בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את ההשפעה של מודולטורים פנוטיפיים כגון השתקת גנים מארח או ההשפעה של מולקולות קטנות על מיקובקטריום טוברקולוזיס, שכפול תוך תאי. זה מושג על ידי חלוקת מולקולות קטנות ו-384 לוחות באר או העברת תאים עם irna וטרנספקט לקומפלקס. השלב הבא הוא להדביק תאים בחלבון פלואורסצנטי ירוק המבטא מיקובקטריום טוברקולוזיס או G-F-P-M-T-B, להוסיף תאים למולקולה הקטנה המכילה בארות ולדגור על המיקרו-צלחת למשך חמישה ימים.

עבור גישת RNAi, הוסף תאים לקומפלקס טרנספקט RNAi המכיל בארות. דגרו על המיקרו-צלחת למשך שלושה ימים ולאחר מכן הדביקו תאים ב-G-F-P-M-T-B המבטא מיקובקטריום טוברקולוזיס. לאחר צביעת התאים, השלב האחרון הוא קריאת הלוחות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי אוטומטי.

בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אוטומטית ואחריה ניתוח מבוסס תמונה משמשת למדידת השינויים בצמיחה התוך-תאית G-F-P-M-T-V. היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטה קיימת כמו ציד יוני ליצירת מושבה הוא שהיא חוסכת תקופת דגירה ארוכה ומאפשרת תפוקה רבה יותר. מי שידגים את ההליך הזה יהיו כריסטוף קוואל או SONG ושלושה פוסט-דוקטורנטים מצוות המחקר שלי.

הפרוטוקולים לסריקת ספריית SI RNA וסינון ספריית תרכובות משתמשים בתרביות GFP בנות שבועיים המבטאות MYCOBACTERIUM tuberculosis H 37 RV. כדי להכין את תרחיף החיידקים G-F-P-M-T-B צנטריפוגה ראשונה את התרבית ב-4,000 Gs למשך חמש דקות, השליכו את הסופרנטנטים Resus, השעו את התרבית ל-DPBS וצנטריפוגה שוב בצורה זו. שוטפים את התרבות שלוש פעמים עם DPBS.

לאחר השטיפה השלישית, השליכו את הסופרנט והשעו מחדש את הגלולה החיידקית ב-10 מיליליטר של 10% FBS המכילים מדיום RPMI 1640. השאירו את התרחיף למשך שעה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לאגרגטים החיידקיים לשקוע. אסוף את הסופרנט החיידקי ומדוד את ה-OD ב-600 ננומטר ופלואורסצנטי GFP.

באמצעות קורא מיקרו-פלטות כדי לקבוע את ריכוז החיידקים, ה-OD ב-600 ננומטר צריך להיות בין 0.6 ל-0.8. חשב את טיטר המתלה באמצעות קו רגרסיה ייחוס, המציג את ערך ה-RFU כפונקציה של ערך CFU שנוצר לפני הניסויים בתרבית אחרת שהוכנה באותם תנאים. ריכוז טיפוסי הוא אחד כפול 10 עד שמונה חיידקים למיליליטר.

התחל הליך זה על ידי השעיית ספריית ה-SI RNA המיובשת המאוחסנת ב-96. ובכן אמא צלחות עם מאגר X-S-I-R-N-A אחד לריכוז של שתי מיקרומולר. מעבירים 10 מיקרוליטר מהתערובת לכל באר של צלחת בת של 384 באר מעבירים 2.5 מיקרוליטר של SI RNA מכל באר של צלחת הבת לתוך צלחת בדיקת באר 384 לאותה צלחת בדיקה.

הוסף 2.5 מיקרוליטר כל אחד של IRNA בקרה שלילית וחיובית לבארות שלהם. אם לא נעשה שימוש בצלחת הבת, אטום אותה מיד עם חותם אלומיניום מתקלף. ניתן לאחסן את הפלטה האטומה בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך שישה חודשים לפחות ואולי עד שנתיים עד שלוש, בהתאם לאירנ"א.

