Name: גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על 15 N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: חקור ניתוח השוואתי של מכלולי MultiPro בממברנות תלקואידים בתנאי אנאירוביים שונים. השיטה משתמשת בכרומטוגרפיה סוכרוז וספקטרומטריית מסה כמותית לזיהוי שינויים בשפע חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MH מודה תמיכה מ&quot; דויטשה Forschungsgemeinschaft &quot;(DFG). מחבר תרומות: MH תוכנן מחקר; KT, JS ו MT ביצע מחקר וניתחו את הנתונים; KT וMH כתב העיתון.

המחברים מצהירים שום אינטרס כלכלי מתחרה.

מחקרי proteomic כמותיים שונים באמצעות תיוג איזוטופ יציב כבר פורסמו בשנים האחרונות. בניסויים אלה בדרך כלל שני מדגמים שונים בהשוואה, מתוכם מדגם אחד מתויג עם איזוטופ יציב. לאחר מכן חלבונים או פפטידים משני המדגמים משולבים ביחס שווה ומעובד יחד נוסף 48. מחקרים כאלה לעתים קרובות מתכוונים להשוות תאים מוגדרים מבודדים סלולריים (למשל כלורופלסטים, מיטוכונדריה, או קרומי thylakoid) נחשפו לתנאי עקה שונים 26,34,49 לחקור למעלה או למטה רגולציה של חלבונים מסוימים. הגיש...

