Name: ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: חקור הדמיה של סינפסה ציטוטוקסית בתאי NK באמצעות מיקרוסקופיית STED דו-צבעית. השיטה מספקת רזולוציה תת-ננומטרית של מבני חלבון ושלד תאי לחקר אינטראקציות חיסוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לג&#39;ף דניאלס לקבלת סיוע טכני. עבודה זו מומנה על ידי R01 AI067946 לתזמורת ירושלים

1. Coverslips מעיל עם נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewarm (ב 37 מעלות צלזיוס) 30 מיליליטר של תקשורת FCS 10% RPMI ו1 מיליליטר של BD Cytofix / Cytoperm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של 5 מיקרוגרם / מיליליטר של נוגדן מטוהר בופר פוספט (PBS). להפעלתו של קו NK92 הסלולרי, השימוש באנטי-CD18 ואנטי NKp30 מומלץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעגל מארק אחד כ אגורה בגודל עבור כל תנאי על coverslip # 1.5 באמצעות עט PAP. לניסוי צבע כפול, לא אמור להיות ארבעה תנאים: ללא רבב, מוכתמים כפול, ושני תנאים צבעוניים אחד. לוותר 200 μl של פתרון נוגדן בכל אזור ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips ידי בעדינות לטבול כל אחד ב50 מיליליטר של PBS בצינור חרוטי 50 מיליליטר בטמפרטורת חדר. כביסה צריכה להתרחש מייד לפני התוספת יש לקחת תאים וזהירות כדי למנוע ייבוש נוגדן על coverslip. </li></ol></li></ol> 2. הפעל תאי NK בכיסויהתלושים; לתקן וPermeabilize <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד 5 x 10 5 NK92 תאים לכל מצב. צנטריפוגה ולמזוג supernatant. שטפי פעם עם 10 מיליליטר תקשורת prewarmed משלב 1.1. צנטריפוגה ולמזוג supernatant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend בתקשורת prewarmed משלב 1.1 בריכוז של 2.5 x 10 6 / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למזוג 200 μl למרכז האזור שנוצר בסעיף 1.2.1. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ב 5% CO 2. (הערה: הפעם ניתן להרחיב או להקטין בהתאם לפונקציה הביולוגית של עניין לקיטוב גרגיר תא NK, 20 דקות מספיקות.). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של תאים, לשטוף בעדינות coverslips ידי טבילת כל אחד ב50 מיליליטר של בטמפרטורת חדר PBS בצינור חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של טריטון X-100 1 מיליליטר של תמיסת תקן / פרם prewarmed משלב 1.1 ומערבולת ביסודיות. לתקן וpermeabilize ידי הוספת 200 μl של חיץ תקן / פרם (שלב 2.3) לתאים. דגירה של 10 מ &#39;בחושך בטמפרטורת חדר. </li></ol> 3. תאי כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מכתים חיץ: פוספט שנאגרו מלוח (PBS), BSA 1%, 0.1% Saponin. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של נוגדן עיקרי 200 μl חיץ מכתים (ראה שלב 3.1). (הערה: הנוגדן צריך להיות טיטרציה לפני השימוש). הימנע מהשימוש בנוגדן ראשוני, כי הוא גדל באותו המין משמש מעיל coverslip (שלב 1.2). כמו כן להימנע קשרי Strepatividin-ביוטין הדמיה STED. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות סעיף 2.3.1, לשטוף בעדינות coverslips ב50 מיליליטר מכתים את החיץ. מורח את הקצוות של אזור PAP-עט עם מקלון צמר גפן כדי להסיר חיץ עודף. החל פתרון נוגדן שנוצר בסעיף 3.1.1. דגירה 30 דקות בחושך בטמפרטורת חדר. (מומלץ: דגירה coverslips בתיבת שקופיות עם מגבת נייר לחה כדי לשמור על לחות). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של שני נוגדנים ב 200 μl הכתמהמאגר. fluorophores המומלץ הוא Alexa פלואוריד 488, פסיפיק אורנג&#39;, וV500. באופן כללי, דילול 1:200 מתאים להדמית STED. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות coverslips ב50 מיליליטר מכתים את החיץ. מורח את הקצוות של אזור PAP-עט עם מקלון צמר גפן כדי להסיר חיץ עודף. החל פתרון נוגדנים משני. דגירה 30 דקות בחושך בטמפרטורת חדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה כביסה וצביעה לחלבונים נוספים של ריבית. אם גילוי ה-F-אקטין עם Phalloidin, זה יכול להיות כלול עם נוגדנים משני, בדרך כלל בדילול 1:200. </li></ol> 4. הר coverslips על שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההרכבה בינונית. הערה: להאריך או להאריך זהב עדיף. יש להימנע Vectashield, כפי שהוא אינו תואם לSTED. יש להימנע 2,2-thiodioethanol אם Phalloidin משמש. Mowiol מקובל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כ 10-20 μl של הרכבה בינונית בשקופית. coverslip מרחב זה (תא בצד למטה) והר coverslip בעדינות, מקפידלמנוע כניסה של בועות אוויר. דגירה שקופיות עבור 24 שעות (coverslip מעלה) לפני ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום קצוות של coverslip עם לק. </li></ol> 5. ניסיוני התקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום לייזרים ותוכנה נדרשים. ליזום לייזר דלדול STED ב100% כוח. יישר לייזר STED, אשר במקרה של מערכות מסחריות הוא לעתים קרובות הליך אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס המדגם, החל בשליטה יחידה מוכתמת, על המיקרוסקופ באמצעות עיניות. </li></ol> 6. אופטימיזציה של הגדרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הערוץ הראשון ולייעל את כוח הלייזר, עמדת קרן עירור ומגוון גלאי. במידת האפשר, להימנע מרווח של&gt; 100. ללכוד את התמונה בconfocal כדי לייעל את ההגדרות. קו ו / או מיצוע מסגרת יגדיל את הרזולוציה. הגעה לרווית פיקסל. הערה: רוויה מסוימות מקובלת בconfocal כיישום של STED יפחית את עוצמת הפליטה. לSTED, גודל פיקסל אופטימלי יהיה מתחת 30 ננומטר איךרזולוציה טובה יותר אי פעם תושג עם גודל פיקסל קטן יותר. גודלו של האזור של עניין להיות הדמיה יכתיב את הגבול התחתון של גודל פיקסל. גדלי פיקסל קטנים יותר עשויים להגדיל photobleaching. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל קורה דלדול STED וללכוד תמונה, החל ב50% כוח לייזר דלדול. אם שיפור ברזולוציה נתפס, יכול להיות מיושם יותר כוח לייזר דלדול. בשלב זה, ייתכן שיהיה צורך להתאים את כוח עירור לייזר, ממוצע קו, ו / או רווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל gating זמן כדי להפחית רקע (0.3 NSEC המינימום). התאם את הגדרות עד שיפור ברזולוציה מעל confocal ניתן לראות. החלטה יכולה להיות מקורב על ידי אומדן חצי מקסימום רוחב מלא (FWHM). זה מייצג את המרחק בעצמה המקסימלי מחצית משיא גאוס נוצר על ידי ציור פרופיל קו על פני המבנה של עניין, והיא שיטה בשימוש נרחבת של הערכה ברזולוציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהערוץ הראשון הוא משביעת רצון, ליזום רצף שני עבור sequential סריקה. באופן כללי, עדיף לסרוק fluorophore אורך הגל הארוך ראשונה. חזור על שלב 6.1 בערוץ שני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר חוסר החפיפה ספקטרלית על ידי הדמיה פקדים צבעוניים יחיד עם שני רצפי הסריקה. חפיפה ספקטרלית קלה ניתן לתקן באמצעות תכונות ערבוב בלתי רפאים בתוכנה, לעומת זאת יש להימנע במידת האפשר. </li></ol> 7. רכישת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות. הדמיה כמותיים, מומלץ להשיג לפחות 20 תמונות / מצב. המספר המדויק, לעומת זאת, צריך להיות מוגדר על פי השאלה הניסיונית בתיאום עם גישה סטטיסטית כגון חישוב גודל מדגם. להציל את הניסוי. </li></ol> 8. Deconvolution <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח קובץ עם תוכנת deconvolution או מעבד אצווה. בדקו פרמטרים לכל ערוץ באמצעות תוכנה. אשר הספקטרום של כל ערוץ עירור ופליטה, פליטת דלדול STED, וdirec ההדמיהtion (למעלה או למטה, אם התמונה היא 3 ממדים) בפרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deconvolve באמצעות אשף deconvolution. הגדרות ברירת מחדל הן בדרך כלל נאותות, אולם יחס אות לרעש (SNTR) ישתנה מfluorophore לfluorophore ויצטרך להיקבע עבור כל ערוץ וכל ניסוי בנפרד. </li></ol>

