ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy
24 במרץ 2014
כאן אנו מדגימים את הפרוטוקול להדמיה על ידי Nanoscopy STED שני צבעים סינפסה החיסונית ציטוטוקסיות של תאי NK סכמו על זכוכית. שימוש בשיטה זו אנו מקבלים רזולוציה ננומטר תת -100 של חלבוני סינפסה ושלד התא.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין מבנים כגון F actin בסינפסה הליטית של תא NK באמצעות מיקרוסקופ TED. זה מושג על ידי סיכום הסינפסה על זכוכית באמצעות נוגדן מפעיל. השלב השני של ההליך הוא תיקון סלסול וצביעה של התאים למבנים מעניינים.
לאחר מכן, השקופיות מצולמות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת לייזר, ואחריה יישום של דלדול במקום לרזולוציית תמונה מוגברת. השלב האחרון הוא עיבוד התמונות באמצעות אלגוריתם דה-קונבולוציה. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות רזולוציה של פחות מ-100 ננומטר של מבנים תאיים הודות למיקום צבע כפול ואנדוסקופיה.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, כגון קשר בין השלד הציטולוגי לאקסוציטוזיס. במקרה שלנו, אנו מעוניינים בהפרשת ליזוזומים מיוחדים הנקראים גרגירים ליטיים על ידי תאי הרג טבעיים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שישנם מספר משתנים שניתן להתאים ביישום לייזר הדלדול של TED.
יישום לא הולם של קרן הדלדול יביא להחמרה במקום שיפור ברזולוציה בהכנה, חם 30 מיליליטר של מדיה RPMI עם 10% FCS ובנפרד. מיליליטר אחד של BD CY משפיע על סלסול cyop שניהם עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן התחל בתהליך ציפוי החלקות הכיסוי בנוגדנים.
קח את פתקי הכיסוי מספר 1.5 והשתמש בעט PAP. צור ריבועים בגודל מטבע על החלקות הכיסוי. הכן ריבוע אחד לכל מצב שנבדק.
טען כל מעגל ב-200 מיקרוליטר נוגדנים בחמישה מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS. להפעלת תאי NK 92, השתמש בנוגדנים נגד CD 18 ואנטי NK P 30. דגרו את פתקי הכיסוי העמוסים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חצי שעה, ולאחר מכן שטפו אותם בטבילה בטמפרטורת החדר PBS המשיכו מיד בהוספת התאים לכל מצב שנבדק, 500,000 תאים חייבים להיות מוכנים לשימוש.
שטפו את התאים ב -10 מיליליטר של המדיה החמה מראש ואז השעו אותם באותה מדיה מחוממת. ב-2.5 מיליון תאים למיליליטר עם התאים בתרחיף מלא, שפכו 200 מיקרוליטר לכל ריבוע נוגדנים על הכיסוי החלקות דוגרות על החלקות הכיסוי עם תאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 במקרה זה. 20 דקות מספיקות כדי לקטב את הגרגירים בתאי ה- NK לאחר שטיפת הדגירה, הכיסוי מחליק בעדינות ב- PBS בטמפרטורת החדר.
התחל בהוספת מיקרוליטר של TRITTON X 100 למיליליטר של תמיסת ציטו סלסול חמה של אפקטים BD CY. ואז מערבולת. מרחו 200 מיקרוליטר של תמיסה זו על כל ריבוע מצב על החלקות הכיסוי.
לאחר מכן הניחו את התאים בחושך בטמפרטורת החדר והמתינו 10 דקות. בסיום הדגירה, שטפו בעדינות את החלקות הכיסוי במאגר מכתים. לאחר מכן יבש את שולי האזורים המוקפים בעזרת צמר גפן.
לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של הנוגדן העיקרי במאגר מכתים לאזורים המוקפים, ותן להחלקות הכיסוי לדגור בחושך למשך חצי שעה. כמה נוגדנים משניים טובים להדמיה במקום כוללים Alexa floor 4 88 Pacific orange ו-Horizon V 500. כל אחד מאלה עובד היטב בדילול של 1 עד 200.
לאחר שטיפת הדגירה, הכיסוי מחליק פנימה, חוצץ ומייבש אותם. כמו קודם, יש למרוח 200 מיקרוליטר של הנוגדן המשני על כל ריבוע מצב. לאחר מכן הניחו להם לשבת בחושך למשך 30 דקות נוספות.
בשלב זה, ניתן להוסיף נוגדנים נוספים לאחר שטיפות נוספות. לדוגמה, ניתן ליישם את Phin ב-1 עד 200 כדי לזהות f actin. עבור מדיום הרכבה, בחר להאריך מעל מגן וקטור, שאינו תואם למקום.
אם נעשה שימוש בכתמי פין, הימנע משימוש בשני אתנול שני תיו, בעוד שזה בסדר, כעת החל 10 עד 20 מיקרוליטר של מדיום הרכבה על מגלשה. כשהחלקת הכיסוי הפוכה, הורד אותו בעדינות לתוך המדיום, הימנע מבועות אוויר. לאחר מכן דגרו על המגלשה למשך 24 שעות.
