Name: הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T16:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: למדו את שיטת pTIRFM לזיהוי דינמיקת ממברנות בתאים בזמן אמת. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר עיוותי ממברנה במהלך אקסוציטוזה ומספקת כלי עוצמתי לחקר ביולוגיית התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מדען פיתוח גרנט הלאומי (13SDG14420049) ל AA מאיגוד הלב האמריקאי וקרנות הזנק מאוניברסיטת ויין סטייט. אנו חייבים תודה לד&quot;ר רונלד W. הולץ וד&quot;ר מרי Bittner למתן ייעוץ לגבי הכנות שור יותרת הכליה וד&quot;ר דניאל אקסלרוד לקבלת סיוע בpTIRFM ההגדרה והערות מועילות על כתב היד. Syt-1 pHluorin היה בשימוש עם אישור של ד&quot;ר גרו Miesenbock (אוניברסיטת אוקספורד). GCAMP5G הושג באמצעות Addgene. אנו מודים ג&#39;יימס ט &#39;טיילור, Tejeshwar Rao, רחל L. Aikman, וPraneeth Katrapti עם עזרה באופטימיזציה של שלבים שונים של ההליכים שתוארו.

1. הגדרת מערכת PTIRF טכניקת pTIRFM בנויה על פלטפורמת מיקרוסקופ הפוכה. קרן לייזר מכוונת דרך יציאת תאורת צד וקוביית מסנן מול צד nonpolarizing, ולאחר מכן התמקדה על מישור המוקד האחורי של אובייקטיבי 60x 1.49 NA TIRF. שתי עדשות נוספות (1.6x ו2X) בנתיב הפליטה בין המיקרוסקופ והמצלמה EMCCD לתת גודל פיקסל סופי של כ 80 ננומטר. קרן לייזר הם מודרכים על שימוש במראות גלונומטר תוכנה מבוקרת למיתוג מהיר בין ההשתקפות פנימית עלית וסך הכל תאורה (TIR). הפרוטוקול המתואר להלן מניח כי אופטיקה לTIRF כבר מוצבות על שולחן האוויר בעמדות אופטימליות לעירור fluorophore והדמיה. הוא מתאר כיצד אופטיקה הקיטוב מתווספות להגדרת מיקרוסקופ TIRF קיים כדי לאפשר הדמיה של עיוותים קרום תא. סכמטי של ההגדרה האופטית של המעבדה שלנו ליצירה שני TIR וpolarizatTIR מבוסס יון מוצג באיור 1 א. הפרוטוקול מניח את השימוש בליזר 488 ננומטר לעירור של חלבוני שלפוחית ​​ניאון וליזר 561 ננומטר להדמיה של צבע carbocyanine, עשה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוח על כל רכיבי מיקרוסקופ, הלייזרים, ומחשבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוון את אלומת הלייזר מ488 ננומטר למטוס בחזרה המוקד (BFP) של עדשת 1.49 NA כפי שמודגמים באיור 1 א. אם קרן הלייזר על BFP ממוקד, שיצוף collimated ומופיע נקודה מוגדרת היטב קטנה כמו על התקרה ישירות מעל המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מראה גלונומטר X (הראי ממוקם במטוס המדגם שווה הערך), כך שקרן הלייזר עברה מחוץ ציר ועולה מן האובייקטיבי בזוויות תלולה יותר בהדרגה לנורמלית אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לוודא שטיר מושגת. הוסף 10 μl של microspheres ניאון למיליליטר נפח 1 של PSS בצלחת זכוכית תחתונה. רק הקרינה מזעירה בתחתית oו הצלחת, הקרוב ביותר לממשק טיר, צריך להיות מזוהה. איתור של זעירים צף מצביע על כך שהזווית בין אור האירוע והנורמלי אובייקטיבי אינה מספקת. הקטע הבא מתאר את ההגדרה של הרכיבים אופטיים הדרושים להדמיה המבוסס על קיטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קרן 488 ננומטר מיושר כמדריך, להתאים את המיקום של קרן לייזר 561 ננומטר גלם, כך שהוא נוסע לאורך נתיב אופטי זהה. לייזר 561 ננומטר ישמש להדמיה של צבע carbocyanine, עשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס עדשה לסטות ומראות במורד הזרם של לייזר 561 ננומטר. שימוש במראות, לכוון את הקרן, כך שהוא coaligned עם קורה 488 ננומטר והמקום הוא בפוקוס על התקרה כאשר מראות גלונומטר נמצאות בעמדה &quot;0&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז צלחת רבע גל (QW) בנתיב הקרן מייד במורד הזרם של צמצם הלייזר. השתמש QW אשר הוא או אכרומטית או מכוון לגל העירור.QW מעגלית יהיה לקטב את כל אור מקוטב ליניארי שנכנס בזווית של ° 45 עם הציר האופטי. חלק מהרכיבים אופטיים, כגון קוביות הקיטוב, יש הטיה לכיוון הנחתה ציר אחד של קיטוב. QW ניתן לסובב כדי לפצות על הטיה זו. התאמה זו תגרום לאלומה מקוטבת elliptically. QW הוא הכרחי, מכיוון שקרן הלייזר עצמו מקוטב מאוד באופן ליניארי (במאונך) כפי שהוא עולה מהצמצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים קוביית קיטוב (PC1) במורד הזרם של האלומה מקוטבת elliptically. קוביית הקיטוב משקפת את המרכיב האנכי (y) של השדה החשמלי ומעבירה את הרכיב האופקי (x). קוביית הקיטוב מושם על שלב תרגום קטן כדי להקל על היישור הבא של נתיבי קורה קיטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקובייה שנייה קיטוב (PC2) ומראות (איור 1 א) ללשלב מחדש קורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח תריס בין הקובייה הראשונה קיטוב (PC1) והשיתוף האנכימראה mponent. הנח תריס שני בין מראה הרכיב האופקי והקובייה שנייה קיטוב (PC2). תריסים אלה נשלטים על ידי תוכנת ההדמיה המאפשרת למשתמש לבחור במהירות בין קיטובי קורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במסנן מקטב כדי לוודא את כיוון השדה החשמלי בכל נתיב קרן. מסנן קיטוב רק יאפשר שידור בקו אחד עם הציר של המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהרכיבים האנכיים ואופקיים של קרן הלייזר מיושרים אחד עם השני ואת קרן 488 ננומטר. בצע התאמות לפי צורך. שלוש הקורות צריכות להיות ממוקדות בBFP ולצאת collimated מהאובייקטיבי לאותה נקודה על התקרה. המקום הזה יכול להיות מסומן על ידי X כדי להקל על יישור עתיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של שמן טבילה על המטרה. מניחים את הצלחת המכילה זעירים מניאון (ראה שלב 4 לעיל) במטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן טיר על ידי הזזת מראה גלונומטר X. בטיר, componen האנכילא של הקרן הוא s-Pol והרכיב האופקי של הקרן הוא החברה P-Pol. התאם את העצמה היחסית בין הקורות על ידי החלפה של צלחת QW. הצג את כל שדה חלוף מקוטב עם מדגם rhodamine, אשר צפוי להיות מכוונים באופן אקראי. סובב את צלחת QW כדי להתאים את עוצמות פיקסל הממוצעת. במידת צורך, להוסיף מסנן צפיפות ניטראלי בנתיב קרן מקוטב אחד כדי להחליש את עוצמתו. </li></ol> 2. בידוד תא chromaffin הליך לבידוד תאי chromaffin בריאים מבלוטת יותרת הכליה העגל מובא בהמשך. הוא מותאם מפרוטוקולים שפורסמו בעבר על ידי וויק, Senter, et al. 19 ואוקונור, מהטה et al. 20 לאחר בידוד, תאי electroporated עם פלסמיד (ים) של עניין באמצעות מערכת electroporation. תוצאות מערכת זו ב20-30% מתאים המבטאים את חלבוני ניאון הרצויים. בדרך כלל, 70% מתאים לשרוד הנבחרתהליך roporation. פירוט מרכיבי PSS ותקשורת מסופק בלוחות 2, 3, ו -4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני הכנת התא, טיפול בזכוכית תחתונה 35 מ&quot;מ איכות אופטית (0.17 מ&quot;מ עובי) מנות עם 1 מיליליטר פולי-D-ליזין (0.1 מ&quot;ג / מיליליטר) ואחריו 1.25 מיליליטר קולגן שור. עזוב את מנות אוויר יבש במכסת מנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג בלוטת יותרת הכליה שור מבית השחיטה. שמור את הבלוטות על קרח בזמן שהם מועברים למעבדה. בלוטת יותרת הכליה השור עשויה להיות עטופה בשכבה עבה של שומן. השתמש