<ol><li>Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse+of+CTL+contains+a+secretory+domain+and+membrane+bridges%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges.</a> Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).</li>
<li>Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mature+activating+natural+killer+cell+immunologic+synapse+is+formed+in+distinct+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).</li>
<li>Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microclusters+of+inhibitory+killer+immunoglobulin-like+receptor+signaling+at+natural+killer+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses.</a> J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).</li>
<li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).</li>
<li>Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+the+movement+of+signaling+microclusters+with+cellular+motility+in+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses.</a> Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).</li>
<li>Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+agonist+MHC-peptide+complex-dependent+T+cell+receptor+microclusters+as+scaffolds+for+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling.</a> J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).</li>
<li>Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+TCR+signaling+from+geometrically+repatterned+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses.</a> Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li>
<li>Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse%3A+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front. Immunol. 3, 421 (2012).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li>
<li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).</li>
<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li>
<li>Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscopy+in+a+living+multicellular+organism+expressing+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP.</a> Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).</li>
<li>Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+resolution+in+GFP-based+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale resolution in GFP-based microscopy.</a> Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).</li>
<li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li>
<li>Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+cardiac+mitochondrial+protein+clusters+with+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy.</a> Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).</li>
<li>Tonnesen, J., Nagerl UV, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging for neuroscience.</a> Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).</li>
<li>Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+multicolor+STED+nanoscopy+of+presynaptic+proteins+in+the+calyx+of+held%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held.</a> PLoS One. 8 (4), (2013).</li>
<li>Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+microscopy+reveals+an+array+of+MINOS+clusters+along+human+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination).</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski,, Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. 204 (10), 2305-2320 (2007).</li>
<li>Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. עלות פרסום חלקית של מאמר זה יכוסה על ידי Leica Microsystems, Inc