תהליכי פוטוסינתזה בקרומי thylakoid של צמחים ואצות יכולים לתפקד במצב ליניארי והמחזורי. במהלך זרימת אלקטרונים ליניארי photosystem (LEF) אני (PSI), photosystem השנייה (PSII) ו 6 / ו ב ציטוכרום סופו של דבר להעביר אלקטרונים ממים לNADP 1 +, מוביל את הדור של NADPH ו-ATP 2. בניגוד לכך, זרימה מחזורית אלקטרונים (CEF), אשר ידועה להיות מושרה בתנאים סביבתיים מגוונים כמו תנאי מדינה 2 3 ואנאירוביים 4, תוצאות מחדש הירידה של PSI חמצון על ידי הזרקה של אלקטרונים בחזרה לשרשרת העברת האלקטרונים. תהליך זה יכול להתרחש גם בצד של סטרומה ב ציטוכרום המורכב 6 / F 1 או בבריכת plastoquinone 5 ומייצר ATP, אך לא NADPH 2. מטרת הפרוטוקול המובא היא להדגים ספקטרומטריית מסה מ &#39;(MS) המבוססethod לניתוח ההשוואתי, כמותי של מתחמי multiprotein בקרומי thylakoid של Chlamydomonas reinhardtii לקבל תובנות לתוך הרכב של מתחמים אלה בתנאים שונים (שהודגם על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית). גישה זו יושמה בפרסום על ידי Terashima et al. ב -2012 מראה 2 רגולציה + תלויה Ca של CEF ב C. reinhardtii מתווך על ידי מורכב multiprotein כוללים החלבונים CAS, ANR1, וPGRL1 6. ההליך יהיה להיות מוסבר על ידי ניתוח יחסית הרכב CEF-supercomplex בשני זנים שונים מבחינה גנטית, ובכך מנצל את תיוג אחד משני זנים עם חנקן כבד (15 N). בקצרה, הפרוטוקול כולל בין שאר הכנת קרומי thylakoid, ואחריו solubilization חומרי ניקוי וחלוקה של מתחמי פוטוסינתזה בשיפוע צפיפות סוכרוז. לאחר חלוקה של השיפוע, נבחר fractions של שני זנים מעורבבים המבוסס על נפח שווה, מופרד על ידי-SDS ואחרי עיכול וניתוח MS כמותיים שלאחר מכן בג&#39;ל. כפי שהוזכר לעיל, CEF הוא מושרה בתנאים סביבתיים שונים ופרסום מהשינה 2010 מדגים את הבידוד של CEF-supercomplex פונקציונלי ממדינה 2 תאים נעולים של ג reinhardtii 7, אשר בוצע על ידי הפרדת קרומי thylakoid solubilized בשיפוע צפיפות סוכרוז במהלך ultracentrifugation. שונה מאיוואי et al. 7, הפרוטוקול המובא מתאר את הבידוד של CEF-supercomplex מג אנאירובי גדל תרבויות reinhardtii על ידי ביצוע הליך חלופי. זה כולל שינויים בפרוטוקול בידוד thylakoid כמו גם הבדלים הנוגעים לצעד solubilization והפרדה של קומפלקסי חלבונים על ידי ultracentrifugation. בפרוטוקול הנוכחי, קרומי thylakoidהם מבודדים על ידי יישום ההליך בהוצאת Chua וBennoun 8, ואילו המאגרים המשמשים להכנת thylakoid ידי איוואי et al. הכיל 25 Mes מ&quot;מ, 0.33 M סוכרוז, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 1.5 מ&quot;מ NaCl (pH 6.5) כפי שתואר 9. Solubilization בוצע עם חומר ניקוי 0.7-0.8% (n-tridecyl-β-D-maltoside) ל30 דקות על קרח במקרה של איוי ועמיתים לעבודה, ואילו בשיטת solubilization המתוארת כאן מסתמכת על השימוש בחומרי ניקוי 0.9% (n -Dodecyl-β-D-maltoside (β-DM)) והיא מבוצעת רק 20 דקות על קרח. שני הקבוצות השתמשו 0.8 מ&quot;ג כלורופיל