במספריים כירורגי כדי להסיר עודפי שומן ולחשוף את פתיחת וריד הכליה. Perfuse הווריד עם prep-PSS שוב ושוב עד שבלוטת מטוהר של דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, פיפטה לאט 2 מיליליטר של תמיסת TH-PSS לתוך הפתח הווריד עד שמתנפח הבלוטה. דגירה הבלוטות מנופחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. יש לחזור על טיפול TH-PSS ולדגור שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את קליפת יותרת הכליה החיצונית מסביב לקצה של הבלוטה עם scissors ולקלף את הבלוטה מלבד לחשוף את הלשד. השתמש באזמל כדי לגרד בעדינות ולהפריד את הלשד מרקמת קליפת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברר בלשד עם זוג להבי אזמל ל5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעד עיכול סופי יש צורך לבודד את תאי chromaffin בודדים. יוצקים את ההשעיה התא הטחון לתוך בקבוק טווה. באופן חלקי למלא את הבקבוק עם יחס של 2:1 של TH-PSS (30 מיליליטר) ל TL-PSS (15 מיליליטר) ו דגירה במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס בזמן מסתובב בכ 100 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את תאי chromaffin הבודדים מרקמות מעוכלת על ידי סינון דרך רשת מיקרומטר 400. אסוף את התסנין. צנטריפוגה ב XG 200 עד גלולה התאים, ו resuspend ב PSS הקר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את התאים דרך 250 רשת מיקרומטר, גלולה, ולבסוף resuspend במאגר electroporation (ראה שלב 2.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולהתכונן לtransfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect תאים עם מערכת electroporation פיהמלצות היצרן. התנאים המדויקים לelectroporation צריכים להיקבע באופן אמפירי. הערה: ההגדרות המספקות את האיזון הטוב ביותר בין יעילות transfection ושיעור הישרדות תא להכנה זו של תאי שור chromaffin הן 1,100 V, 40 אלפיות שני, ודופק 1. אנו מעריכים כי בתנאים אלה, 20-30% מתאי transfected. אודות 30% מהתאים לא שורדים את תהליך electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים בעדינות על פולי-D-ליזין וקולגן טופלו מנות ב 1 מיליליטר של תקשורת חיממה electroporating. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כלים בחממה 37 ° C (5% CO 2). הוסף 1 מיליליטר של תקשורת האנטיביוטיקה 2x לכל מנה לאחר 6 שעות. לשנות את התקשורת לתקשורת רגילה ביום שלמחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי chromaffin הם צילמו בדרך כלל 2-5 ימים לאחר electroporation. </li></ol> 3. רכישת תמונת pTIRF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוח במערכת הדמיה ולהתחיל רכישת תוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שלייזרים מיושרים. בדוק חלוףפרופיל שדה באמצעות זעירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מערכת זלוף המקומית והעולמית. מאגרי פתרון נקיים עם H 2 O deionized המסונן ולמלא עם בסיס ועידוד פתרונות PSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההדמיה תאי chromaffin, ודא שעירורי p-Pol ו-S-Pol להאיר אותו האזור של שדה הצפייה ושעוצמות התאורה הן בערך שווה ערך. כדי לעשות זאת, למלא צלחת זכוכית תחתונה עם 2 מיליליטר של PSS מכיל rhodamine בריכוז סופי של 10 מ&quot;מ. רצף לרגש מדגם rhodamine עם p-Pol ו-S-Pol אור וללכוד את התמונות. בפועל, פליטת P ו-S מהאם הם מנורמלים לממוצע של P ופליטת rhodamine S. עיין בסעיפי ניתוח תמונה ודיון לקבלת פרטים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו תמשיך להכתמת תאי chromaffin שור עם עשיתי. יש לשטוף את התקשורת והתרבות מהמנה המכילה תאי chromaffin ולהחליף עם 2 מיליליטר של הבסיס-PSS. הוסף 10 μl של 10 מ&quot;מ עשה (בדילול מלא באתנול)ישירות לצלחת המכילה את התאים. בעדינות להתסיס מנה ל2-10 שניות ולהסיר את הפתרון + PSS עשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הצלחת 3-4x עם basal-PSS כדי להסיר כל שיורי עשו. התאים עכשיו הם מוכתמים ומוכנים לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של שמן טבילה לאובייקטיבי. מניחים צלחת המכילה תאי chromaffin עשה צבעוניים על גבי המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צופה בצלחת או דרך אובייקטיבי או על המצלמה, למצוא תא אשר transfected עם החלבון של עניין ומוכתם עם עשיתי. תא מוכתם היטב מציג פליטת P שבהירות מדגישה את הקצוות של התא; פליטת S צריכה להיות בערך אחידה על פני טביעת התא (כלומר באזור של התא, כי הוא דבק בזכוכית וצלם בTIRF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את מחט זלוף המקומית, כך שזה בערך 100 מיקרומטר הרחק מהתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בקרום התא ולהפעיל את חומרת פוקוס אוטומטי מייד לפני רכישת גירוי תא / תמונה. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין רכישת תמונה. תנקב תאים ל10 שניות עם פתרון בסיסי ולאחר מכן ל60 שניות עם 56 פתרון mM KCl depolarizing. לרכוש תמונות תוך shuttering במהירות בין 561 p-Pol ננומטר, ננומטר 561 s-pol (כדי לעקוב אחר שינויים בP ופליטת S של עשה) ועירור 488 ננומטר (לתמונת הבדיקה שלפוחית ​​transfected). דוגמאות לתמונות שנרכשו במהלך ניסויים מוצגות באיור 2 ואיור 3. </li></ol> 4. ניתוח תמונה חישובים לעיבוד תמונה ניתן לבצע עם ImageJ, אבל תסריטי ניצול בשפת תכנות גמיש כגון IDL או Matlab יכולים להגדיל את התפוקה באופן משמעותי ניתוח על ידי אוטומציה של המשימות. שני סוגים של תמונות חייבים להיות מחושבים כדי להשיג מידע טופולוגי מתמונות פליטת גלם -. P / S ו-P +2 S P / S מדווח על עיוותים קרום מקומיות תוך P +2 סכום S מדווח על צבע קרום הכולל באזור נתוןשל השדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את כל התמונות צריכים להיות מופחת רקע. בחר את ההחזר על ההשקעה מחוץ לתא, למדוד את עוצמת פיקסל הממוצעת בהחזר על ההשקעה, ולאחר מכן את הפחתת הערך שמכל הפיקסלים בערימת התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב P / S, יש לחלק כל מסגרת &quot;P&quot; פליטה על ידי המסגרת שלאחר מכן &quot;S&quot; הפליטה (פיקסל לפיקסל). P / S משתנה עם העוצמות היחסית של p-ו-S-Pol העירורים, הטיות ב מערכת אופטית, ושולי הפרעה. כדי להפחית את תופעות הללו, לנרמל את יחסי P / S ממתקבלים מפליטה עשתה ליחס שהתקבל בתמיסה המכילה 10 rhodamine מ&quot;מ 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Exocytosis של DCVs הפרט בא לידי ביטוי משינוי פתאומי בעוצמה של חלבון שלפוחית ​​ניאון, כגון Synaptotagmin-1 pHluorin (איור 2). להבחין בשינויים ב+2 S P / S ו-P על ידי ממוצעים של פיקסלים בהחזר על השקעת רדיוס 240 ננומטר מרוכז על עליות מקומיות בP / Sיחס באתרים של exocytosis. כאשר היתוך מתרחש ללא עלייה ניכרה בP / S, את ההחזר על ההשקעה היא מרוכז על האזור של DCV פיוזינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לבצע סימולציות מחשב כדי לפרש P / S ו-P +2 שינויי עוצמת קרום S במונחים של גיאומטריה פשוטה של נקבובית היתוך מתרחב. לפרטים של הסימולציות, אנא ראה Anantharam et al. 18 </li></ol>

