גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על ¹⁵ N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח באופן השוואתי את ההרכב של קומפלקסים של MultiPro בקרומי חבל התאל בתנאים שונים. זה מושג על ידי בידוד ראשון של ממברנות התאל מתאי למונה שנחשפו לתנאים אנאירוביים. לאחר מכן, ממברנות חבל הטבור מסיסות ומפורקות בשיפוע צפיפות סוכרוז.

ואז מערבבים נפחים שווים של השברים הרצויים ומופרדים בדף SDS. לבסוף, הרצועות המוכתמות בקומאסי מתעכלות עם טריפסין. בסופו של דבר, הדגימות מנותחות על ידי ספקטרומטריית מסה כמותית כדי לצפות בשינויים בשפע החלבון בין השברים הנחקרים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מחקרים פרוטאומיים כמותיים המשווים כמות מוגדרת של חלבון הוא שבגישה שלנו, נפחים שווים של דגימות מקוטעות משולבים ומנותחים. זה מאפשר לחקור את התנהגות הנדידה של חלבונים בתוך השיפוע, ויתרה מכך, לנתח את ההרכב של קומפלקסים שונים שאינם חלבונים בקרום הקבוצה השלישית. ביחס לזנים המיושמים לאחר גידול כלמידומונס לרסן זנים עמידים, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בתמיסות מלאי של שני סוכרוז מולארי, 10% בטא DM במים ו-0.5 pH טרי מולארי 8.0.

כדי להכין את הפתרונות הבאים עבור שיפועי צפיפות סוכרוז להגדרת השיפועים באמצעות צינורות צנטריפוגה בגודל 14 על 89 מילימטר, התחל במזיגה איטית של מיליליטר אחד של תמיסה מולרית של 1.3, ואחריה מיליליטר אחד של תמיסה מולרית של 1.0. לאחר מכן שפכו שני מיליליטר כל אחד מהתמיסות המולאריות 0.85, 0.7, 0.65, ולבסוף, את התמיסות המולאריות 0.4. אחסן את השיפועים למשך הלילה בחדר הקירור כדי לגרום לתנאים אנאירוביים.

בתרביות כלמידומונס, הכניסו פיפטת זכוכית לתוך צלוחיות תרבית ומבעבעים עם ארגון למשך ארבע שעות תוך ערבוב מתמשך והארה לבידוד ממברנות חבל הטאל. לאחר הדגירה, התחל בהטלת התאים במשך חמש דקות בכוח הכבידה פי 2, פי 500 וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השהה את כדורי התא ב-30 מיליליטר של H מאגר אחד.

חזור על הצנטריפוגה ושוב, החייאה. השעו את התאים במאגר H אחד כדי לשבור את התאים, והעבירו אותם דרך נבולייזר עם לחץ חנקן של 1,500 פסקל. וודאו שהמרחק בין כדור הקרמיקה למתכת קטן מספיק כדי שהתאים יישברו.

לאחר מכן סובב את התאים במשך שבע דקות בכוח הכבידה פי 2, 500 וארבע מעלות צלזיוס. הסופרנטנט צריך להיות בצבע ירוק בהיר. אם שבירת התאים הצליחה, יש להחיות את התאים ב-50 מיליליטר של H 2 buffer ולגלול אותם למשך 10 דקות בכוח הכבידה פי 32, 800 וארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, לאחר ש-Resus משהה את התאים ב-10 מיליליטר של H שלושה buffer, השתמש בקדר כדי להומוגניזציה של החך המושהה. לאחר מכן להכין שיפועי צפיפות סוכרוז של חבל הטאל. התחל עם 12 מיליליטר תאים במאגר H שלוש.

לאחר מכן יוצקים לאט שכבה של 12 מיליליטר של מאגר H four ומסיימים עם 12 מיליליטר של מאגר H five. השתמש ב-H חמש כדי לאזן את הרוטור ולצנטריפוגה את השיפועים למשך שעה אחת בכוח הכבידה פי 70, 700. הסר את רצועות ה-TH מהשיפועים והשתמש בנפח מתאים של מאגר H 6 כדי לדלל אותם.