לכל מיליליטר לsolubilization עם חומר הניקוי המתאים. להפרדה של קומפלקסים פוטוסינתטיים מקרומי thylakoid solubilized איוואי et al. מיושם ריכוזי סוכרוז בין 0.1-1.3 M, ואילו מחברים של פרוטוקול זה משמשים ריכוזים הנעים .4-1.3 מ &#39;ההבדל האחרון היא מהירות צנטריפוגה, שהוא נמוך יותר בהשוואה לeaפרסום rlier. Solubilization של קרומי thylakoid עם חומרי ניקוי nonionic אחרי חלוקה צפיפות סוכרוז שיפוע כבר הותקן במספר רב של מחקרים החל 1980s עד היום 7, 9-14 וגם היישום של תיוג חילוף חומרים של חלבונים הוא שיטה נפוצה בתחום פרוטאומיקה. הגישה המתוארת חלה תיוג 15 N חילוף חומרים לאחד משני הזנים בהשוואה ידי culturing אותו בנוכחותם של חנקן כבד כמקור חנקן יחיד בצורה של 15 N NH 4 Cl, אשר שולב כל חומצות אמינו שמובילות למסה משמרת בהתאם לרצף חומצות אמינו של הפפטיד. בעת ניתוח תערובת של 14 N ו15 N בתוך אחד MS לרוץ, משמרת מסה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את מקורם המדגם עבור כל הפפטיד ופפטיד היחסי ניתן לחשב שכיחותם מייצגת שכיחותם היחסית עבור להתכתבing חלבון 15. מחקרי פרוטאומיקה כמותיים רבים על ג reinhardtii זמין, אשר משווה כמות מוגדרת של חלבון כדי לנתח שינויים בproteome בין תנאי ניסוי (למשל שינויים בproteome בשל תזונתי 16-19 או אור לחץ 20,21). בהשוואה למחקרים אלה, בגישה שהוצגה כיום כמויות שווה של דגימות משולבות ונותחו. התקנה זו מאפשרת ללמוד את התנהגות הנדידה של חלבונים בתוך השיפוע ויותר מכך כדי לנתח את ההרכב של מתחמים שונים ביחס לזנים הנחקרים. שיטה זו להיות מוסברת על ידי בעיקר להתרכז בשלושה חלבונים: המועמד הראשון הוא CAS חלבון חיישן סידן מקומי הכלורופלסט, אשר הוצג להיות מעורבים בצילום ההסתגלות בג reinhardtii 22. סידן נחשב אות חשובהing יון למסלולים אשר מופעלים כתוצאה מלחצים ביוטיים ואביוטי שונים סופו של דבר מוביל לשינויים בביטוי גנים ותא פיזיולוגיה 23 והוצעו כי כלורופלסטים עשויים לתרום לסלולרי Ca 2 + איתות באמצעות חלבון CAS 22,24,25. החלבון השני הוא ANR1 (תגובה אנאירובית 1 6), חלבון שהוצג להיגרם תחת תנאי גידול anoxic בג reinhardtii 26. יש לציין, CAS, כמו גם ANR1 זוהו כיחידות משנה של CEF-supercomplex ויותר מכך, על ידי שימוש בגישות גנטיות הפוכה, זה היה הוכיח כי שני החלבונים תורמים מבחינה תפקודית לCEF in vivo 6, תומכים בתפקידם כיחידות משנה תפקודית של חלבון מורכב זה. החלבון השלישי הוא חלבון thylakoid PGR5-Like 1 (PGRL1), שהוצג להיות מעורבים בCEF בChlamydomonas 4,27 כמו גם בארבידופסיס 5,28 והיה גם identified בעבודתו של אל איוואי et. 7 גישה זו יוצגו על ידי המציג את התוצאות של שני ניסויים שונים: wildtype (WT) לעומת זן ΔPSI 29 (לעומת), מציג מחיקה של גן psab, קידוד לphotosystem החיונית למקטע, שהוא גם חלק מ CEF-supercomplex וWT לעומת pgrl1 עקום החוצה רצף 4. עבור כל אחד מניסויים אלה בהרכב הכמותי של CEF-supercomplex בין 15 N-ומתח 14 N שכותרתו הושווה.