<ol><li>Chernomordik, L. V., Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. Membranes of the world unite! Cell Biol. 175, 201-207 (2006).</li>
<li>Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+synaptotagmin+trigger+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">How does synaptotagmin trigger neurotransmitter release.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 615-641 (2008).</li>
<li>Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+and+its+role+in+membrane+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamin and its role in membrane fission.</a> Annu. Cell Dev. Biol. 16, 483-519 (2000).</li>
<li>Lang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-triggered+peptide+secretion+in+single+cells+imaged+with+green+fluorescent+protein+and+evanescent-wave+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ca2+-triggered peptide secretion in single cells imaged with green fluorescent protein and evanescent-wave microscopy.</a> Neuron. 18 (6), 857-863 (1997).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstman, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> Nature. 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Allersma, M. W., Wang, L., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+regulated+exocytosis+with+a+granule-membrane+probe+using+total+internal+reflection+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of regulated exocytosis with a granule-membrane probe using total internal reflection microscopy.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 4658-4668 (2004).</li>
<li>Toomre, D., Steyer, J. A., Keller, P., Almers, W., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+constitutive+membrane+traffic+with+the+cell+surface+observed+by+evanescent+wave+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fusion of constitutive membrane traffic with the cell surface observed by evanescent wave microscopy.</a> J. Cell Biol. 149, 33-40 (2000).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Heinemann, C., Chow, R. H., Neher, E., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+secretory+response+in+bovine+chromaffin+cells+following+flash+photolysis+of+caged+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the secretory response in bovine chromaffin cells following flash photolysis of caged Ca2.</a> Biophys. J. 67, 2546-2557 (1994).</li>
<li>Heidelberger, R., Heinemann, C., Neher, E., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dependence+of+the+rate+of+exocytosis+in+a+synaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal.</a> Nature. 371 (6497), 513-515 (1994).</li>
<li>Chow, R. H., Klingauf, J., Heinemann, C., Zucker, R. S., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+determining+the+time+course+of+secretion+in+neuroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanisms determining the time course of secretion in neuroendocrine cells.</a> Neuron. 16, 369-376 (1996).</li>
<li>Thompson, N. L., McConnell, H. M., Burhardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+in+supported+phospholipid+monolayers+detected+by+the+dichroism+of+fluorescence+excited+with+polarized+evanescent+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Order in supported phospholipid monolayers detected by the dichroism of fluorescence excited with polarized evanescent illumination.</a> Biophys. J. 46, 739-747 (1984).</li>
<li>Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+orientation+visualized+by+polarized+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence.</a> Biophys. J. 77, 2266-2283 (1999).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Feldman, M. E., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+membrane+marker+leaves+synaptic+vesicles+in+milliseconds+after+exocytosis+in+retinal+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A membrane marker leaves synaptic vesicles in milliseconds after exocytosis in retinal bipolar cells.</a> Neuron. 35, 1085-1097 (2002).</li>
<li>Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+plasma+membrane+deformations+reveals+pre-fusion+membrane+curvature+changes+and+a+role+for+dynamin+in+the+regulation+of+fusion+pore+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of plasma membrane deformations reveals pre-fusion membrane curvature changes and a role for dynamin in the regulation of fusion pore expansion.</a> J. Neurochem. , 10-1111 (2012).</li>
<li>Anantharam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+role+for+the+dynamin+GTPase+in+the+regulation+of+fusion+pore+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A new role for the dynamin GTPase in the regulation of fusion pore expansion.</a> Mol. Biol. Cell. 22, 1907-1918 (2011).</li>
<li>Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+TIRFM+reveals+changes+in+plasma+membrane+topology+before+and+during+granule+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Polarized TIRFM reveals changes in plasma membrane topology before and during granule fusion.</a> Cell Mol. Neurobiol. 30, 1343-1349 (2010).</li>
<li>Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+topological+changes+of+the+plasma+membrane+upon+exocytosis+visualized+by+polarized+TIRFM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell%22%5BJournal%5D)">Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM.</a> J. Cell. 188, 415-428 (2010).</li>
<li>Wick, P. W., Senter, R. A., Parsels, L. A., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+studies+of+secretion+in+bovine+chromaffin+cells+and+PC12+cells%3A+generation+of+kainate-sensitive+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transient transfection studies of secretion in bovine chromaffin cells and PC12 cells: generation of kainate-sensitive chromaffin cells.</a> J. Biol. Chem. 268, 10983-10989 (1993).</li>
<li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1248-1253 (2007).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca2%2B+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca2+ composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

TIRFM מבוסס קיטוב מזהה שינויים מהירים, submicroscopic בטופולוגיה הממברנה. יישום הטכניקה הוא פשוט יחסית, במיוחד אם אופטיקה TIRF כבר נמצא במקום. כל מה שצריך הוא צלחת רבע גל, שתי קוביות קיטוב, ותריסים על מנת להפריד בין נתיבי p-Pol ותאורת s-Pol. המיקום המדויק של רכיבים אלה על השולחן בדרך כלל מוכתב על ידי מקום פנוי. על מנת לקבל מידע טופולוגי קרום, הבדיקה הניאון משמשת צריכה intercalate עם נטייה קבועה או ידועה. הטכניקה, כפי שתוארה במאמר זה, מניחה את השימוש של צבעי carbocyanine אבל צבעים אחרים, כגון FM1-43 14, עשויים לשמש גם. ההליך מכתים הקרום עצמו הוא פשוט. תאים בתרבית רק דורשים חשיפה קצרה מאוד (פחות מ -10 שניות) לכמות קטנה של DiI / עשתה כדי לקבל תיוג צוהל של הממברנה. הוספת עודפי צבע מובילה לaggreg פיזור אוראטס על הזכוכית שמפחיתה את איכות תמונה. תאים דוגרים מעל עם צבע מוביל לצבוע את ההפנמה שבה יש השפעות מזיקות על איכות תמונה ואולי כדאיות תא. אם תא מוכתם היטב, יהיה הבחנה ברורה בתמונות פליטת P ו-S. כפי שניתן לראות באיור 2 א, פליטת P תהיה בבהירות להדגיש אזורים של הקרום שהם אלכסוניים coverslip (כלומר הקצוות של טביעת רגל התא) ואילו עוצמת פליטת S תהיה בערך אחידה על פני טביעת התא. אם הבחנה ברורה בין P ו-S אינה נראית לעין, אז זה אפשרי כי התא הוא דבק בצורה גרועה למצע או קרום התא הוא לא בריא, והתא אינו משמש לניסויים. המחקרים הקודמים שלנו מתארים pTIRFM מנוצלים DiI כמו חללית קרום הניאון. כאן, אנו מנצלים עשינו כי הוא מתאים לניסויי הדמיה כפול צבע שמעסיקים GFP / pHluorin כfluorophore האחר. אנו לרגש wi עשהה לייזר 561 ננומטר ולא לייזר 640 ננומטר (שהוא קרוב יותר לשיא העירור שלה), כי מלביני fluorophore במהירות רבה יותר ב640 ננומטר. למרות שליזר ננומטר 561 הוא על הזנב של עשה ספקטרום העירור פורסם של, קרינה הנפלטת ביעילות. יתרון נוסף של לייזר ננומטר 561 הוא שזה מרגש את שניהם DiI ועשה מה שמאפשר לנו להשתמש באותה התקנת קיטוב עבור שני הבדיקות. שים לב שהנטייה של fluorophore בקרום תשפיע על הפרשנות של טופולוגיה הממברנה. לדוגמא, אם fluorophore היה בכיוון עם הדיפולים המעבר שלה בניצב למישור הקרום (ולא מקביל, או כמעט במקביל, כפי שקורה עם DiI או לא), ואז אזורי קרום nonplanar יהיו בקלות רבה יותר מודגש על ידי S ולא פליטת P. יש לנו גם תיארו טכניקות לבידוד וelectroporation של תאי chromaffin יותרת הכליה שור. תא chromaffin השור הוא ים מצויןמודל ecretory. יש לו את היתרונות של להיות קל לשמור בתרבות, מגיבה למגוון רחב של secretogogues, ובעל שלפוחית ​​הפרשה גדולה שהם דמיינו בקלות עם מיקרוסקופ אור הקונבנציונלית. כדי לבטא חלבוני ניאון, תאי electroporated בהשעיה לפני ציפוי במנות תרבות שטופלה קולגן. מניסיוננו, יעילות ביטוי הוא הרבה יותר גבוה מאשר עם electroporation עם או Ca 2 +-phosphate או חומרים כימיים Lipofectamine. החסרון של electroporation הוא שזה דורש יותר תאים (כפי שרבים לא שרד את התהליך) וחומרים כימיים מסחריים יקרים. מסיבות שאינן ברורים לנו, לא כל קרום משלב עשה. בנוסף, רק חלק קטן של התאים בצלחת הם transfected. מציאת תאים שהם transfected והם מוכתמים גם עם לא יכולים להיות זמן רב ולכן אופטימיזציה של תנאים להכתמה וelectroporation הוא גם שווה את המאמץ. לסיכום, זהסעיף המלחמה מתארת ​​כיצד pTIRFM מיושם כדי לפקח על העיוותים קרום המהירה ומקומיות המתרחשות במהלך שילוב של שלפוחית ​​ליבה צפופה בתאי chromaffin שור. אמנם רק אחד יישום נדון, הטכניקה היא אידיאלית עבור חקר תהליכים ביולוגיים אחרים הכרוכות בשינויים בצורת קרום, כולל אנדוציטוזה, cytokinesis, ותנועתיות תא.