המלצות יצרן הספרייה. הכן את ריאגנטים הטרנספקציה על ידי דילול ב-X-D-P-B-S אחד כדי להניב מספיק תמיסה כדי לספק 0.1 מיקרוליטר לכל אחד. ובכן דגרו מראש את תמיסת הטרנספקציה המדוללת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

הוסף 7.5 מיקרוליטר מתמיסת הטרנספקציה המדוללת לכל באר של צלחת בדיקת הבאר 384 ודגר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לכל באר של לוחית הבדיקה ב-40 מיקרוליטר של שני פנאומוציטים מסוג אנושי, A 5 4 9 תאים תלויים במדיום RPMI 1640 בתוספת סרום בקר עוברי 10%. שמור על תאים למשך שלושה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה המכילה 5% פחמן דו חמצני. תאים אלה מתחלקים כל 24 שעות, ולכן כ-12,000 תאים נמצאים בכל באר שלושה ימים לאחר הטרנספקציה.

שלושה ימים לאחר שסי. טרנספקציה של RNA של 5 49 תאים מכינים תרחיף חיידקי MTBH 37 RV GFP. כפי שהודגם קודם לכן.

ההשעיה צריכה להכיל 2.4 כפול 10 עד ששת החיידקים למיליליטר, המתאים לריבוי זיהום של חמישה. הסר את המדיום בצלחת בדיקת הבאר 384 והוסף 25 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים לכל באר. דגרו על לוחית בדיקת הבאר 384 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות באטמוספירה המכילה 5% פחמן דו חמצני.

אחרי חמש שעות. הסר את המדיום ושטוף בעדינות את התאים שלוש פעמים עם מדיום RPMI בתוספת 10% FBS כדי להרוג את החיידקים החוץ-תאיים הנותרים. טפל בתאים בכל באר עם 50 מיקרוליטר.

מדיום R-P-M-I-F-B-S טרי המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר אמיקאצין. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה באטמוספירה המכילה 5% פחמן דו חמצני. לבסוף, הסר את המדיום המכיל אמיקצין והוסף 50 מיקרוליטר של מדיום RPMI טרי בתוספת 10% FBS לכל . ובכן.

דגרו את לוחית הבדיקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים באטמוספירה המכילה 5% פחמן דו חמצני לפני הקרנה במיקרוסקופיה קונפוקלית. כדי להתחיל בהליך זה, יש להפשיר צלחת אם של 384 בארות המכילה את ספריית התרכובות המסיסות ב-100% DMSO בטמפרטורת החדר, להעביר 0.5 מיקרוליטר מהתרכובות מלוח האם לצלחת בת של 384 באר המכילה 10 מיקרוליטר לבאר של RPMI 1640. בינוני בתוספת 10% FPS בקציר הבא מקרופאגים אנושיים ראשוניים בני שישה ימים בארבעה כפול 10 לחמישה תאים למיליליטר ב- RPMI 1640.

בינוני בתוספת 10% FPS ו-50 ננוגרם למיליליטר. MCSF אנושי רקומביננטי דוגר על התאים הראשוניים המדוללים עם בסיסיה ב-MOIs שונים הנעים בין אחד לחמישה בתרחיף עם טלטול קל ב-90 סל"ד למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס. שטפו את התאים הנגועים בצנטריפוגה ב-350 GS למשך חמש דקות כדי להסיר את החיידקים החוץ-תאיים.

Resus השעו את הכדורים ב-RPMI 1640. בינוני בתוספת 10% FPS וצנטריפוגה. שוב, חזור על זה, שטוף פעמיים לאחר הכביסה האחרונה.

Resus משהה את התאים הנגועים במדיום RPMI 1640 בתוספת 10% FBS ו-50 מיקרוגרם למיליליטר. אמיקאצין דוגר על המתלים עם טלטול קל למשך שעה בצנטריפוגה של 37 מעלות צלזיוס ב-350 GS למשך חמש דקות. הסר את המדיום המכיל אמיקצין ושטוף את התאים הנגועים עם RPMI 1640 מלא.