עם הכיסוי, החליקו למחרת, אטמו את החלקת הכיסוי עם לק והמשיכו בהדמיה. הפעל את הלייזרים והתוכנה. לייזר הדלדול הקבוע צריך להתחמם בעוצמה של 100% ולהיות מיושר.
באמצעות העינית, התמקד בדגימה, ולאחר מכן פנה לתוכנה. סרוק את הערוץ הראשון, זה עם אורך הגל הארוך ביותר. קומה רביעית, ייעל את עוצמת הלייזר, מיקום קרן העירור וטווח הגלאי.
הימנע מהגדרה מעל 100. לאחר מכן, צלמו תמונה קונפוקלית ובדקו אם יש פיקסלים. רוויה, קו וממוצע פריימים ישפרו שניהם את רזולוציית הפיקסלים.
המטרה היא להיות מתחת ל-30 ננומטר לפיקסל. רוויה מסוימת מקובלת על יציבות. לאחר מכן, החל את קרן הדלדול הקבועה בעוצמה של 50% וצלם תמונה.
אם הרזולוציה משתפרת, ניתן להפעיל יותר כוח. יתר על כן, התאמת עוצמת לייזר העירור או ממוצע הקו או הרווח יכולה גם לשפר את הרזולוציה. כדי להקטין את הרקע יש להחיל 0.3 ננו-שניות של שער זמן ולהתאים כלפי מעלה.
יש להעריך את הרזולוציה החדשה באמצעות חישוב מקסימלי של חצי רוחב מלא. לאחר שתהיה מרוצה, חזור על שלבים אלה עם הערוץ השני כאשר כל הערוצים מותאמים. בדוק אם יש חפיפה ספקטרלית על ידי הדמיית בקרות כתם בודד עם כל רצפי הסריקה.
ניתן לתקן חפיפה קלה באמצעות ביטול ערבוב ספקטרלי על ידי התוכנה, אך עדיף להימנע ממנה או לשמור עליה למינימום. כעת, רכוש תמונות להדמיה כמותית. השג לפחות 20 תמונות לכל מצב בהתאם לתנאי הניסוי.
כדי להאציל את התמונות השמורות, פתח את הקבצים בתוכנה המתאימה. בדוק את הפרמטרים של כל ערוץ, במיוחד ספקטרום העירור והכניסה, פליטת הדלדול הקבוע וכיוון ההדמיה. לאחר מכן החל את חישובי הדה-קונבולוציה של התוכנה.
הגדרות ברירת המחדל מספיקות בדרך כלל, אך האות לרעש ישתנה בין כוח הרצפה, כך שיש להגדיר את הפרמטר באופן ידני עבור הניסוי. ישנן כמה מלכודות נפוצות שעלולות להוביל לרזולוציה לא אופטימלית עם במקום. אחד נמצא תחת דגימה.
זה מוביל לגרגיריות ולאובדן מידע פיקסלים כמו בחוטי f אקטין אלה. הגדלת ממוצע הקו או המסגרת פותרת לעתים קרובות בעיה זו. בעיה נוספת היא הלבנה או דגימת יתר הנגרמת על ידי פיקסל ארוך.
זמן השהייה בדרך כלל עקב ממוצע קו מוגזם בסריקה לפני רכישת התמונה עשוי גם הוא להיות האשם וניתן לתקן אותו באמצעות סריקה קטנה יותר לפני רכישת תמונות או באמצעות מהירות סריקה גבוהה יותר. הפחתת עוצמת הלייזר יכולה גם לעזור בכל מה שעובד. התמונה תשתפר באופן דרמטי.
דה-קונבולוציה תשפר עוד יותר את התמונה. הן מבחינה כמותית והן מבחינה איכותית. יש להשיג רזולוציה של פחות מ-100 ננומטר באופן שגרתי בזמן ניסיון הליך זה.
חשוב לזכור לבצע יישור אלומה במקום לפני כל ניסוי וכפעם בשעה לאחר מכן לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח כמותי על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לקולוקליזציה, לוקליזציה תת-תאית ואינטראקציות מולקולריות.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לדימות של הסינפסה החסונית הציטוטוקסית של תאי NK באמצעות ננוסקופיית STED בשני צבעים. השיטה מאפשרת רזולוציה של פחות מ-100 nm עבור חלבוני הסינפסה והשלד התאי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- תאי NK (Natural killer) ממלאים תפקיד מכריע בתגובות חיסוניות.
- הבנת הסינפסה החיסונית הציטוטוקסית חיונית להשגת תובנות לגבי אינטראקציות בין תאים.
- מיקרוסקופיית STED מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מבנים תאיים.
- קיימים אתגרים באופטימיזציה של פרמטרי ההדמיה להשגת התוצאות הטובות ביותר.