הביצוע הנכון של exocytosis דורש שינויים קיצוניים בצורת bilayer קרום להיות מתוזמרים בדיוק. לפני האיחוי, כיפוף מקומי של קרום הפלזמה תחת גרגיר מתרחש, בין שאר כדי להפחית את מחסום האנרגיה לאינטראקציה של bilayers. מאוחר יותר, כקרומים למזג, אזורים של עקמומיות גבוהה נוצרים ויש התייצבו. לבסוף, קרומים התמזגו חייבים להיות כפופים בכושר הראשוני שלהם להרחבת הנקבובית ההיתוך ולאפשר תוכן שחרורו 1. מכיוון שקרומים לבד צפויים לעבור שינויים דרמטיים ומתואם כאלה, חלבונים נחוצים כדי לתווך אירועים. אבל איך הם פועלים כדי להשפיע על שינויים בטופולוגיה הקרום במהלך תהליך ההיתוך נשאר מאוד שאלה פתוחה. מצוין במודלים חוץ גופית קיימות כדי להמחיש עקמומיות בממברנה. השימוש בEM שלילי כתם, למשל, לא היה חשוב לעיצוב מודלים מולקולריים הנוכחיים על מעשיהם של שני p הסחר העיקריroteins - synaptotagmin וdynamin (לביקורות, ראו צ&#39;פמן 2 וHenshaw 3). רוב מבחני של exocytosis בזמן אמת אינם מזהים עקמומיות באופן ישיר. במקום זאת, עקמומיות היא להסיק ממבחנים שידווחו על קינטיקה של שחרור lumenal מטען 4-8 או שינויים באזור קרום 9-11. PTIRFM מגשר על הפער בין in vivo ו במבחנה על ידי המאפשר מדידות של שינויים במיקרומורפולוגיה קרום ישירות, בזמן אמת. PTIRFM, במצב nonimaging, היה חלוץ ידי אקסלרוד ועמיתיו כדי למדוד את הכיוון של NPD-PE משולב בתוך קרום מודל 12. הטכניקה הייתה לאחר מכן להחיל לדמיין שינויים דינמיים בתאים חיים שכותרתו עם DiI וFM1-43 13-18. בpTIRFM, שני קיטובי שדה חלוף משמשים כדי לעורר בדיקה מוטבעת קרום ברצף: p-קיטוב (במישור של שכיחות) ו-S-קיטוב (בניצב למישור של שכיחות). לפני ההדמיה, הבדיקה - במקרה הזה, עשה - הוא הוסיף בקצרה למדיום תאי ומותר intercalate בקרום הפלזמה של התאים כדי להיחקר. באזורים שבם הקרום הוא nonparallel לcoverglass (כמו בלפרוע קרום או כניסה), האם יהיה גם nonparallel. לכן, אזורים כגון יהיו להתרגש על ידי אלומת p-Pol. קרן p-Pol פחות יעילה תלהיב עשתה באזורי קרום הבעיקר במקביל לcoverglass. תמונות יחס פיקסל לפיקסל (P / S) דיווח על הפליטה מעירור p-ו-S-Pol הרציף של האם ולכן יהיה דווקא להדגיש אזורים של עיוות בממברנה. בתאוריה, את תמונות יחס P / S רגישות אפילו זוויות קטנות של סטיית פלזמה קרום מcoverglass, עם משרעת של השינויים הצפויים על ידי סימולציות מחשב 18. תמונות P / S הן גם בלתי תלויות במרחק fluorophore ממשטח coverglass ו fluorophore המקומיריכוז. ריכוז fluorophore מקומי מסופק במקום על ידי תמונות שדיווחו על סכום פיקסל לפיקסל של פליטת P ו2 פעמים פליטת S (P +2 S). +2 מדידת S P רגישה לגיאומטריה המדויקת של הכניסה, עם כמה, שינוי קטן, או לא אפשרי. זה יכול להיות מוצג על ידי סימולציות מחשב שמעברי מודל של נקבובית היתוך מ( כלומר עם צוואר צר) מוקדם למדינה מאוחר יותר 16,18. P +2 S של שלפוחית ​​התמזגו מצורף קרום הפלזמה באמצעות צוואר צר (ועם יותר עשה קרוב לממשק) צפוי להיות גדול יותר, למשל, מזו של שלפוחית ​​התמזגו עם נקבוביות רחבות הרבה יותר (שבו האם נמצא בחלק הקלוש ביותר של שדה חלוף). במאמר זה, אנו דנים כיצד pTIRFM מיושם ומנוצלת ללימוד השינויים מהירים, מקומיים בצורת קרום המתרחשים במהלך התרחבות נקבובית היתוך. בעוד שרק יישום אחד הוא באופן מפורש discussed, השיטות הן להכליל את מגוון רחב של תהליכים בתא אחרים ביולוגיים שאופן ישיר או עקיף כרוך בשיפוץ בממברנה.

<table><tbody><tr><td>iXon3 EMMCD מצלמה</td><td>אנדור</td><td>897</td><td></td></tr><tr><td>IX81 מיקרוסקופ הפוך</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>מכלול קוביות מסנן רכוב בצד</td></tr><tr><td>43 סדרת Ar-Ion לייזר</td><td>CVI Milles גריוט לייזר אופטיקה</td><td>543-AP-A01</td><td>מתכוונן ל 488 ננומטר</td></tr><tr><td>ספיר 561 LP דיודה לייזר</td><td>קוהרנטי</td><td></td><td>561 ננומטר</td></tr><tr><td>סריקה Galvo מערכת מראה</td><td>Thorlabs</td><td>GVS102</td><td></td></tr><tr><td>VC3 מערכת זלוף מוקד ערוץ</td><td>ALA מכשירים מדעיים ALA</td><td>VC3X4PP</td><td></td></tr><tr><td>QMM קוורץ MicroManifold</td><td>ALA מכשירים מדעיים</td><td>ALA QMM-4</td><td></td></tr><tr><td>10 PSI מווסת לחץ</td><td>ALA מכשירים מדעיים ALA</td><td>PR10</td><td></td></tr><tr><td>מניפולטור</td><td>Burleigh</td><td>TS 5000-150</td><td></td></tr><tr><td>רכוב Achromatic רבע גל צלחת</td><td>Thorlabs</td><td>AQWP05M-600</td><td></td></tr><tr><td>420-680 ננומטר קוביית מפצל קרן מקטב</td><td>Thorlabs</td><td>PBS201</td><td></td></tr><tr><td>שש תחנות גלגל צפיפות ניטרלית</td><td>Thorlabs</td><td>FW1AND</td><td></td></tr><tr><td>מנוע צעד מונע SmartShutter</td><td>Sutter Instruments</td><td>IQ25-1219</td><td></td></tr><tr><td>HQ412LP מסנן דיכרואי</td><td></td><td>Chroma NC255583</td><td>מצטרף לקורות 488 ננומטר ו-561 ננומטר</td></tr><tr><td>עדשה פלנו-קעורה מצופה</td><td>אופטיקה אדמונד</td><td>PCV 100 מ"מ VIS 0</td><td>מתפצל 488 ננומטר קרן</td></tr><tr><td>מצופה עדשה פלנו-קעורה</td><td>אופטיקה אדמונד</td><td>PCV 250 מ"מ VIS 0</td><td>מתפצל קרן 561 ננומטר</td></tr><tr><td>מצופה עדשה פלנו-קמורה מצופה</td><td>אופטיקה אדמונד</td><td>PCX 125 מ"מ VIS 0</td><td>מתמקד בשתי הקורות</td></tr><tr><td>עדשה פלנו-קמורה מצופה</td><td>אופטיקה אדמונד</td><td>PCX 50 מ"מ VIS 0</td><td>מכלול קוביות מלט לסינון</td></tr><tr><td>z488/561rpc</td><td>כרואי כרואי כרומה</td><td>z488/561rpc</td><td>מסנן פילטר dichroic</td></tr><tr><td>z488/561_TIRF מסנן</td> פליטה <td>כרומה</td><td>z488/561m_TIRF</td><td>פליטת קוביות מסנן</td></tr><tr><td>UIS2 60x אובייקטיבי</td><td>אולימפוס</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td>NA 1.37</td></tr><tr><td>מערכת טרנספקציה ניאון</td><td>Invitrogen</td><td>MPK 5000</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת הדמיה MetaMorph</td><td>מכשירים</td> <td>מולקולריים</td><td></td></tr><tr><td>DiI ממברנה צבע</td><td>Invitrogen</td><td>V-22885</td><td>למטרות יישור</td></tr><tr><td>TH Liberase</td><td>Roche</td><td>5401135001</td><td></td></tr><tr><td>TL Liberse</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I Type IV מבקר</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>DiD ממברנה צבע</td><td>Invitrogen</td><td>D-7757</td><td></td></tr><tr><td>רודמין</td><td>Invitrogen</td><td>R634.22</td><td></td></tr> <tr><td>&mu; m ממברנה מזרק מסנן</td><td>יחידה Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite פוליכרומטי אדום מיקרוספירות</td><td>Polysciences</td><td>19507</td><td>0.5 מיקרון</td></tr><tr><td>שמן טבילה</td><td>סיגמא</td><td>56822</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Controlls galvo מראות</td></tr><tr><td>ספינר בקבוק</td><td>Bellco</td><td>1965-00250</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם ptirfm