השיפור ברזולוציה מעל confocal יהיה קצת תלוי בגורמים שלא ניתן לשלוט. גורמים אלה כוללים סטיות קלות בעובי להחליק את מכסה וחוסר עקביות בתקשורת הרכבה. זה חשוב כדי לשמור על הטמפרטורה והלחות בחדר ההדמיה כעקבי ככל האפשר, ואת קרן STED יש realigned בערך כל 60 דקות. כפי שצוין בנהלים, יש להימנע משימוש במדיום Vectashield גובר, שכן זו אינה תואמת לSTED. בנוסף אליו, יש תמיד להשתמש # 1.5 התלושים לכסות, ואם זמין, להשתמש באותם אשר אומתו לעובי מסוים. שינוי אחד של הגישה שתוארה כאן הוא לערוצים נוספים בתמונה confocal, באמצעות fluorophores שפולט באורך גל ארוך יותר מקורה STED. בדרך זו, תמונה יכול אחד עד ארבעה ערוצים (שני בconfocal, שתיים בSTED). עם זאת, דואר הערוצים עם fluorophores אם לוקח את הגישה הזוmitting מעל לייזר דלדול STED יצטרך להיות צילם ראשון, כיישום של קורה STED יהיה לרוקן פוטונים בערוצים אלה. אחד יתרונות לטכניקה זו הוא היישום של gating הזמן, שגם ישפרו את הרזולוציה בconfocal על ידי ביטול פליטה מפוטונים עם משך חיים קצרים 34. בפרט, השימוש בgating הזמן, העיתוי של גלאי פליטה להתכתב עם עירור פעם STED, יקטן הקרינה רקע מהשתקפות מזכוכית coverslip כאשר הדמיה קרובה אליו. גם בניסוי אינו מתאים לSTED, אם באמצעות מקור עירור פעם, gating הזמן יכול להיות כלי שימושי לשיפור רזולוציה בconfocal. ישנם שינויים שונים שיכול להיות מנוצל כדי לשפר את הרזולוציה בSTED. אחת הוא להקטין את גודל חריר מיחידת Airy 1 הסטנדרטי, אם כי זה גם יקטין את כמות האור המגיע למדגם. זה יכול להיות פיצוי על ידי הגדלת lasכוח אה או רווח. נוסף הוא להגדיל את ממוצע הקו, אשר יגדיל את כמות המידע שנאספה עבור כל פוטון, שיפור ברזולוציה. שוב, עם זאת, זה עשוי להיות בעלות של photobleaching של המדגם, ולכן איזון צריך להיות פגע בין הרזולוציה ולבנה. באופן דומה, שימוש בחלבוני ניאון כגון GFP ידרשו אופטימיזציה זהירה, כדי למנוע הלבנת. ניתן לעשות זאת על ידי הפחתת כוח לייזר STED במידת צורך. נקודות זמן ארוכות יותר תאפשר גם להתאוששות פוטון גדולה יותר ולצמצם את הלבנת. תיקון לphotobleaching יטופל בעת ניתוח STED חיות. כמובן, ההדמיה ב 3 ממדים בSTED היא גם אפשרית, וגם תיתן שיפור לעומת confocal הדמיה קונבנציונלית. זה נכון במיוחד אם זה נעשה בשילוב עם deconvolution, אם כי יש לנקוט זהירות כדי לתקן את סחיפה המתרחשת במהלך ההדמיה מטוסים מרובים בציר ה-z. אם אתם משתמשים בתוכנת הויגנסלdeconvolve, תיקון זה מתקבל באמצעות התכונה &quot;לייצב תמונה&quot;. שימוש בגישה זו, ברזולוציה בציר ה-z תהיה שיפור. זהו שיפור גדול על פני הדמיה קונבנציונלית confocal, שבו יש רזולוציה צירית עניות, ואפילו על סתם STED עצמו, שיש גם ברזולוציה Z-ציר דל יחסית. בעוד רכישת ערימות מרובות בSTED, יש לנקוט בזהירות כדי למנוע הלבנת של המדגם, ובמידת צורך ניתן להפחית מיצוע קו או עוצמת כוח לייזר על מנת לעשות זאת. שוב, יש לציין שאם הדמיה fluorophores האחר שאינם מתאימים לSTED, יישום של קורה דלדול בסריקה סדרתית הראשונה ימנע פליטה מערוצים אלה. לכן, גישת STED / confocal מעורב (בעת השימוש בסריקת confocal בערוצים אשר פולטים באורך גל גדול מ592 ננומטר) תהיה למרבה הצער, לא בהכרח מתאימה ל3D. לסיכום, יש לנו נבחרו STED כגישה בשל קלות היחסית של יישוםlication ושיפור ברזולוציה מעל confocal הדמיה סטנדרטית. הדמיה סינפסה החיסונית, היא הוכיחה טכניקה יעילה ובעל ערך שמאפשרת לנו לראות פרטים בארכיטקטורת ה-F-אקטין לא ניתן ברזולוציה מעל 200 ננומטר. בעוד שרבים מהפרטים האלה נראים עדינים, הם יכולים להיות השפעה עמוקה על תפקוד תא NK. לפיכך, אנו פונים טכנולוגיית ההדמיה הננוסקופי האחרונה להפקת מידע זה הוא קריטי לשמירה על בריאות אדם.