<table><tbody><tr><td><חזק>כימיקלים</חומצה חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אצטית</td><td>AppliChem</td><td>A0662</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>אצטון</td><td>AppliChem</td><td>A2300</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>אצטוניטריל אופטיגראד f&uuml; r LC-MS</td><td>אלכסוני</td><td>9340</td><td>מזיק, עבודה עם כפפות. ראה טקסט הפרוטוקול לאמצעי זהירות נוספים. https://www.diagonal.de/</td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד 15N</td><td>מעבדות איזוטופ קיימברידג'</td><td>39466-62-1</td><td></td></tr><tr><td>http://www.isotope.com/cil/index.cfm אמוניום כלוריד 14N</td><td>AppliChem</td><td>A0988</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>אמוניום מימן פוספט&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3583</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>אמוניום גופרתי&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3598</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Coomassie כחול מבריק R-250</td><td>Fisher Scientific</td><td>10041653 http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>AppliChem</td><td>A0819</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>EDTA</td><td>AppliChem</td><td>A2937</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>חומצה פורמית&nbsp; &nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3858</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>AppliChem</td><td>A4425</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>מתנול</td><td>AppliChem</td><td>A2954</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>חומצה זרחתית</td><td>AppliChem</td><td>A0989</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>דיפוטסיום מימן פוספט&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>אשלגן דימימן פוספט&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>AppliChem</td><td>A1551</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>סוכרוז</td><td>AppliChem</td><td>A1125</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A2264</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>טריפסין (דרגת ריצוף שונה) ומאגר טריפסין</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>http://www.promega.de/</td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נבולייזר (משבש תאי BioNeb)</td>צינורות צנטריפוגה <td>Glas-Col</td><td></td><td>http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75</td></tr><tr><td>(14 מ"מ x 89 מ"מ)&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>331372</td><td>להכנת שיפועים בסגנון טקהאשי
http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגות 25 מ"מ x 89 מ"מ </td><td>בקמן קולטר</td><td>344058</td><td>להכנת שיפועי בידוד תילקואידים.
http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Coulter Avanti צנטריפוגה J-20 XP</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td>http://www.beckmancoulter.de/</td></tr> <tr><td>תא הוצאת תאים פוקס-רוזנטל</td><td>אלכסוני</td><td>449/72</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.diagonal.de/ הומוגנייזר (פוטר) 50 מ"ל&nbsp;</td><td>פישרברנד</td><td>10618242</td><td></td></tr><tr><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand עלי להומוגניזטור</td><td>פישרברנד</td><td>105252220</td><td></td></tr><tr><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand אולטרה-צנטריפוגה (אופטימה XPN-80 אולטרה-צנטריפוגה)</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td>אתר: http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td><חזק>אחר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים&nbsp;</td><td>Agrisera</td><td></td><td>http://www.agrisera.com/en/index.html</td></tr></tbody></table>