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

כדי לקבל תובנה חדשות על הדינמיקה של exocytosis, הקבוצה שלנו מתמקדת בשינויים בצורת bilayer שומנים שחייבים להיות מוסדר דווקא בהיתוך של קרום שלפוחית ​​ופלזמה. שינויים מהירים ומקומיים אלה מושגים על ידי אינטראקציות דינמיות בין שומנים וחלבונים מיוחדים השולטים בעקמומיות בממברנה. היעדר אינטראקציות מסוג זה לא רק תוצאות הרסניות לאיחוי שלפוחית, אבל שורה של תפקודים תאיים אחרים המעורבות בשליטה של ​​צורת קרום. בשנים האחרונות, את זהותו של מספר החלבונים בעלי תכונות עיצוב קרום כבר נקבעה. מה שנותר חסר הוא מפת דרכים של מתי, איפה, ואיך הם מתנהגים כמו היתוך והתקדמות שחרורו תוכן. ההבנה של האירועים המולקולריים, המאפשרים שיפוץ קרום שלנו מבחינה היסטורית הייתה מוגבלת על ידי חוסר של שיטות אנליטיות, כי הם רגישים לעקמומיות הממברנה או שיש הפתרון הזמני לטראקk שינויים מהירים. PTIRFM מספק את שני הקריטריונים האלה. אנחנו דנים כיצד pTIRFM מיושם לדמיין ולפרש, שינויי submicron מהירים בכיוון של קרום תא chromaffin בשלפוחית ​​ליבה צפופה היתוך (DCV). תאי chromaffin אנו משתמשים מבודדים מבלוטת יותרת הכליה שור. הקרום מוכתם בצבע carbocyanine lipophilic, 1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3 &quot;, 3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4 chlorobenzenesulfonate, או עשה. עשה intercalates במישור הקרום עם אורינטציה &quot;קבועה&quot;, ולכן הוא רגיש לקיטוב של שדה חלוף. קרום התא עשה הצבעוני הוא ברצף נרגש עם קיטובים מאונך של לייזר 561 ננומטר (p-Pol, s-POL). לייזר 488 ננומטר משמש כדי לחזות מרכיבים וזמן שלפוחית ​​הרגע של היתוך. Exocytosis מופעל על ידי מקומי מרוססים תאים עם פתרון KCl depolarizing. ניתוח מתבצע במצב לא מקוון באמצעות תוכנה אישית בכתב כדי להבין איךשינויי עוצמת פליטה מתייחסים להתרחבות נקבובית היתוך.