סינפסה החיסונית היא סביבה מורכבת של חלבוני איתות ואלמנטי cytoskeletal. סינפסה cytolytic תוארה במקור כבעל &quot;שוורי עיניים&quot; כמו מבנה עם טבעת של מולקולות אקטין והידבקות סביב תחום הפרשה מרכזי 1-4. עם זאת, עכשיו אנחנו יודעים שזה מורכב מתחומים המיקרוסקופיים של איתות פעילה שדורשים ארגון מחדש cytoskeletal דינמי מתמשך לתפקוד 5-11. חלק גדול מהמידע שיש לנו עכשיו על סינפסה כבר נגזר מיקרוסקופיה, ואימונולוגים היו מאמצים מוקדמים של טכנולוגיות הדמיה חדשניות. טכנולוגיה חדשנית אחד כזה היא מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר. במיקרוסקופ אור הקונבנציונלית מוגבלת מרחבית על ידי מחסום דיפרקציה של אור, אשר מגדיר את הגבול התחתון של רזולוציה לכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כולל confocal, בערך בשעה 200 ננומטר. בשנים האחרונות, כמה טכניקות היו לפתחד המאפשרים ברזולוציה מתחת למחסום העקיפה. אלה כוללים מיקרוסקופיה גירוי פליטת דלדול (STED), מיקרוסקופיה מובנה תאורה (SIM), מיקרוסקופיה stochastically נפתרה (סערה), וכן במיקרוסקופ photoactivatable האור (PALM). טכניקות אלו נסקרו בהרחבה במקומות אחרים 12-15, אבל הם מפורטים להלן. הרזולוציה מוגבלת Subdiffraction מופקת בדרכים ייחודיות בכל מערכת. הבחירה של טכניקה ברזולוציה סופר, ולכן, צריכה להיות מוכתבת על ידי המערכת ניסיונית הניסוי ושל עניין. ברזולוציה סופר STED מושגת באמצעות קרן דלדול torroidal בעוצמה גבוהה באופן סלקטיבי &quot;שתיקות&quot; הקרינה סביב כל fluorophore העניין הבא עירור, וכתוצאה מכך מיקרוסקופ פלואורסצנטי המוגבל subdiffraction 16-18. אחד יתרונות של STED הוא שרכישת תמונה היא מהירה ודורשת שלאחר עיבוד מועט יחסית. בעוד בחירת צבע מוכתבת על ידי המפרטעמדת tral של קורה האזילה, אשר במערכת זמינה המסחרית ממוקם ב592 ננומטר, כמה צבעים זמינים מסחרי זמינות שהופכים שילובים של שני fluorophores אפשריים. בנוסף, ניתן הדמיה כתבי ניאון נפוץ כגון ה-GFP, מה שהופך את ניסויי תא חיים אפשריים 19,20. יש לנו שימשו בעבר STED לזהות ולכמת אזורים של hypodensity F-אקטין כי הם מנוצלים על ידי תאי NK לdegranulation 21,22. אנו מציעים כי STED היא בחירה טובה עבור ההדמיה סינפסה החיסונית בשל הזמינות גמישה יחסית שלה של fluorophores ושיפור מעולה ברזולוציה בציר XY. בנוסף, על מערכת STED זמינה המסחרית מנוצל לניסויים אלה, השימוש בסורק תהודה במהירות גבוהה (12,000 Hz) מאפשר רכישה מהירה של תמונות עם נזק מינימאלי לדגימות. גמישות מוגבלת בבחירת צבע נחשבת חסרון של 12 STED,עם זאת צבע כפול STED היא פשוטה יחסית עם כמה fluorophores זמין מסחרי. שילוב של STED עם לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal גם מאפשר הדמיה confocal נוספת בשילוב עם STED, זאת תוך STED מוגבלת לשני ערוצים, ניתן הדמיה מבנים נוספים בconfocal עם רזולוציה של כ 200 ננומטר (א &#39;מייס, תצפיות שלא פורסמו ). למרות שאנו מתארים את השימוש של STED הדמיה תאים חיסוניים, טכנולוגיה זו היא ליישם במגוון רחב של סוגי תאים, כוללים תאים עצביים, ומאפשר הדמיה של מגוון מבני תא 23-26. ה-SIM משתמשת בגישה שונה כדי להפיק תמונות מוגבלות subdiffraction. על ידי הדמיה דפוסי עירור תקופתי ידועים, אז יכול להיות שהתקבל מידע על המבנה ידוע נחקר בעקבות שינוי מתמטי 27. זה מניב עלייה ברזולוציה ל ~ 100 ננומטר רוחבי 28,29. היתרון של ה-SIM הוא שזה אניים תואם את כל צבעי confocal סטנדרטיים ובדיקות, עם זאת החסרון הוא שזה הרבה יותר איטי לרכוש תמונות ואלה דורשים עיבוד פוסט ארוך 12. זה גם מגביל את השימוש בו להדמית תא חי. לבסוף, יכולות להיות שנוצרו תמונות ברזולוציה סופר על ידי צילום מיתוג סטוכסטיים של fluorophores. גישה זו מנוצלת במיקרוסקופיה לוקליזציה מופעל תמונה (PALM) ומיקרוסקופיה סטוכסטיים שיקום אופטי (STORM). על ידי סריקת מסגרות מצלמה מרובות ולוקליזציה של מולקולות מופעלות באופן אקראי, כי הם הפכו את &quot;על&quot; ו &quot;את&quot; לאורך זמן, תמונות עם הרזולוציה 20-30 ננומטר נוצרות ממסגרות שנצברו 30-32. Trade-off להחלטה זו הוא הזמן הנדרש כדי לרכוש תמונות. כאן אנו מראים, בפירוט, את הפרוטוקול להכנה ודגימות הדמיה צבע כפולים בSTED. במערכת זו, עירור הוא עם פעמו מתכונן, לייזר אור לבן,. בשל האופישל קרן עירור פעם, gating של זיהוי הזמן מתאפשר ורזולוציה עליות נוספות. בנוסף, המערכת מצוידת בגלאים היברידיים גדוליניום (HYD), שהם רגישים יותר מצינורות מכפיל קונבנציונליים, ובכך מאפשרת לדרישות כוח הלייזר נמוכות יותר. קרן דלדול לSTED מיושמת ברציפות, והוא מכוון ל592 ננומטר, אשר יכתיב את הבחירה של צבעים זמינים עבור שתי הצבע STED. שילובי צבע בשימוש נפוץ בדרך כלל כוללים אחד להתרגש ידי 488 ננומטר (כגון Alexa פלואוריד 488, אורגון גרין, DyLights הירוק, או Chromeo 488) ואחד להתרגש ידי 458 ננומטר (כגון פסיפיק אורנג&#39; או אופק V500). וכך, בעוד זיהוי של שני הצבעים יהיה בטווח דומה (ושניהם נגישים על ידי לייזר דלדול), עירור יתרחש באורכי גל שונים. עם גלאי אור לייזר ומתכונן לבנים מתכונן, למקסם את האות תוך ביטול חפיפה ספקטרלית נעשה קל למדי. ככזה, יש לנו הצלחה טובה עם הקומבינאטיונים של צבעים זמינים באופן מסחרי, כגון פסיפיק אורנג&#39; וAlexa פלואוריד 488 (משמש כאן). הפרוטוקול שלנו מותאם כלפי ומתאר את ההערכה של תאי NK אנושיים כפי שמייצג את המוקד ההיסטורי של המעבדה שלנו. אנחנו במיוחד ניצול שורת תאי NK92 בדוגמא זו שכהיא אחד יש לנו ליישם באופן קבוע ב21,33 העבודה הניסויית שלנו.