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; n מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

הפרוטוקול הציג מספק כלי לניתוח של מתחמי multiprotein בקרום thylakoid, על ידי גילוי תובנות קומפוזיציה מורכבת בתנאים שונים. בפרוטוקול זה הגישה באה לידי ביטוי על ידי השוואת הרכב של החלבון האחראי מורכב עבור זרימה מחזורית אלקטרונים (CEF) בChlamydomonas reinhardtii, מבודדת מזנים שונים מבחינה גנטית. ההליך כולל בידוד של קרומי thylakoid, ואחרי הפרידה שלהם למתחמי multiprotein ידי צנטריפוגה סוכרוז שיפוע צפיפות, SDS-PAGE, immunodetection וספקטרומטריית השוואתית, כמותית מסה (MS) המבוססת על תיוג ההפרש מטבולים (14 N / 15 N) של זנים נותחו. קרומי thylakoid solubilized דטרגנט נטענים על הדרגות צפיפות סוכרוז בריכוז כלורופיל שווה. לאחר ultracentrifugation, ההדרגות מופרדות לשברים, אשר נותחו על ידי המוני spectrometר&quot;י מבוסס על נפח שווה. גישה זו מאפשרת החקירה של הרכב בתוך השברים השיפוע ויותר מכך כדי לנתח את התנהגות הנדידה של חלבונים שונים, המתמקדת בעיקר על ANR1, CAS, וPGRL1. יתר על כן, שיטה זו באה לידי ביטוי על ידי המאשר את התוצאות עם immunoblotting ובנוסף על ידי תמיכה בממצאים ממחקרים קודמים (זיהוי וההגירה PSI תלוי של חלבונים שתוארו בעבר להיות חלק מCEF-supercomplex כגון PGRL1, FNR, ו cyt ו). יש לציין, גישה זו היא ישימה לטיפול במגוון רחב של שאלות שלפרוטוקול זה יכול להיות מאומץ ודוגמה המשמשת לניתוחים השוואתיים של קומפוזיציה מורכבת multiprotein מבודד מהתנאים סביבתיים שונים.

<html> גישת פרוטאומיקה כמותיים הציגה מטרה לאפיין את ההרכב של מתחמי multiprotein בקרומי thylakoid הודגמו על ידי הניתוח ההשוואתי של רכיבי CEF-supercomplex בג שונה מבחינה גנטית reinhardtii זנים. השיטה המתוארת בהצלחה יושמה על ידי Terashima et al. 6 וכוללת את הבידוד של קרומי thylakoid מתרבויות אנאירובי גדל, ואחריו solubilization חומרי ניקוי. בהמשך לכך, דגימות הועמסו על צפיפות סוכרוז שיפוע המבוססת על כמות כלורופיל שווה ומתחמים המופרדים על ידי ultrace...