שיטות הדמיה קונבנציונליות TIRFM ומקוטבות מיושמות על אותו שולחן האוויר. התצורה של האלמנטים אופטיים היא דומה, עם ההבדל העיקרי שאור העירור מקוטב (איור 1 א). אור מקוטב מעדיף מרגש fluorophores עם הדיפולים קליטה בכיוון הקיטוב. כך, pTIRFM להיות יעיל במעקב אחר שינויי טופולוגי קרום, הבדיקה המשמשת חייבת intercalate בקרום עם נטייה קבועה. צבעי carbocyanine הניאון (DiI, עשו) intercalate לbilayers שומנים באופנה עם אוריינטציה הדיפולים מעבר במטוס הקרום (איור 1). תאורה מקוטבת P (איור 1 ג) של קרומים עשו כותרת באופן סלקטיבי מרגשת fluorophores coverslip-אלכסוני (באדום באיורים 1B ו 1D). תיוג קרום שופע של תאי chromaffin מושגת לאחר abדגירה Rief עם עשיתי. איור 2 א מראה דוגמא של קרום תא, שהוא מוכתם כן. תא בריא, חסיד יפגין הבדלים ברורים בפליטות P ו-S. תמונת פליטת P תערוכות גבול תא בהיר ביחס לשאר תא. תמונת פליטת S תערוכות הקרינה אחידה פחות או יותר על פני טביעת התא. +2 תמונות S P פיקסל לפיקסל מחושב / S ו-P רגישות לעקמומיות הממברנה וריכוז צבע, בהתאמה. תא chromaffin הראה גם כבר transfected עם Synaptotagmin-1 pHluorin (Syt-1) לתווית שלפוחיות הפרשה (איור 2). תא chromaffin מגורה עם 56 מ&quot;מ KCl לdepolarize קרום התא ולגרום exocytosis. מספר מקומות Syt-1 pHluorin מאור ניאון פתאום יתברר כפתיל DCVs (איור 2, פנל מימין). קופסא לבנה מצוירת מסביב אירוע היתוך אחד (איור 2, פנל מימין). i אירוע היתוך זהs ניתח ב2C דמויות ו2D. איור 2C מראה שינויי מסגרת לפי המסגרת בSyt-1-pHluorin, P / S, ו-P +2 עוצמות תמונת S. עוצמת הקרינה של Syt-1 מפחיתה במהירות כמו החלבון מתמוסס ממקום ההיתוך (איור 2 ד). כניסת המייצגים מורכבת קרום שלפוחית ​​/ פלזמה התמזגו פוחתת בקצב איטי יחסית (הערה גרפים באיור 2 ד). האיור (2E איור) מתאר פרשנות אחת של מדידות אלה. העיוותים הקרום המהירה ומקומיות שמוצגים באיור 2 הן תוצאה של Ca 2 + זרם עורר גירוי. זו מוצגת באיור 3 א. תא chromaffin הוא transfected עם Ca 2 + המחוון הגנטי GCaMP5G 21,22 ומגורה עם 56 מ&quot;מ KCl. שלילת קוטביות קרום גורמת לעלייה משמעותית בקרינת GCaMP5G ( <stro<html> ng&gt; איורים 3 א ו 3 ב) מסמן עלייה בsubplasmalemmal 2 + רמות Ca. אזור פיקסל 30 x 20 של התא נבחר ושינויי מסגרת לפי המסגרת בGCaMP5G, P / S, ו-P +2 עוצמות פיקסל S מופיעים בתמונות (איור 3 ב) וגרפים (איור 3 ג). זמן &quot;0&quot; מציין את המסגרת לפני שינוי P / S הוא ברור (כלומר המסגרת לפני exocytosis). ראשי החץ הלבנים מעידים על כך שעיוות הקרום (העלייה בP / S) מלווה בירידה ב+2 פליטת S P. חלבון GCaMP5G cytosolic נשלל מהאזור על ידי DCV התמזגו. הערה גם הירידה הפתאומית בעצמת GCaMP5G בזמן 0 באיור 3 ג, פנל שמאלי. עליית תוחלת חיים ארוכת בP / S והירידה בS +2 P מציעים נקבובית היתוך שמרחיב לאט (איור 3D). / Files/ftp_upload/51334/51334fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. איורים לטכניקת pTIRFM. א) סכמטית לשילוב קונבנציונלי עם TIRF הדמיה מבוסס קיטוב מוצגת. צלחת רבע גל (QW) ממוקמת מול לייזר ספיר 561 ננומטר לקטב את קרן הלייזר באליפסות. קוביית קיטוב (PC1) משמשת להפרדה בין קיטובים למרכיבים אנכיים ליניארי (v) ואופקי (ח). הרכיבים האנכיים ואופקיים הפכו את p-Pol והקורות עירור s-pol, בהתאמה, על פני השטח TIR. נתיבי p-Pol ו-S-Pol מנופצים באופן עצמאי (S1 ו S2). הם recombined עם מראות וקובייה שנייה קיטוב (PC2.) הם מצטרפים לקרן 488 ננומטר (גם מוגף באופן עצמאי, S3) באמצעות אלמנט היגוי קרן בהיקף של מראה וnonpolarizing מראה dichroic (DC). עדשות (L) משמשות כדי להרחיב ולמקד את האלומות. קורות 488 ננומטר ו561 ננומטר בשילובם הובילו ליציאת תאורת צד של המיקרוסקופ באמצעות Galvanoמראות מטר (GM). הם מתמקדים למטוס בחזרה המוקד (BFP) של המטרה. תיוג פוטונים הנפלטים מfluorophores נלכדים במצלמת EMCCD מחוברת למחשב. ב &#39;) עשה מבוצע על ידי דוגרים בקצרה תאים עם הצבע ושטיפה שוב ושוב כדי להסיר את העודפים. עשיתי intercalates בקרום עם רגעי דיפול מעבר שלה פחות או יותר במישור הממברנה. C) אירוע האור המקוטב במישור של שכיחות (p-POL) יוצר שדה חלוף שהוא בעיקר מקוטב רגיל לממשק, כפי שמוצג. D) תאורה של קרום עשה שכותרתו עם אור מקוטב p סלקטיבי תלהיב אלה fluorophores כי הם coverglass-אלכסוני (באדום). אם זה היה שדה חלוף מקוטב של, אלה fluorophores שמקביל לcoverglass יהיה נרגש במקום (שחור). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51334/51334fig2.jpg" /> איור 2. </s<html> טרונג&gt; עיוותים קרום תא ניטור עם pTIRFM. א) תמונות פליטת הגלם P ו-S יחד עם מחושב P / S ו-P +2 תמונות פליטת S מוצגות. סרגל קנה מידה, 3.2 מיקרומטר. ב &#39;) תא chromaffin להביע Syt-1 pHluorin הוא depolarized עם KCl. מספר המקומות במאור ניאון (פנל מימין) מצביע על השילוב של DCVs הבודד. סרגל קנה מידה, 3.2 מיקרומטר. C) תמונות מסגרת לפי מסגרת של pHluorin DCV Syt-1 פיוזינג. פעמים (מעל תמונות) הן בשניות. זמן 0 מציין מסגרת לפני ההיתוך של DCV. +2 תמונות פליטת S P מקבילים / S ו-P מוצגות גם. . סרגל קנה מידה הוא 1 מיקרומטר D) גרפים עבור תמונות בקו ג המנוקד הוא בזמן - 0. מסגרת ההיתוך ה) פרשנות אפשרית אחת התוצאות ב-C ו-D מוצגת.<html> ריק &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51334/51334fig3.jpg" /> איור 3. עיוותים הן תוצאה של Ca 2 + זרם עורר גירוי. א) תא chromaffin transfected עם GCaMP5G הוא depolarized 56 מ&quot;מ KCl. גידול וכתוצאה מקרינת GCaMP5G מסמן עלייה בsubplasmalemmal Ca 2 + רמות. ב &#39;) תמונות מסגרת לפי מסגרת של 30 x 20 אזור פיקסל של תא בא טיימס מעל תמונות הן בשניות. ראשי חץ לבנים מצביעים על אזור של גידול P / S ו-P +2 ירידת S. חלבון Cytosolic GCaMP5G לא נכלל באזור על ידי DCV פיוזינג. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר. C) גרפים לתמונות שמוצגים בB. ד) פרשנות אפשרית אחת התוצאות בB ו-C מוצגת.3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מצלמה iXon3 EMMCD </td><td> אנדור </td><td> 897 </td><td></td></tr><tr><td> IX81 הפוך מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td></td><td> Filtercube עצרת צד רכוב </td></tr><tr><td> לייזר 43 הסדרה Ar-Ion </td><td> CVI אופטיקה לייזר Griot המיל </td><td> 543-AP-A01 </td><td> מתכונן ל488 ננומטר </td></tr><tr><td> ספיר 561 LP דיודת ליזר </td><td> קוהירנט </td><td></td><td> 561 ננומטר </td></tr><tr><td> מערכת סריקת מירור galvo </td><td> Thorlabs </td><td> GVS102 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת זלוף VC ערוץ 3 הפוקוס </td><td> ALA מכשירים מדעיים </td><td> ALA VC3X4PP </td><td></td></tr><tr><td> QMM קוורץ MicroManifold </td><td> ALA מכשירים מדעיים </td><td> ALA QMM-4 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> וסת לחץ 10 psi </td><td> ALA מכשירים מדעיים </td><td> ALA PR10 </td><td></td></tr><tr><td> מניפולטור </td><td> Burleigh </td><td> TS 5000-150 </td><td></td></tr><tr><td> פלייט הרובע-Wave רכוב Achromatic </td><td> Thorlabs </td><td> AQWP05M-600 </td><td></td></tr><tr><td> 420-680 ננומטר המקטב beamsplitter קובייה </td><td> Thorlabs </td><td> PBS201 </td><td></td></tr><tr><td> גלגל צפיפות שש תחנה ניטרלי </td><td> Thorlabs </td><td> FW1AND </td><td></td></tr><tr><td> SmartShutter צעד מנוע מונע </td><td> מכשירי סאטר </td><td> IQ25-1219 </td><td></td></tr><tr><td> סינון HQ412lp Dichroic </td><td> Chroma </td><td> NC255583 </td><td> מצטרף 488 ננומטר ו561 קורות ננומטר </td></tr><tr><td> מצופה Plano-קעור עדשה </td><td> אדמונד אופטיקה </td><td> 100mm PCV VIS 0 </td><td> סוטה 488 קרן ננומטר </td></tr> &lt;TR&gt; <td> מצופה Plano-קעור עדשה </td><td> אדמונד אופטיקה </td><td> 250mm PCV VIS 0 </td><td> סוטה 561 קרן ננומטר </td></tr><tr><td> מצופים Plano-קמורות עדשות </td><td> אדמונד אופטיקה </td><td> PCX 125mm VIS 0 </td><td> מתמקד הן הקורות </td></tr><tr><td> מצופים Plano-קמורות עדשות </td><td> אדמונד אופטיקה </td><td> 50mm PCX VIS 0 </td><td> ביצרו לסנן הרכבה קובייה </td></tr><tr><td> z488/561rpc Dichroic </td><td> Chroma </td><td> z488/561rpc </td><td> dichroic Filtercube </td></tr><tr><td> סינון z488/561_TIRF פליטה </td><td> Chroma </td><td> z488/561m_TIRF </td><td> פליטת Filtercube </td></tr><tr><td> מטרת UIS2 60x </td><td> אולימפוס </td><td> UPLSAPO 60XO </td><td> NA 1.37 </td></tr><tr><td> מערכת Transfection ניאון </td><td> Invitrogen </td><td> MPK 5000 </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph תוכנת הדמיה </td><td> התקנים מולקולריים </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> DiI ממברנה דיי </td><td> Invitrogen </td><td> V-22,885 </td><td> למטרות כיוונון </td></tr><tr><td> TH Liberase </td><td> רוש </td><td> 5401135001 </td><td></td></tr><tr><td> TL Liberse </td><td> רוש </td><td> 5401020001 </td><td></td></tr><tr><td> אני DNAse סוג IV משור </td><td> סיגמא </td><td> D5025 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> דיג </td><td> 0267110 </td><td></td></tr><tr><td> עשיתי ממברנה דיי </td><td> Invitrogen </td><td> D-7757 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine </td><td> Invitrogen </td><td> R634 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 מיקרומטר יחידת מסנן ממברנה מזרק </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite האדום מיקרוסכמות צבעוני </td><td> Polysciences </td><td> 19507 </td><td> 0.5 מיקרומטר </td></tr><tr><td> שמן טבילה </td&gt; <td> סיגמא </td><td> 56822 </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> מכשירים לאומיים </td><td></td><td> פקדי galvo מראות </td></tr><tr><td> ספינר צפחת </td><td> בלו </td><td> 1965-00,250 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלת 1. ציוד pTIRF מיקרוסקופית. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תוכן </td><td> Prep-PSS </td><td> Basal-PSS </td><td> Stim-PSS </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 145 מ&quot;מ </td><td> 145 מ&quot;מ </td><td> 95 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5.6 מ&quot;מ </td><td> 5.6 מ&quot;מ </td><td> 56 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> - </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> - </td><td> 2.2 מ&quot;מ </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 15 מ&quot;מ </td><td> 15 מ&quot;מ </td><td> 15 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td><td> 7.4 </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 2.8 מ&quot;מ </td><td> 5.6 מ&quot;מ </td><td> 5.6 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> העט סטרפטוקוקוס </td><td> 1x </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table> טבלה 2. זלוף ופתרונות הכנת תא chromaffin. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תוכן </td><td> Electroporating מדיה </td><td> ציפוי מדיה רגילה </td><td> 2x אנטיביוטי מדיה </td></tr><tr><td> 1x DMEM/F-12 </td><td> 1 מיליליטר / צלחת </td><td> 2 מיליליטר / צלחת </td><td> 1 מיליליטר / צלחת </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> 10% </td><td> 10% </td></tr><tr><td> ציטוזין Arabinofuranoside (CAF) </td><td> - </td><td> μl 1 / מיליליטר מ10 מלאי מ&quot;מ </td><td> - </td></tr><tr><td> פניצילין </td><td> - </td><td> 100 יחידות / מיליליטר </td&gt; <td> 200 יחידות / מיליליטר </td></tr><tr><td> סטרפטומיצין </td><td> - </td><td> 100 מיקרוגרם / מיליליטר </td><td> 200 מיקרוגרם / מיליליטר </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> - </td><td> 25 מיקרוגרם / מיליליטר </td><td> 50 מיקרוגרם / מיליליטר </td></tr></tbody></table> לוח 3. מדיה נייד chromaffin. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תוכן </td><td> TH-PSS </td><td> TL-PSS </td></tr><tr><td> Liberase TH </td><td> 2 מיליליטר </td><td> - </td></tr><tr><td> Liberase TL </td><td> - </td><td> 0.85 מיליליטר </td></tr><tr><td> Prep-PSS </td><td> 98.0 מיליליטר </td><td> 84.0 מיליליטר </td></tr><tr><td> DNase </td><td> 8.75 מ&quot;ג </td><td> 7.4 מ&quot;ג </td></tr></tbody></table> לוח 4. פתרונות TH-PSS וTL-PSS.