<table><tbody><tr><td>#1.5 תלושי כיסוי</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטור עם קצה כותנה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S450941</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה פלקון (50 מ"ל)</td><td>VWR</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS) (500 מ"ל)</td><td>Atlantic Biologicals</td><td>S11050</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב Pacific Orange</td><td>Life Technologies</td><td>P31584</td><td></td></tr><tr><td>מגבי רקמות מעבדה</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>לק</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>תאי NK-92 ATCC</td><td></td><td>CRL-2407</td><td></td></tr><tr><td>פלואידין Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>מגיב נגד דהייה מוארך</td><td>Life Technologies</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>מטוהר נגד CD18</td><td>Biolegend</td><td>301202</td><td></td></tr><tr><td>מטוהר נגד NKp30</td><td>Biolegend</td><td>325202</td><td></td></tr><tr><td>מטוהר נגד פרפורין Biolegend</td><td></td><td>308102</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני ( 500 מ"ל)</td> <td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>ספונין מקליפת Quillaja</td><td>Sigma</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>עט Super PAP</td><td>Life Technologies</td><td>008899</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>Huygens תוכנת דה-קונבולוציה</td><td>SVI</td><td>צור קשר עם חברת</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED מיקרוסקופ</td><td>Leica </td><td>חברת</td><td></td> קשר מיקרוסיסטמס</tr></tbody></table>

ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (sted) nanoscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

תאי רוצח טבעיים יוצרים סינפסות מוסדרות היטב, מכוון היטב חיסוניים (IS) כדי lyse תאים בנגיף נגוע או סרטניים. ארגון מחדש אקטין דינמי הוא קריטי לתפקוד של תאי NK וההיווצרות של IS. ההדמיה של ה-F-אקטין בסינפסה ניצלה באופן מסורתי מיקרוסקופיה confocal, עם זאת לגבול ההשתברות של אור מגביל את הרזולוציה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כולל confocal, כ 200 ננומטר. ההתקדמות שחלה באחרונה בטכנולוגיית הדמיה אפשרה הפיתוח של הדמיה ברזולוציה סופר המוגבלת subdiffraction. על מנת להמחיש ארכיטקטורת ה-F-אקטין בהוא שאנחנו לשחזר את סינפסה ציטוטוקסיות תא NK על ידי עמידה תאי NK להפעלת קולטן על זכוכית. לאחר מכן, אנו חלבוני תמונה של עניין באמצעות מיקרוסקופ דלדול פליטה מאולץ בשני צבעים (STED). התוצאה היא &lt;80 ננומטר ברזולוציה בסינפסה. במסמך זה אנו מתארים את השלבים של הכנת מדגם ורכישת תמונות באמצעות col הכפולאו Nanoscopy STED לדמיין F-אקטין בNK IS. אנחנו גם להמחיש אופטימיזציה של רכישת מדגם באמצעות תוכנת SP8 יקה וSTED מגודרת זמן. לבסוף, אנו מנצלים תוכנת הויגנס לdeconvolution שלאחר העיבוד של תמונות.