הגישה המתוארת ההשוואתית, כמותית proteomic מטרתה קבלת תובנות לתוך הרכב של מתחמי multiprotein בתנאים שונים ומודגמת על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית. ניתוח כמותי כמויות שווה של שברים שונים מצפיפות סוכרוז שיפוע מעורבבות ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לנתח באופן השוואתי את הרכבן של קומפלקסי MultiPro בממברנות של th cord תחת תנאים שונים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד ממברנות th מתאי lamona שנחשפו לתנאים אנאירוביים. לאחר מכן, ממברנות th cord ממומסות ומסווגות בגרדיאנט צפיפות של סוכרוז.לאחר מכן, מערבבים נפחים שווים של הפראקציות הרצויות ומפרידים אותם ב-SDS page. לבסוף, מעבדים את הפסים שצבעו ב-kumasi באמצעות עיכול בטריפסין. בסופו של דבר, הדגימות מנותחות באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית כדי לבחון שינויים בשכיחות החלבונים בין הפראקציות שנחקרו.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מחקרים פרוטאומיים כמותיים המשווים כמות מוגדרת של חלבון, הוא שבגישתו שלנו, נפחים שווים של דגימות מופרדות משולבים ומנותחים. דבר זה מאפשר לחקור את התנהגות הנדידה של חלבונים בתוך המדרג, ויתרה מכך, לנתח את הרכבם של קומפלקסים שונים שאינם חלבונים בממברנה של הקבוצה השלישית. ביחס לזנים המיושמים, לאחר גידול של זני chlamydomonas reinhardtii, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו בתמיסות מלאי של סוכרוז בריכוז 2 M, beta DM בריכוז 10% במים, ו-tris בריכוז 0.5 M ב-pH 8.0.כדי להכין את התמיסות הבאות עבור מדרגי צפיפות של סוכרוז להקמת המדרגים באמצעות מבחנות צנטריפוגה של 14 על ידי 89 מילימטר, התחילו במזיגה איטית של 1 מיליליטר של תמיסה 1.3 מולרית, ולאחריה 1 מיליליטר של תמיסה 1.0 מולרית. לאחר מכן, מזגו 2 מיליליטרים מכל אחת מהתמיסות 0.85, 0.7, 0.65, ולבסוף, התמיסה 0.4 מולרית. אחסנו את המדרגים למשך לילה בחדר הקירור כדי להשריות תנאים אנאירוביים.בתרביתי הכלמידומונאס (chlamydomonas), הכניסו פיפטת זכוכית אל בקבוקי התרבית והנפיחו גז Argonne למשך ארבע שעות, בליווי ערבוב והארה רציפים, לצורך בידוד ממברנות של ה-thal cord. לאחר הדגירה, התחילו בהסמכה של התאים למשך חמש דקות ב-2,500 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, השעו שוב את משקעי התאים ב-30 milliliters של בופר H1.חזור על הסנטריפוגציה ושוב, השהה. השהה את התאים בבופר H one כדי לשבור את התאים, והעבר אותם דרך נבולייזר עם לחץ חנקן של 1,500 Pascals. ודא שהמרחק בין הכדור הקרמי למתכת קטן מספיק כדי שהתאים יישברו.לאחר מכן, סבבו את התאים למטה למשך שבע דקות ב-2,500 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. הנוזל העליון (supernatant) צריך להיות בצבע ירוק בהיר. אם פירוק התאים הצליח, השעיקו שוב את התאים ב-50 milliliters של H two buffer והשקיעו אותם למשך 10 דקות ב-32,800 ×g ובטמפרטורה של 4 °C.לאחר השהיית התאים ב-10 milliliters של H three buffer, השתמש ב-potter כדי להומוגניז את המשקוע שהושהה. לאחר מכן, להכנת מדרגי צפיפות סוכרוז של חבל טבילה, התחל עם 12 milliliters של תאים ב-H three buffer.לאחר מכן, מזגו באיטיות שכבה של 12 milliliters של H four buffer וסיימו עם 12 milliliters של H five buffer. השתמשו ב-H five לאיזון הרוטור וסובבו את הגרדיאנטים בצנטריפוגה למשך שעה אחת ב-70,700 ×g. הוציאו את פסי ה-TH מהגרדיאנטים והשתמשו בנפח מתאים של H six buffer כדי לדלל אותם.סובבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 37,900 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. אם המשקע אינו דחוס, הוסיפו עוד H six buffer לשלב הצנטריפוגה. לאחר מכן, בצעו ריסוס.השעו את חוטים התילקואויידים בנפח קטן של בופר H six כדי להטעין גרדיאנט צפיפות סוכרוז של מערכת פוטוסינתזה. ראשית, חשבו את כמויות חוטים התילקואויידים, ה-beta DM ובופר H six הדרושים לכל גרדיאנט. לפי הנחיות אלו, כל גרדיאנט יכיל 0.8 milligrams per milliliter של כלורופיל ב-0.9% beta DM, ובופר H six יעלה את הנפח הסופי ל-700 microliters.כדי להמיס את התילקואידים, הכין תמיסות Eloqua נפרדות עם Thylakoids beta DM ו-H six buffer עבור כל מדרג. דגור את הדגימות על קרח למשך 20 דקות והפוך את המבחנות מדי כמה דקות כדי לערבב. לאחר מכן, סביבב את הדגימות ב centrifuge ב-14,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.המשקע צריך להיות קטן ולבן, והנוזל העליון יהיה בירוק כהה. העמיסו את הנוזל העליון על מדרג הריכוזים (gradients) באיזון עם באפר H six, ובצעו סבוב באולטרה-צנטריפוגה ב-134,470 ×g למשך 14 שעות ובטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסבוב, צלמו את מדרגי הריכוזים ולאחר מכן בצעו הפרדה למקטעים (fractionation).השתמשו במחט כדי ליצור חור בתחתית המבחנה ואספו פרקציות למבחנות של 500 µL. לחלופין, ניתן להשתמש בתהליך עם פלטת 96 בארות. הכינו את הדגימות ל-SDS page, עיכול ג'ל ומספקטרומטריה של מסות בהתאם לפרוטוקול הכתוב כפי שמוצג כאן, תוך שימוש בתוצאות מניתוח דם אימונולוגי: פרקציה שש של wild type ופרקציה 13 של delta PS 1.באיור זה נבחרו עבור ניתוח רכיבי הסופר-קומפלקס של זרימת אלקטרונים מחזורית (cyclic electron flow) הפראקציות עם השיאים של A ו-R one. מוצגים יחסי חלבונים יחסיים המתוארים כסוג פראי (wild type) לעומת delta PS one 14 N מעל 15 N עבור מספר חלבוני ליבה של PS one וחלבון קצירת אור של PS one, וכן עבור חלבונים המשויכים לסופר-קומפלקס של זרימת אלקטרונים מחזורית; ההבדלים בשכיחות של a NR one ו-CAS בפראקציות 6 ו-13 של סוג פראי ו-delta PS one מרמזים כי אלו הם רכיבים חדשים של קומפלקס זה. מוצגות כאן התוצאות של השוואה כמותית של סופר-קומפלקס זה של זרימת אלקטרונים מחזורית בין הסוג הפראי לבין זן knockout של PG L one. באופן מעניין, נראה כי HCF 1 36, cytochrome B six, cytochrome B six F subunit four ו-PET C מועשרים בסוג הפראי, בעוד ש-FTSH two, cytochrome F ו-PET O נראים מועשרים ב-PG L one.לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה של האופן שבו ניתן להשוות את ההרכב של קומפלקסי MultiPro בממברנות נוזליות בתנאים שונים. זכרו כי להכנה מוצלחת של הממברנות הנוזליות ולבידוד של זרימת האלקטרונים המעגלית, שלבי פירוק התאים של הסופר-קומפלקס, פוטורינג (pottering) של התאים ואופטימיזציה של הממברנות הנוזליות הם שלבים קריטיים. יתרה מכך, יש לצנטריפוג את מדרגי צפיפות הסוכרוז למשך 12 שעות לפחות כדי להשיג הפרדה מלאה של קומפלקסים פוטוסינתטיים.

