת הכיסוי עם לק והמשיכו בהדמיה. הפעל את הלייזרים והתוכנה. לייזר הדלדול הקבוע צריך להתחמם בעוצמה של 100% ולהיות מיושר.

באמצעות העינית, התמקד בדגימה, ולאחר מכן פנה לתוכנה. סרוק את הערוץ הראשון, זה עם אורך הגל הארוך ביותר. קומה רביעית, ייעל את עוצמת הלייזר, מיקום קרן העירור וטווח הגלאי.

הימנע מהגדרה מעל 100. לאחר מכן, צלמו תמונה קונפוקלית ובדקו אם יש פיקסלים. רוויה, קו וממוצע פריימים ישפרו שניהם את רזולוציית הפיקסלים.

המטרה היא להיות מתחת ל-30 ננומטר לפיקסל. רוויה מסוימת מקובלת על יציבות. לאחר מכן, החל את קרן הדלדול הקבועה בעוצמה של 50% וצלם תמונה.

אם הרזולוציה משתפרת, ניתן להפעיל יותר כוח. יתר על כן, התאמת עוצמת לייזר העירור או ממוצע הקו או הרווח יכולה גם לשפר את הרזולוציה. כדי להקטין את הרקע יש להחיל 0.3 ננו-שניות של שער זמן ולהתאים כלפי מעלה.

יש להעריך את הרזולוציה החדשה באמצעות חישוב מקסימלי של חצי רוחב מלא. לאחר שתהיה מרוצה, חזור על שלבים אלה עם הערוץ השני כאשר כל הערוצים מותאמים. בדוק אם יש חפיפה ספקטרלית על ידי הדמיית בקרות כתם בודד עם כל רצפי הסריקה.

ניתן לתקן חפיפה קלה באמצעות ביטול ערבוב ספקטרלי על ידי התוכנה, אך עדיף להימנע ממנה או לשמור עליה למינימום. כעת, רכוש תמונות להדמיה כמותית. השג לפחות 20 תמונות לכל מצב בהתאם לתנאי הניסוי.

כדי להאציל את התמונות השמורות, פתח את הקבצים בתוכנה המתאימה. בדוק את הפרמטרים של כל ערוץ, במיוחד ספקטרום העירור והכניסה, פליטת הדלדול הקבוע וכיוון ההדמיה. לאחר מכן החל את חישובי הדה-קונבולוציה של התוכנה.

הגדרות ברירת המחדל מספיקות בדרך כלל, אך האות לרעש ישתנה בין כוח הרצפה, כך שיש להגדיר את הפרמטר באופן ידני עבור הניסוי. ישנן כמה מלכודות נפוצות שעלולות להוביל לרזולוציה לא אופטימלית עם במקום. אחד נמצא תחת דגימה.

זה מוביל לגרגיריות ולאובדן מידע פיקסלים כמו בחוטי f אקטין אלה. הגדלת ממוצע הקו או המסגרת פותרת לעתים קרובות בעיה זו. בעיה נוספת היא הלבנה או דגימת יתר הנגרמת על ידי פיקסל ארוך.

זמן השהייה בדרך כלל עקב ממוצע קו מוגזם בסריקה לפני רכישת התמונה עשוי גם הוא להיות האשם וניתן לתקן אותו באמצעות סריקה קטנה יותר לפני רכישת תמונות או באמצעות מהירות סריקה גבוהה יותר. הפחתת עוצמת הלייזר יכולה גם לעזור בכל מה שעובד. התמונה תשתפר באופן דרמטי.

דה-קונבולוציה תשפר עוד יותר את התמונה. הן מבחינה כמותית והן מבחינה איכותית. יש להשיג רזולוציה של פחות מ-100 ננומטר באופן שגרתי בזמן ניסיון הליך זה.

חשוב לזכור לבצע יישור אלומה במקום לפני כל ניסוי וכפעם בשעה לאחר מכן לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח כמותי על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לקולוקליזציה, לוקליזציה תת-תאית ואינטראקציות מולקולריות.