ברור, מטרה העיקרית של הדמיה ברזולוציה הסופר תהיה שיפור לעומת מיקרוסקופיה confocal הקונבנציונלית. יחד עם זאת, יש כמה מכשולים נפוצים שעלולות להוביל להחלטה שאינה אופטימלית. אלה דורשים כי כל ניסוי להיות מותאם באופן אינדיבידואלי. בניסוי הנציג שלנו, אנחנו ההדמיה רשת ה-F-אקטין בתא NK מופעל על ידי הנוגדן מאוגד זכוכית. גורמים שכיחים ל( ותיקונים ל) חוסר ברזולוציה משופרת של STED מעל confocal הם כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת לדגימה (איור 1 א). זה עשוי להוביל לגרעיניות ואובדן של מידע פיקסל, כפי שמוצג על ידי רזולוציה נמוכה של סיבי ה-F-אקטין. שורה מוגברת או מיצוע מסגרת לעתים קרובות יכולה לתקן את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלבנת ו / או מעל הדגימה (איור 1b). זו עלולה להיגרם על ידי פיקסל להתעכב זמן ממושך, כתוצאה ממיצוע שורה המוגזמת. לחלופין, הוא עשוי להיות תוצאה של סריקת יתר של התמונה לפני הרכישה, ובכלל זה שימוש יתר שללייזר דלדול. התוצאה היא בדרך כלל בתמונות מעורפלות או מטושטשות. ניתן לתקן זאת על ידי סריקת השדה של ריבית בלבד מינימאלי לפני הרכישה או, אם אפשר, הגדלת מהירות סריקת לייזר. אם הבעיה נמשכת, ניתן לצמצם את כוח לייזר דלדול. </li></ol> על ידי השגת האיזון הנכון של זמן להתעכב פיקסל, כוח לייזר עירור, וכוח לייזר האזילה, תמונה עם רזולוציה משופרת ומידע מספיק יכול להיות שנוצר (איור 1 ג&#39;). רזולוציה ניתן לשפר עוד יותר על ידי השימוש בdeconvolution (1D איור). כאשר הרכישה היא מותאמת, deconvolution תשפר את הרזולוציה הן איכותית וכמותית ותת -100 הרזולוציה ננומטר צריכה להיות באופן שגרתי להשגה. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" /> איור 1. אופטימיזציה של רכישה ומלכודות נפוצות של ההדמיה STED. NK92 תאים הופעלו על זכוכית מצופה אנטי CD18 ו- NKp30 עבור 20 דקות לאחר מכן קבועות, permeabilized ומוכתמת עבור ה-F-אקטין עם Phalloidin אלקסה פלואוריד 488.) דוגמא של אובדן של מידע תמונה בשל. ב מתחת לדגימה) דוגמא לאובדן הרזולוציה בשל תנאי הלבנת / ג על הדגימה) ד מותאם) תנאים מותאמים להוביל לשיפור גדול יותר ברזולוציה עם deconvolution. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר.

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקול להדמיה על ידי Nanoscopy STED שני צבעים סינפסה החיסונית ציטוטוקסיות של תאי NK סכמו על זכוכית. שימוש בשיטה זו אנו מקבלים רזולוציה ננומטר תת -100 של חלבוני סינפסה ושלד התא.

ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדמיות של מבנים כגון F actin בסינפסה ליטית של תאי NK באמצעות מיקרוסקופיית TED. דבר זה מושג תחילה על ידי שחזור הסינפסה על זכוכית באמצעות נוגדן מפעיל. השלב השני של הפרוצדורה הוא קיבוע, חדירה (permeabilization) וצביעת התאים עבור המבנים הרלוונטיים.בשלב הבא, מצלמים את הפסחיות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקת לייזר, ולאחר מכן מחילים STED depletion להגברת רזולוציית התמונה. השלב הסופי הוא עיבוד התמונות באמצעות אלגוריתם דה-קונבולוציה. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות רזולוציה של פחות מ-100 ננומטר של מבנים תאיים, הודות ל-STED דו-צבעי ומיקרוסקופיה.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, כגון הקשר בין שלד התא לאקסוציטוזה. במקרה שלנו, אנו מעוניינים בהפרשה של ליזוזומים מיוחדים המכונים גרנולות ליטיות על ידי תאי NK (natural killer cells). באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו ביישCומה, כיוון שקיימים משתנים מרובים שניתן להתאימם בשימוש בלייזר לדילול TED.יישום שגוי של קרן הדילול (depletion beam) יוביל להחמרה במקום לשיפור ברזולוציה. כחלק מההכנה, חממו 30 milliliters של מצע RPMI עם 10% FCS ובנפרד 1 milliliter של BD CY effects cyop perm, שניהם ל-37 degrees Celsius. לאחר מכן, התחילו בתהליך ציפוי ה-cover slips בנוגדנים.קחו כיסית זכוכית (cover slip) מספר 1.5 ובעזרת עט PAP, ציירו ריבועים בגודל של מטבע (dime) על הכיסיות. הכינו ריבוע אחד עבור כל תנאי בדיקה.טענו כל עיגול ב-200 µL של נוגדן בריכוז של 5 µg/mL ב-PBS. להפעלה של תאי NK 92, השתמשו בנוגדי CD 18 ו-NK P 30. דגרו את כיסויי הזריקה הטעונים ב-37 °C למשך חצי שעה, ולאחר מכן שטפו אותם באמצעות טבילה ב-PBS בטמפרטורת החדר. המשיכו מיד להוספת התאים; עבור כל תנאי בדיקה, יש להכין 500,000 תאים לשימוש.שטפו את התאים ב-10 milliliters של המצע המחומם מראש ולאחר מכן השעיו אותם שוב באותו מצע מחומם. כאשר ריכוז התאים הוא 2.5 million תאים ל-milliliter והתאים נמצאים בתליה מלאה, העבירו 200 microliters לכל ריבוע נוגדן על לוחות הכיסוי. הדגירו את לוחות הכיסוי עם התאים ב-37 degrees Celsius עם 5%CO2; במקרה זה, 20 דקות הן זמן מספיק לקיטוב הגרנולות בתאי ה-NK. לאחר ההדגרה, שטפו בעדינות את לוחות הכיסוי ב-PBS בטמפרטורת החדר.יש להתחיל בהוספה של 1 µL של TRITTON X 100 ל-1 mL של תמיסת BD CY effects cyto perm חמימה. לאחר מכן, יש לבצע ערבוב במערבל וורטקס (vortex). יש להחיל 200 µL מתמיסה זו לכל ריבוע של תנאי ניסוי על לוחות הכיסוי.לאחר מכן, יש להניח את התאים בחושך בטמפרטורת החדר ולהמתין 10 דקות. עם סיום הדגירה, יש לשטוף בעדינות את כיסויי הזכוכית (cover slips) בבופר צביעה. לאחר מכן, יש לייבש את קצוות האזורים המוקפים באמצעות מקלון צמר גפן.לאחר מכן, הוסף 200 µL של הנוגדן הראשוני בבופר צביעה לאזורים המוקפים, והנח לזריקות הכיסוי להדגיר בחושך למשך חצי שעה. מספר נוגדנים שניים מתאימים לדימוי יציב כוללים את Alexa Fluor 488, Pacific orange ו-Horizon V500. כל אחד מהם פועל היטב בדילול של 1:200.לאחר שטיפת האינקובציה, העבירו את כיסורי הזכוכית למסלק הצביעה, לתוך הבאפר, וייבשו אותם בטביעות קלות. כפי שנעשה קודם לכן, הוסיפו 200 µL של הנוגדן המשני לכל ריבוע של תנאי ניסוי. לאחר מכן, השאירו אותם בחושך למשך 30 דקות נוספות.בשלב זה, ניתן להוסיף נוגדנים נוספים לאחר שטיפות נוספות. לדוגמה, ניתן להשתמש ב-Phin בדילול של 1:200 כדי לזהות f actin. עבור תוך קיבוע, העדיפו את prolong על פני vector shield, שאינו תואם ל-stead.אם נעשה שימוש בצביעת phin, יש להימנע משימוש ב-two two thio ethanol, אם כי שימוש ב-however הוא תקין. כעת יש להנח 10 עד 20 µL של תמיססת קיבוע (mounting medium) על גבי שקופית. כאשר זכוכית הכיסוי הפוכה, הורידו אותה בעדינות אל תוך התמיסה, תוך מניעת בועות אוויר. לאחר מכן, דגרו את השקופית למשך 24 שעות.עם זכוכית הכיסוי, החלקו אותה למשך היום הבא, אטמו את זכוכית הכיסוי בעזרת לק לציפורניים והמשיכו לדימוג. הפעילו את הלייזרים ואת התוכנה. על לייזר ה-depletion להגיע לטמפרטורת עבודה בעוצמה של 100% ולהיות מיושר.התמקדו בדגימה באמצעות העינית, ולאחר מכן עברו לתוכנה. סרקו את הערוץ הראשון, זה בעל אורך הגל הארוך ביותר. בשלב הרביעי, בצעו אופטימיזציה להספק הלייזר, למיקום קרן העירור ולטווח הגילוי.הימנעו מהגדרה שמעל 100. לאחר מכן, צלמו תמונה קונפוקלית ובדקו את הפיקסלים. רוויה, וממוצע של קווים ומסגרות ישפרו שניהם את רזולוציית הפיקסלים.המטרה היא להגיע לרזולוציה של פחות מ-30 ננומטרים לפיקסל. מידה מסוימת של רוויה מקובלת עבור ה-stead. לאחר מכן, החילו את קרן הדילול של ה-stead בהספק של 50% וצלמו תמונה.אם הרזולוציה משתפרת, ניתן להפעיל הספק גבוה יותר. בנוסף, כוונון של הספק לייזר העירור, ממוצע הקו או הגהבר (gain) עשויים אף הם לשפר את הרזולוציה. כדי להפחית את הרקע, יש להחיל חלון זמן (time gating) של 0.3 nanoseconds ולכוון כלפי מעלה.יש להעריך את הרזולוציה החדשה באמצעות חישוב של רוחב חצית המקסימום המלא (FWHM). לאחר השביעות רצון מהתוצאה, חזור על שלבים אלו עבור הערוץ השני, עד שכל הערוצים יכוילו. בדוק אם קיימת חפיפה ספקטרלית על ידי דימוג של בקרות עם צביעה בודדת בכל רצפי הסריקה.ניתן לתקן חפיפה קלה באמצעות הפרדה ספקטרלית (spectral unmixing) על ידי התוכנה, אך עדיף להימנע ממנה או לצמצמה למינימום. כעת, רכשו תמונות לצורך הדמיה כמותית. השגי כך לפחות 20 תמונות לכל תנאי, בהתאם לתנאים הניסיוניים.כדי לבצע דקונבולוציה לתמונות השמורות, פתחו את הקבצים בתוכנה המתאימה. בדקו את הפרמטרים של כל ערוץ, ובמיוחד את ספקטרי העירור והפליטה, את פליטת ה-stead depletion ואת כיוון הדמיה. לאחר מכן, הפעילו את חישובי הדקונבולוציה של התוכנה.הגדרות ברירת המחדל מספיקות בדרך כלל, אך יחס signal to noise ישתנה בין כוחות הרצפה, ולכן יש להגדיר פרמטר זה ידנית עבור הניסוי. ישנם מספר끔 מקורות שגיאה נפוצים שעלולים להוביל לרזולוציה תת-אופטימלית עם stead. אחד מהם הוא under sampling.דבר זה מוביל למראה גרגירי ולאובדן מידע בפיקסלים, כפי שניתן לראות בסיבי f actin אלו. הגדלת מיצוע השורות או הפריימים פותרת לעיתים קרובות בעיה זו. בעיה נוספת היא הבהרה (bleaching) או דגימת-יתר הנגרמת מחשיפה ממושכת של הפיקסלים.זמן שהייה, הנובע בדרך כלל מממוצע קווים מוגבר מדי במהלך הסריקה לפני רכישת התמונה, עשוי להיות אף הוא הגורם לבעיה וניתן לתקנו באמצעות ביצוע סריקה קצרה יותר לפני רכישת התמונות או על ידי שימוש במהירות סריקה גבוהה יותר. הפחתת הספק הלייזר יכולה גם היא לסייע בתקינות התהליך. איכות התמונה תשתפר באופן דרמטי.דה-קונבולוציה (Deconvolution) תשפר את התמונה עוד יותר, הן מבחינה כמותית והן מבחינה איכותית. רזולוציה של פחות מ-100 nanometer אמורה להתקבל באופן שגרתי בעת ביצוע הליך זה.חשוב לזכור לבצע כיול של קרן הלייזר לפני כל ניסוי ובערך אחת לשעה לאחר מכן, בהתאם לנוהל זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אנליזה כמותית, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לקולוקליזציה, למיקום תת-תאי ולאינטראקציות מולקולריות.