a-new-approach-for-comparative-analysis-multiprotein-complexes-based

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ספקטרומטריית מסה הוכיחה להיות כלי רב ערך עבור ניתוח מערכות חלבון גדול. שיטה זו מאפשרת תובנות אדריכלות, הרכב stoichiometry הכוללת של למקטע רב מכלולים. כאן, אנו לתאר, שלב אחר שלב, כיצד לבצע ניתוח מבניות ספקטרומטריית מסה, ולאפיין מבנים macromolecular.

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

אנו מציגים וריאציה של (immunoprecipitation כמותיים בשילוב עם מציאה) הגישה המהירה שהוצגה בעבר להבחין בין אמת ושקר אינטראקציות בין חלבונים. הגישה שלנו מבוססת...

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

אנו מתארים כאן שיטה חדשנית, חזקה ויעילה לטיהור זיקה טנדם (TAP) לביטוי, בידוד ואפיון של קומפלקסים של חלבונים מתאים אוקריוטיים. פרוטוקול זה יכול לשמש לאפיון ביוכימי של קומפלקסים בדידים כמו גם לזיהוי אינטראקטורים חדשים ושינויים לאחר תרגום המווסתים את תפקודם.

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

תיוג מבשר איזוטופים בשילוב ותיוג isobaric (cPILOT) הוא אסטרטגית פרוטאומיקה כמותית המשפר יכול ריבוב מדגם של תגי isobaric. פרוטוקול זה מתאר את היישום של cPILOT לרקמות מתוך שולטת מודל עכבר מחלת אלצהיימר ו wild-type.

לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

הארכיטקטורה של מתחמי חלבון חיוני לתפקוד שלהם. שילוב של טכניקות שונות המוני spectrometric הוכיח עוצמה ללמוד ההרכבה שלהם. אנחנו מספקים פרוטוקולים cross-linking כימי, יליד ספקטרומטר מסה ולהראות כמה שיטות משלימות אלה לעזור להבהיר את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון הרכבות.

שילוב cross-linking כימי ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ללמוד את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון להרכבות

כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול לטיהור ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה זיקה (BiCAP). שיטה חדשנית זו מקלה על ספציפיות בידוד ואפיון פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם של כל שני חלבונים אינטראקציה, בעוד למעט האו ם-ומורכבת חלבונים בודדים, כמו גם מתחמי הקים עם שותפים איגוד מתחרות.

ויבתר חלבון רב מתחמי איתות על ידי טיהור זיקה קומפלמנטציה ריאקציה דו-מולקולרית (BiCAP)

ספקטרומטר מסה (MS) התפתחה כלי חשוב החקירה של מבנה, הדינמיקה של הרכבות macromolecular. כאן, אנחנו משלבים גישות MS לחקור היווצרות מורכבות חלבון ואיגוד ליגנד.

ניתוח ארכיטקטורות חלבון חלבון-ליגנד מתחמי באמצעות ספקטרומטר מסה מבניים אינטגרטיבית

הפרוטוקול המתואר מספק ניתוח פרוטאומי כמותי ממוטב של דגימות רקמה באמצעות שתי גישות: כמות מבוססת תווית וללא תווית. לגישות מבוססות תוויות יש יתרון של כמות מדויקת יותר של חלבונים, בעוד שגישה נטולת תוויות חסכונית יותר ומשמשת לניתוח מאות דגימות של קבוצה.

זרימת עבודה מקיפה של פרוטאומיקת רובה ציד מבוססת ספקטרומטריה של דגימות רקמה

ההליכים הניסיוניים לביצוע תיוג קוולנטי מבוסס diethylpyrocarbonate עם זיהוי ספקטרומטרי מסה מתוארים. Diethylpyrocarbonate הוא פשוט מעורבב עם חלבון או חלבון קומפלקס של עניין, המוביל לשינוי של שאריות חומצות אמינו נגיש ממס. ניתן לזהות את השאריות ששונו לאחר עיכול פרוטאוליטי וניתוח כרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטריית מסה.

תיוג קוולנטי עם דיתילפירוקרבונט לחקר מבנה חלבון מסדר גבוה יותר על ידי ספקטרומטריית מסה

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעשרת פוספטזות פוספופרוטאין אנדוגניות והחלבונים המתקשרים ביניהן מתאים ורקמות וזיהוי וכימות שלהם על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.

גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

חקור ניתוח השוואתי של מכלולי MultiPro בממברנות תלקואידים בתנאי אנאירוביים שונים. השיטה משתמשת בכרומטוגרפיה סוכרוז וספקטרומטריית מסה כמותית לזיהוי שינויים בשפע חלבונים.

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על

גלה סרטונים נוספים