בינוני בתוספת 10% FBS ו-50 ננוגרם למיליליטר. MCSF אנושי רקומביננטי. חזור על שטיפה זו פעם אחת.

הוסף 40 מיקרוליטר לבאר של תרחיף המקרופאגים הנגוע לאותה לוחית בדיקת באר 384 שהוכנה קודם לכן, שכבר מכילה 10 מיקרוליטר של דילול התרכובת. הריכוז הסופי של DMSO בכל באר הוא כעת 1% דגירה של לוחות הבדיקה למשך חמישה ימים ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה המכילה 5% פחמן דו חמצני לפני הקרנה במיקרוסקופיה קונפוקלית לספריית SI RNA. סינון לפני רכישת התמונה, הוסף לכל באר של לוחית הבדיקה 10 מיקרוליטר של 30 מיקרוגרם טריים למיליליטר DPI ב-PBS ודגירה למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

לבדיקת תרכובות לפני רכישת התמונה, צבעו את התאים החיים בצבע פלואורסצנטי אדום רחוק למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. טען את לוחות הבדיקה למיקרוסקופ קונפוקלי אוטומטי. הגדר את פרמטרי החשיפה לרשום פלואורסצנטיות DPI באמצעות לייזר עירור ב-405 ננומטר עם מסנן פליטה ב-450 ננומטר.

הקלט פלואורסצנטיות GFP באמצעות לייזר עירור ב-488 ננומטר עם מסנן פליטה ב-520 ננומטר. בחר את הבארות והשדות בכל באר לרכישה, המכונים לאחר מכן פריסות ופריסות משנה. פרמטרים יוצרים את קובץ הניסויים באמצעות הפרמטרים שנקבעו ומפעילים את הרכישה האוטומטית.

במקרה זה, ארבע תמונות שונות של אותה באר ושדה מוקלטות מעבירות תמונות לשרת מרוחק. לאחר מכן התמונות מוערכות באמצעות תוכנת ניתוח התמונה acapella 2.6 לבדיקת SI RNA. כל שדה מכיל שני ערוצים או צבעים.

ירוק לחיידקים וכחול לתא. גרעינים מזהים גרעיני תאים מערוץ DAPI באמצעות אלגוריתם זיהוי גרעינים ואת אזור החיידקים מערוץ GFP באמצעות אלגוריתם תכונות עוצמת פיקסלים. על ידי מיזוג הערוצים וספירת מספר הפיקסלים המשותפים לחיידקים ולתאים, החיידקים התוך-תאיים מכומתים.

התוצאות הסופיות המתבטאות כממוצע של ארבעת השדות הן שטח החיידקים הכולל, מספר התאים הכולל, אחוז התאים הנגועים ושטח החיידקים לתא. עבור סינון מורכב, כל שדה מכיל שני ערוצים או צבעים, ירוק לחיידקים ואדום רחוק לתא. גרעינים וציטופלזמה מזהים את אזור התא מהתעלה האדומה הרחוקה ואת אזור החיידקים מערוץ GFP באמצעות אלגוריתם תכונות עוצמת פיקסלים.

על ידי מיזוג הערוצים וספירת מספר הפיקסלים המשותפים לחיידקים ולגרעינים, החיידקים התוך-תאיים מכומתים. התוצאות הסופיות המתבטאות כממוצע של ארבעת השדות הן שטח החיידקים הכולל, שטח התא הכולל, השטח הכולל של החיידקים התוך-תאיים והיחס בין שטח החיידקים התוך-תאיים לשטח הכולל של התאים. תוצאות מייצגות מבדיקת SI RNA בתפוקה גבוהה בכל הגנום מוצגות כאן, השתקת הביטוי של דין אחד עם SI RNA הובילה לירידה בכמות המיקובקטריות התוך-תאיות ב-5 49 תאים.