מטרת המחקר
- להדמיה של F actin ומבנים אחרים בסינפסה ליטית של תאי NK.
- לשיפור ההבנה של הקשר בין השלד התאי לאקסוציטוזה.
- לסבסב פרוטוקול מפורט עבור חוקרים שאינם מנוסים במיקרוסקופיית STED.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שחזור של הסינפסה החיסונית על זכוכית באמצעות נוגדנים מאקטיבים.
- קיבוע, פרמיליזציה וצביעה של תאי NK.
- דימוי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקת לייזר ולאחריה STED.
- יישום של אלגוריתמי דקונבולוציה (deconvolution) לעיבוד תמונה.
תוצאות עיקריות
- השגת רזולוציה של פחות מ-100 nm של מבנים תאיים.
- זיהוי אינטראקציות מרכזיות בין השלד התאי להפרשת גרנולות ליטיות.
- הדגמת היעילות של דימוי STED בשני צבעים.
- מתן תובנות לגבי מכשולים פוטנציאליים ואסטרטגיות אופטימיזציה.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את ההבנה של תפקוד תאי NK.
- מיקרוסקופיית STED היא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות תאיות.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מתודולוגיה זו כדי לבחון תהליכים תאיים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ננוסקופיית STED דו-צבעית עם שער זמן (time-gated) מאפשרת ויזואליזציה של ארכיטקטורת הסינפסה האימונולוגית ברזולוציה של פחות מ-100 nm, ובכך היא נותנת מענה ישיר למגבלות הרזולוציה של דימוי פלואורסצנציה קונבנציונלי במחקר תאי מערכת החיסון. יכולת זו משפרת את ההבנה המכניסטית של דינמיקת השלד התאי ומיקום חלבונים בסינפסה של תאי NK, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בשלבים מוקדמים של גילוי בתחום האימונו-אונקולוגיה. שיטה זו מאפשרת לצוואים לחקור את הקשרים בין השלד התאי לתהליכי אקסוציטוזה, קשרים שהם קריטיים לתיקוף מטרות (target validation) ולהפחתת סיכונים פונקציונליים בתוכניות של תאי אפקטור אימונולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ברזולוציה גבוהה של ארגון השלד התאי והחלבונים בסינפסה של תאי NK.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי הבהרת הקשרים בין אקטין לאקסוציטוזה בתפקודי תאי effector חיסוניים.
- משפר את הביטחון החזוי לבחירת מטרות בתהליכי פיתוח של אימונו-אונקולוגיה וטיפולים תאיים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מסייע בהכנה של מודלים מאומתים של סינפס חיסונית עבור תהליכי דימיון כמותיים המשכיים.
- מאפשר מדידה כמותית הדירה של קולוקליזציה של חלבונים ומיקום תת-תאי.
- תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות ובשימוש חוזר בפלטפורמה עבור סריקה תפקודית של תאי מערכת החיסון.
מחקר תרגומי ופרה-קלני
- מתאים את פלטי ההדמיה למנגנוני תאי חיסון הרלוונטיים למחלה לצורך חקירת ביומרקרים תרגומיים.
- מספק רציפות ממחקרי מנגנונים בשלב הגילוי למודלים פרה-קליניים של מודולציה חיסונית.
- מפחית סיכונים בקבלת החלטות על קידום הפיתוח על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית של שלמות הסינפסה החיסונית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטת דימות זו משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ותומכת בבדיקת היפותזות, תיקוף מטרות ואנליטיקה כמותית במחקר תאי מערכת החיסון.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת ניתוח מונחה-השערה של דינמיקת השלד התאי וחלבונים בסינפסה האימונולוגית.
- סריקה: מספקת פלטי דימוג כמותיים וניתנים לשחזור עבור בדיקות תפקודיות של תאי מערכת החיסון.
- אנליטיקה: מספקת מדידות ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח השוואתי של לוקליזציה וקו-לוקליזציה של חלבונים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין גילוי מכניסטי למחקרי מודיולציה אימונולוגית פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימוג ניתנת לשימוש חוזר למגוון מחקרים על תאי מערכת החיסון ועל הסינפסה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות של תאי מערכת החיסון.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה של דימוג ברזולוציה גבוהה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות המשך (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי פיתוח של אימונו-אונקולוגיה.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של תוכניות טיפוליות מבוססות תאי מערכת החיסון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקדמת ובביולוגיה של תאי מערכת החיסון.
- מחייב גישה למכשור STED דו-צבעי ותוכנת דה-קונבולוציה (deconvolution).
- הדורש סטנדרטיזציה קפדנית של פרמטרי הדמיה ובקרות בין צוותים שונים.
- התאמה לסוגים שונים של תאי מערכת החיסון ומודלים של סינפסות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- הרזולוציה והפלט הכמותי תלויים בכיול מדויק, בחלוקה לקבוצות (gating) ובעיבוד תמונות.