ההשתקפות הפנימית מוחלטת המבוסס על קיטוב מיקרוסקופ פלואורסצנטי (pTIRFM) מאפשר זיהוי של דינמיקת קרום תא בזמן אמת. מאמר זה מתאר את היישום של pTIRFM לחקר שיפוץ קרום במהלך exocytosis המוסדר. הטכניקה היא להכליל לתהליכים אחרים בביולוגיה של תא באופן ישיר או עקיף כרוך בשינויים בצורת קרום.

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

מטרתו של הליך זה היא להדגים כיצד מיושמת מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בהחזרה פנימית מלאה המבוססת על קיטוב, לצורך חקר עיצוב מחדש של ממברנות במהלך אקסוציטוזה מבוקרת. הדבר מושג תחילה על ידי וידוא כי האלמנטים האופטיים, דהיינו לוח רבע גל וקוביות מקטבות, ממוקמים נכונה כדי ליצור קיטובי עירור נפרדים של p ו-s. השלב השני הוא לוודא כי קרני ה-p וה-s הן קולינאריות, עוברות דרך הציר האופטי של המיקרוסקופ ומאירות את אותו חלק של שדה הראייה כאשר הן במצב של פלואורסצנציה בהחזרה פנימית מלאה או TIRF.בשלב הבא, התאים המיועדים לדימוג נצבעים בצבע carbo cyanide, die D, ומעוררים באמצעות גירויים דפולריזционных כדי להפעיל אקסוציטוזה. השלב הסופי הוא לכידת תמונות של וסיקולות ליבה צפופות (dense core vesicles) בתהליך התמזגות בזמן TIRF. בסופו של דבר, נעשה שימוש ב-P-T-I-R-F כדי לרכוש תמונות בזמן אמת למעקב אחר שינויים טופולוגיים בממברנה הנובעים מאקסוציטוזה של תאי כרומין.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון פירומטריה וקיבוליות ממברנה, הוא ש-ptro F מדווח על עקמומיות הממברנה, ובהמשך לכך על הרחבת נקב ההיתוך, באופן ישיר. החלק התלול ביותר של עקומת הלמידה בטכניקה זו הוא הלמידה הראשונית של יישור הקיטובים של עירור p ו-s, כך שיהיו קוליניאריים במסלולם לאורך הציר האופטי של המיקרוסקופ ויאירו את אותו חלק של שדה הדמיה. סוגיה שנייה שעולה לעיתים קרובות נוגעת לצביעת תאים, ובפרט למשך הזמן שבו יש לחשוף את התאים ל-dd ומה מגדיר תא שנצבע היטב לעומת תא שנצבע באופן לקוי.את הפרוצדורה תדגים TA square row, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, הפעילו את כל רכיבי המיקרוסקופ, הלייזרים והמחשבים, והפנו קרן מלייזר ה-488 nanometer למישור המוקד האחורי של עדשה בעלת מספר מפתח (numerical aperture) של 1.49. אם קרן הלייזר ממוקדת במישור המוקד האחורי, היא תצא כקרן מקבילה ותופיע כנקודה קטנה ומוגדרת היטב על התקרה, ישירות מעל העדשה.לאחר מכן, כוון את מראת הגלוונומטר X כך שקרן הלייזר תזוז מהציר ותצא מהעדשה בזוויות תלולות יותר ויותר ביחס לנורמל של העדשה. לאחר מכן, ודא כי הושגה החזרה פנימית מלאה או TIR. הוסף 10 µL של מיקרו-ספירות פלואורסצנטיות לנפח של 1 mL של תמיסת סליין פיזיולוגית ובצלחית בעלת תחתית זכוכית; רק פלואורסצנציה של מיקרו-ספירות הנמצאות בתחתית הצלחית, הקרובות ביותר לממשק ה-TIR, צריכה להתגלות.זיהוי של מיקרו-ספירות צפות מעיד על כך שהזווית בין האור הפוגע לנורמל של העדשה אינה מספיקה. עבור דימוי המבוסס על קיטוב, השתמש בקרן ה-488 nanometer המיושרת כמדריך וכוונן את מיקומה של קרן לייזר ה-561 nanometer הגולמית כך שתנוע במסלול אופטי זהה. לייזר ה-561 nanometer ישמש לדימוי של צבע ה-carbo cyanide.עדשה מפיזרת ומראות ממוקמות במורד זרימת קרן הלייזר של 561 ננומטר. באמצעות כפתורי הכיוון שעל המראות, כווננו את הקרן כך שתהיה במקביל לקרן של 488 ננומטר ושהנקודה תהיה ממוקדת על התקרה. כאשר מראות הגלוונומטר נמצאות בעמדת האפס, קוביית קיטוב מחזירה את הרכיב האנכי של השדה החשמלי ומעבירה את הרכיב האופקי.הוא ממוקם במורד הקרן בעלת הקיטוב האליפטי על במה קטנה להזזה. כדי להקל על כיוון הקיטוב העוקב, נתיבי הקרניים משתמשים בקוביה מקטבת שנייה ובמראות כדי לאחד מחדש את הקרניים. תריס ממוקם בין הקובייה המקטבת הראשונה לבין מראת הרכיב האנכי.תריס שני ממוקם בין המראה של הרכיב האופקי לבין קוביית הקיטוב השנייה. תריסים אלו נשלטים על ידי תוכנת הדימוג, המאפשרת למשתמש לבחור במהירות בין קיטובי קרן. השתמש במסנן קיטוב כדי לוודא את כיוון השדה החשמלי בכל נתיב קרן.מסנן קיטוב יאפשר העברה רק בקו התואם לציר המסנן. ודא שהרכיבים האנכיים והאופקיים של קרן הלייזר מיושרים זה עם זה ועם הקרן של 488 nanometer, ובצע התאמות במידת הצורך. שלוש הקרניים צריכות להיות ממוקדות על המישור המוקדי האחורי ולצאת מקבילות מהעדשה אל אותה נקודה על התקרה.ניתן לסמן נקודה זו ב-X כדי להקל על יישור עתידי. לאחר מכן, הניחו טיפה של שמן אימרסיה על העדשה. הניחו את הצלחת המכילה מיקרוספירות פלואורסצנטיות.על העדשה, הגו את ה-TIR על ידי הזזת מראת הגלוונומטר X בתוכנת הזזת המראות ב-TIR. הרכיב האנכי של קרן האור הוא קיטוב S והרכיב האופקי של קרן האור הוא כעת מרכז קיטוב P, לוח רבע גל או qw במסלול הקרן. מיד לאחר מפתח הלייזר, בחן כל שדה נעלם מקוטב עם דגימת מוט דומיני, שצפויה להיות מכוונת באופן אקראי.סובב את לוח ה-qw כדי להתאים לממוצעי עוצמת הפיקסלים. בודד תאי כרומין בריאים מבלוטת האדרנל של חתול כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, ספור את התאים באמצעות המוציטומטר והכן אותם לטרנספקציה. בצע טרנספקציה לתאים עם DNA המקודד לחלבון המבוקש באמצעות מערכת electroporation בהתאם להמלצות היצרן. הגדרות אלו מספקות את האיזון המיטבי בין יעילות הטרנספקציה לבין שיעור הישרדות התאים.עבור הכנה זו של תאי כרומין בקר, הגדרות המכשיר הן 1,100 וולט, 40 מילישניות, ופולס אחד. לאחר הטרנספקציה, זרע בעדינות את התאים על צלחות שעובדו עם פולי-ליזין וקולגן, ב-1 מיליליטר של מדיום אלקטרופורזה מחומם. הנח את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. הוסף 1 מיליליטר של מדיום אנטיביוטיקה בריכוז 2x לכל צלחת. לאחר שש שעות, החלף את המדיום למדיום רגיל למחרת.תאי Chromin מדויקים בדרך כלל 48 שעות עד חמישה ימים לאחר אלקטרופורציה באמצעות תוכנת start acquisition של מערכת הדימות. ודא שהלייזרים מיושרים. בדוק את פרופיל השדה האוונסנטי באמצעות מיקרוספירות.הכינו את מערכת הפרפוזיה הגלובלית והמקומית. נקו את מאגרי התמיסות במים דה-יוניים מסוננים ומלאו אותם בתמיסות סלין פיזיולוגיות בסיסיות ומעוררות. לפני הדמיות של תאי כרומין, ודאו כי העירור בקיטוב P ובקיטוב S מאיר את אותו אזור בשדה הראייה וכי עוצמות התאורה שקולות בקירוב, כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב.כעת עברו לצביעת תאי כרומה בקר באמצעות DD. שטפו את מצע התרבית מהצלחית המכילה את תאי הכרומין והחליפו אותו בשני מיליליטר של תמיסת סליין פיזיולוגית בסיסית. הוסיפו 10 µL של DD בריכוז 10 mM ישירות לצלחית המכילה את התאים. נערו בעדינות את הצלחית למשך שתיים עד 10 שניות לפני הסרת התמיסה.שטפו את הצלחת שלוש עד ארבע פעמים בתמיסת סליין פיזיולוגית בסיסית כדי להסיר שאריות של DD; התאים צבועים כעת ומוכנים לשימוש. הוסיפו טיפה של שמן אימרסיה לעדשה. הניחו את הצלחת המכילה תאי כרומין צבועים ב-Dai D מעל לעדשה.מקמו את מחט הפרפוזיה המקומית כך שתהיה במרחק של כ-100 microns מהתא. התמקדו בקרום התא והפעילו את חומרת המיקוד האוטומטי מיד לפני רכישת תמונות של גירוי התא. התחילו ברכישת תמונות, בצעו פרפוזיה לתאים למשך 10 seconds עם תמיסה בסיסית, ולאחר מכן למשך 60 seconds עם תמיסת KCl בריכוז של 56 millimolar הגורמת לדה-פולריזציה.רכשו תמונות תוך סגירה מהירה של התריס בין קיטוב P של 561 nanometer לקיטוב s של 561 nanometer כדי לנטר שינויים בפליטות p ו-s של DD ועירור של 488 nanometer. כדי לדמות את גשש השקיקים שעברו טרנספקציה, מושג סימון ממברנה שופע של תאי chromin לאחר דגירה קצרה עם Dai D. בדוגמה זו, ממברנת התא נצבעה היטב. תא דביק בריא יפגין הבדלים ברורים בפליטות p ו-s.תמונת פליטת ה-P מראה גבול תא בהיר יותר ביחס לשאר התא. תמונת פליטת ה-S מראה פלואורסצנציה אחידה בקירוב לאורך טביעת רגל התא, שחושבה פיקסל אחר פיקסל כ-P חלקי S ו-p פלוס שני s. התמונות רגישות לעקמומיות הממברנה ולריכוז הצבע, בהתאמה.תא ה-CHRO המוצג עבר גם טרנספקציה עם synaptojanin-1-GFP כדי לסמן שלפוחיות הפרשה. תא ה-CHRO מגורה באמצעות פוטסיום כלוריד כדי לדפולריז את ממברנת התא ולעורר אקסוציטוזה. מספר נקודות פלואורסצנטיות בהירות הופכות גלויות פתאום כאשר שלפוחיות בעלות ליבה צפופה מתמזגות.תיבה לבנה משורטטת סביב אירוע היתוך אחד. כדי לנתח אירוע היתוך זה פריים אחר פריים, נבחנו שינויים בעוצמת התמונה של Cit1-GFP, VS ו-P+2S. עוצמת הפלואורסצנציה של Cit1 פוחתת במהירות ככל שהחלבון מפעפף הרחק מאתר ההיתוך. השקע המייצג את קומפלקס ממברנת הפלזמה של הוסיקול שהתמזג פוחת בקצב איטי יחסית.איור זה מציג פרשנות אחת של מדידות אלה. העיוות המהיר והמקומי של הממברנה הוא תוצאה של זרימה של סידן שעוררה גירוי; דפולריזציה של הממברנה גורמת לעלייה משמעותית בفلואורסצנציית G Camp 5G, המעידה על עלייה ברמות הסידן התת-פלסמתיות. אזור של 30 על 20 פיקסלים של התא נבחר, ושינויים פריים-אחרי-פריים ב-G camp 5G PS ו-p plus two s.עצמות הפיקסלים מוצגות בתמונות ובגרפים. זמן אפס מציין את הפריים שלפני שינוי ניכר ב-PS. ראשי החיצים הלבנים מצביעים על כך שעיוות הממברנה מלווה בירידה בפליטת p plus two S.חלבון ה-G CAMP 5G הציטוזולי נדחק מהאזור על ידי הוסיקולת הליבה הצפופה הממוזגת. שימו לב גם לירידה הפתאומית בעוצמת ה-G camp 5G בזמן אפס. העלייה הממושכת ב-POS והירידה ב-p plus two s מרמזות על נקבובית מיזוג המתרחבת באיטיות, כפי שמוצג באיור.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבנות מערכת PTU F ולדמות תאים כדי לצפות בשינויים טופולוגיים בממברנה בזמן שהם ב-turf לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור שינויים בצורת הממברנה במהלך אקסוציטוזיס, אנדוציטוזיס, ציטוקינזה וניידות תאים בתאים חיים.