visualization-immunological-synapse-dual-color-time-gated-stimulated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Neisseria meningitidis (ננומטר), שלילי גרם אדם ספציפי פתוגן הנשימה, ניתן לאגד את האדם α-actinin. כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיה של colocalisation של החיידק עם תאיים α-actinin לאחר כניסת חיידקים לתוך כלי הדם לתאי המוח האנושי האנדותל (HBMECs).

Visualisation וכימות של אינטראקציות תאיים של Neisseria meningitidis ואת האדם α-actinin על ידי הדמיה confocal

פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה.

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית היווצרות הסינפסה החיסונית בתאי הרג טבעי (NK) על שכבה דו-שכבתית שומנית נתמכת (SLB). ה-SLB מסומן תחילה עם ליגנד קולטן של תא NK המתויג כפלואורופור, ולאחר מכן דגירה עם תאי NK. לאחר מכן, התאים מוכתמים עבור אקטין פולימרי גרגירים ליטיים חיוביים perforin. גישה זו מאפשרת הדמיה של היווצרות סינפסות באמצעות מיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED).

הדמיה ברזולוציית על של היווצרות סינפסה אימונולוגית של תאי NK על דו-שכבה ליפידית נתמכת

סרטון זה מדגים הדמיה של תאים חיים של טופולוגיית סינפסות אימונולוגיות, וחוקר את יחסי הגומלין בין לימפוציטים מסוג T לבין תאי אפיתל הנושאים אנטיגנים פלואורסצנטיים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה תזוזה של ציטופלסמה אדומה וטבעות קרום צהובות בתאי אנדותל, דבר המצביע על היווצרות סינפסות אימונולוגיות.

הערכת טופולוגיית סינפסה אימונולוגית באמצעות דימות תאים חיים

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

אנו מתארים כאן שילוב של טכניקת דו-שכבת השומנים הנתמכת בזכוכית ליצירת סינפסות אימונולוגיות עם טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מיקרוסקופיה של דלדול פליטה מגורה (STED). מטרת פרוטוקול זה היא לספק למשתמשים את ההוראות הדרושות לביצוע מוצלח של שתי טכניקות אלה.

הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

חסינות אדפטיבית נשלטת על ידי 'סינפסות אימונולוגיות' דינמיות הנוצרות בין תאי T לתאים המציגים אנטיגן. פרוטוקול זה מתאר שיטות לחקירת תאי אנדותל הן כ-APCs פיזיולוגיים לא נחקרים והן כסוג חדש של 'מודל APC תאי מישורי'.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

אנו מציגים פרוטוקול להצפנה באמצעות מיקרוסקופ STED בו-זמנית תמונה אקטין מבנים, microtubules של microtubule פלוס-end מחייב חלבונים בתאי B שהופצו על coverslips מצופה נוגדנים לקולטן B-cell, מודל עבור השלב הראשוני היווצרות מערכת החיסון סינפסה.

להמחיש את אקטין ואת Microtubule Cytoskeletons על הסינפסה B-cell המערכת החיסונית באמצעות מיקרוסקופ דלדול (STED) פליטה מאולצת

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לתת את התנאים ניסיוני אופטימלית של הכנת הדוגמא ייבוא תמונות ושיחזור על מנת לבצע צבע כפול 2D תמונות dSTORM של microtubules חוטים ביניים בתאים...

הדמיה חוטים ביניים Microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי

בפרוטוקול זה מתמונות הן את המערך האימונוולוגי והן את תנועת הפרשה המקוטב הבאה לעבר הסינפולוגית החיסונית. שערי מעלה הסלולר נוצרו בין תא הסופר-אנטיגן פעמו של ראג'י (מתנהג כמו תא אנטיגן המציג) ו שיבוט ג'ורקאט (מתנהג כמו מסייע לימפוציטים T לימפופן).

הדמיה של הסינפסה החיסונית של האדם

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח מורפומטרי של צמתים עצביים-שריריים על ידי מיקרוסקופיה משולבת של קונפוקל ו-STED המשמשת לכימות שינויים פתולוגיים במודלים של עכברים של SMA ו-CMS הקשורים ל-ColQ.

אפיון צמתים עצביים-שריריים בעכברים על ידי מיקרוסקופיה משולבת קונפוקלית וסופר-רזולוציה

חקור הדמיה של סינפסה ציטוטוקסית בתאי NK באמצעות מיקרוסקופיית STED דו-צבעית. השיטה מספקת רזולוציה תת-ננומטרית של מבני חלבון ושלד תאי לחקר אינטראקציות חיסוניות.

ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy

גלה סרטונים נוספים