כפי שמוצג בתמונות קונפוקליות מייצגות אלה של 5,49 תאים שהועברו עם IRNA שאינו מטרה או עם SI RNA ספציפי לדין אחד ונגועים ב-GFP המבטא MTB במשך חמישה ימים. GFP MT BH 37 RV הוצג בירוק והתאים באדום. מספר התאים והעומס התוך-תאי G-F-P-M-T-B-H 37 RV נקבעו באמצעות תוכנת ניתוח מבוססת תמונה.

גרף זה מציג את אחוז הנדבקים ב-5,49 תאים בחמישה שכפולים של אירנ"א מעורבב המיוצגים על ידי עיגולים כחולים ו-din אירנה אחד המיוצג על ידי עיגולים אדומים. לאחר שלושה ימים של השתקה וחמישה ימים של הדבקה, אחוז התאים הנגועים יורד בחצי ב-din אחד השתיק 5 49 תאים בהשוואה לתאים שהועברו עם IRNA שאינו מטרה. נורמליזציה מבוססת מדגם של SI RNA ממוקד DIN אחד בהשוואה לערבול יושמה כדי להגדיר את ציון Z.

ממוצע ציון Z סביב שלילי 15 הושג עבור SI DIN ממוקד. שלוש הכוכביות מייצגות ערך P של פחות מ-0.0001. תוצאות אלה מצביעות על כך ש-DIN אחד יכול לשמש כבקרה חיובית עבור ה-si, מסך לגילוי גורמי מארח חדשים אחרים המעורבים בקולוניזציה של MTB ופנאומוציטים שיכולים להיות בעלי אותו פנוטיפ כמו זה של dins IRNA בהקרנת תרכובות התוכן הגבוה.

יעילות התרכובות על צמיחת חיידקים תוך תאיים הוערכה על ידי קביעת עקומת תגובת מינון או DRC ונורמליזציה לתרכובות הייחוס החיוביות והשליליות. בדוגמה זו, מקרופאגים ראשוניים אנושיים הנגועים בזן A GFP המבטא MTBH 37 RV הודגרו עם 1% DMSO כבקרה שלילית או עם ריכוזים הולכים וגדלים של שתי תרכובות ייחוס, isid, INH ו-rifampicin. ריף. המקרופאגים מסומנים בצבע פלואורסצנטי אדום והצבע הירוק מציין את ניתוח ה-MTB של תמונות הקרינה הקונפוקליות של המקרופאגים האנושיים הנגועים גילה כי התרכובות הפעילות משפיעות על השכפול התוך-תאי של MTB בתאים המארחים מה שמוביל לירידה בעומס המיקובקטריאלי, התואם את אזור אות ה-GFP בתאים.

היחס בין שטח החיידקים התוך-תאיים לשטח התא הכולל חושב ולאחר מכן שורטט כפונקציה של ריכוז התרכובות ליצירת ה-DRC המוצגים כאן הם ה-DRCs של isid ו-rifampicin בכל גרף. ה-DRC של התרכובת נורמל לזה של 1% DMSO, הביקורת השלילית ו-0.1 מיקרוגרם למיליליטר הביקורת החיובית. עקומות אלו מאפשרות לקבוע הן את הריכוז הנדרש לעיכוב 50% מהתיישבות החיידקים והן את הריכוז המינימלי הנדרש לעיכוב 99% משכפול החיידקים סמסטר אחד.

טכניקה זו יכולה להיעשות ב-10 שעות המחולקות באופן הבא, שעתיים להעברת תאים או הכנת תרכובת, שש שעות לזיהום תאים וחלוקה למיקרופלייט ושעתיים לשמירה על רכישת תמונה. זה על פני תקופה של שמונה ימים, אל תשכח שעבודה עם מיקובקטריום טוברקולוזיס יכולה להיות מאוד כאמנים וכי תמיד יש ליטול בשלים מוקדמים, כגון לבישת ציוד מגן אישי, כולל מסכה, בזמן ביצוע הליך זה.