imaging-plasma-membrane-deformations-with-ptirfm

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים כיצד למדוד ליד קרום והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי בתרבית בתוך האסטרוציטים באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופיה epifluorescence.

מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים

השתקפות פנימית מוחלטת פלואורסצנטי (TIRF) מיקרוסקופיה היא גישה חזקה כדי לבחון מבנים סמוך לפני השטח של התא על ניגודיות גבוהה ורזולוציה הזמני. אנו מדגימים כיצד TIRF יכול להיות מועסק על מנת ללמוד על הדינמיקה חלבונים בקליפת המוח של קיר סגורים תאים תאים חיידקיים פטרייתי.

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

מאמר זה מספק שיטה לחקירת דינמיקת שלפוחית נוירוטרנסמיטר בתאי נוירובלסטומה, באמצעות מבנה synaptobrevin2-pHluorin ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. מדווחת גם האסטרטגיה שפותחה לעיבוד תמונה וניתוח נתונים.

TIRFM וGFP-בדיקות pH רגיש להערכת נוירוטרנסמיטר שלפוחיות Dynamics בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה: הדמיה נייד וניתוח נתונים

אנו מתארים פרוטוקול להכנת שכבות דו-שכבתיות ליפידים נתמכות ואפיונו באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי וספקטרוסקופיית כוח.

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

PI (4,5) P 2 מסדיר פונקציות סלולריות שונות, אך הארגון ננו שלה בקרום פלזמת התא הוא הבין היטב. על ידי PI תיוג (4,5) P 2 עם בדיקה ניאון כפול צבע התמזגו תחום Pleckstrin הומולוגיה, אנו מתארים גישה חדשנית ללמוד את PI (4,5) P 2 הפריסה המרחבית בקרום פלזמה ב ננומטר סולם .

הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות

תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע ניתוח כמותי של הרמה של התאחדות קרום פלזמה מתויג fluorescently חלבונים הקשורים באופן עקיף. השיטה מבוססת על פירוק חישובית של קרום ומרכיב cytoplasmic של האות נצפו תאים עם תוויות עם סמן פלורסנט קרום פלזמה.

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

מקרופינוציטוזה היא תהליך אנדוציטי שמור מאוד שהחל על ידי היווצרות של הקרנות ממברנה דמויות יריעות F-אקטין, הידועות גם בשם קפלים ממברנה. שיעור מוגבר של הפנמה מקרופינוציטוטית של מומסים היה מעורב במצבים פתולוגיים שונים. פרוטוקול זה מציג שיטה לכימות היווצרות קפלים בקרום במבחנה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

הדמיה של היווצרות קפלים בממברנה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת

אנו מציגים פרוטוקול ליישום מיקרוסקופיה של השתקפות הפרעות ומיקרוסקופיה כוללת-פנימית-השתקפות-פלואורסצנטית להדמיה בו-זמנית של מיקרו-טובולים דינמיים וחלבונים הקשורים למיקרו-טובולים המסומנים באופן פלואורסצנטי.

השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ TIRF כדי לעקוב אחר תעלות יונים בודדות ולקבוע את פעילותן בקרומי שומנים נתמכים, ובכך להגדיר את יחסי הגומלין בין תנועת הממברנה הצידית לתפקוד הערוץ. הוא מתאר כיצד להכין את הממברנות, לרשום את הנתונים ולנתח את התוצאות.

הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

שיטת הניקור התרמופלסמוני משלבת מיקרוסקופ קונפוקלי, פינצטה אופטית וננו-חלקיקי זהב כדי לחקור תגובות חלבונים במהלך תיקון קרום פלזמה בתאים ובועיות חד-למלריות ענקיות. הטכניקה מאפשרת ניקוב מהיר ומקומי של הממברנה, ומאפשרת זיהוי חלבוני מפתח ותפקידם הפונקציונלי במנגנון המורכב לתיקון קרום הפלזמה.

גישה תרמופלסמונית לחקר תיקון קרום פלזמה בתאים חיים וקרומי מודל

למדו את שיטת pTIRFM לזיהוי דינמיקת ממברנות בתאים בזמן אמת. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר עיוותי ממברנה במהלך אקסוציטוזה ומספקת כלי עוצמתי לחקר ביולוגיית התא.

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

גלה סרטונים נוספים