סובב תאים במהירות של פי 37, 900 מכוח הכבידה למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אם הגלולה אינה הדוקה, הוסף עוד מאגר H six לשלב הצנטריפוגה. ואז החייאה.

השעו את מיתרי ה-thal בנפח קטן של מאגר H 6 כדי לטעון שיפוע צפיפות סוכרוז של מערכת צילום. ראשית, חשב את כמויות מיתרי התאל, בטא DM ו-H 6 מאגר הדרושים לכל שיפוע. בהתאם להנחיות אלה, כל שיפוע יכיל 0.8 מיליגרם למיליליטר כלורופיל ב-0.9% בטא DM ו-H six Buffer יביא את הנפח הסופי ל-700 מיקרוליטר.

כדי להמיס את התיז, הכינו Eloqua נפרד עם Thylakoids beta DM ו-H six buffer לכל שיפוע. דגרו את הדגימות על קרח למשך 20 דקות והפכו כל כמה דקות לערבוב. לאחר צנטריפוגה של הדגימות בכוח הכבידה פי 14, 000 למשך 10 דקות וארבע מעלות צלזיוס.

הגלולה צריכה להיות קטנה ולבנבנה, והסופרנטנט יהיה ירוק כהה. העמיסו את הסופרנטנט על איזון השיפועים עם מאגר H 6 וצנטריפוגה אולטרה ב-134, פי 470 מכוח הכבידה למשך 14 שעות וארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, צלם תמונות של השיפועים ואז כדי לשבור.

השתמש במחט כדי לנקב חור בתחתית הצינור ולאסוף שברים בצינורות של 500 מיקרוליטר. או תהליך צלחת 96 באר. הדגימות לדף SDS בעיכול ג'ל וספקטרומטריית מסה על פי פרוטוקול הטקסט כפי שמוצג כאן, תוך שימוש בתוצאות מניתוח דם חיסוני שבר שש מסוג בר ושבר 13 מדלתא PS 1.

שברי שיא של A ו-R אחד נבחרו לניתוח של רכיבים סופר מורכבים של זרימת אלקטרונים מחזורית באיור זה. יחסי חלבון יחסיים המתוארים כסוג בר על פני דלתא PS אחד 14 N על 15 N עבור מספר PS ליבה אחת וחלבוני קצירת אור של PS אחד כמו גם עבור חלבונים שהוקצו עם קומפלקס העל של זרימת האלקטרונים המחזורית מוצגים ההבדלים בשפע של NR אחד ו-CAS בשבר 6 ו-13 של סוג הבר ודלתא PS אחד מרמזים על כך שהם מרכיבים חדשים של קומפלקס זה המוצגים להלן התוצאות להשוואה כמותית של זרימת אלקטרונים מחזורית זו בין הסוג הפראי לזן נוקאאוט אחד PG L. מעניין לציין ש-HCF 1 36, ציטוכרום B 6, ציטוכרום B 6 F תת-יחידה 4 ו-PET C נראים מועשרים בסוג הבר בעוד ש-FTSH 2, ציטוכרום F ו-PET O מועשרים ב-PG L 1.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה כיצד להשוות את הרכב מתחמי MultiPro בממברנות נוזליות בתנאים שונים. זכור כי להכנה מוצלחת של הממברנות הנוזליות ובידוד זרימת האלקטרונים המחזורית, שיבוש תאים סופר מורכב, קדרות תאים והפיכת הממברנות הנוזליות לשלבים הקריטיים. יתר על כן, שיפועי צפיפות הסוכרוז צריכים להיות צנטריפוגה למשך 12 שעות לפחות כדי להשיג הפרדה מלאה של קומפלקסים פוטוסינתטיים.