הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

ההשתקפות הפנימית מוחלטת המבוסס על קיטוב מיקרוסקופ פלואורסצנטי (pTIRFM) מאפשר זיהוי של דינמיקת קרום תא בזמן אמת. מאמר זה מתאר את היישום של pTIRFM לחקר שיפוץ קרום במהלך exocytosis המוסדר. הטכניקה היא להכליל לתהליכים אחרים בביולוגיה של תא באופן ישיר או עקיף כרוך בשינויים בצורת קרום.

מטרת הליך זה היא להראות כיצד מיושמת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת מבוססת קיטוב לחקר שיפוץ הממברנה במהלך אקסוציטוזיס מוסדר. זה מושג על ידי הבטחה תחילה שאלמנטים אופטיים, כלומר לוח רבע גל וקוביות קיטוב ממוקמים נכון כדי ליצור קיטוב עירור p ו-s בדידים. השלב השני הוא לוודא שאלומות ה-p וה-s הן קולין עוברות דרך הציר האופטי של המיקרוסקופ ומאירות את אותו חלק של שדה הצפייה כאשר הן בהשתקפות פנימית כוללת פלואורסצנטית או TIRF.

לאחר מכן, התאים שיש לצלם מוכתמים במות הקרבו ציאניד, מתים D ומגורים בגירוי דה-פולריזציה כדי לעורר אקסוציטוזיס. השלב האחרון הוא לצלם תמונות של היתוך שלפוחיות ליבה צפופות בזמן TIRF. בסופו של דבר, P-T-I-R-F משמש לרכישת תמונות בזמן אמת כדי לנטר את השינויים הטופולוגיים של הממברנה הנובעים מאקסוציטוזיס של תאי כרומין.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו פירומטריה וקיבול ממברנה, הוא ש-ptro F מדווח על עקמומיות הממברנה ועל ידי הרחבת יציאת היתוך ישירות. החלק התלול ביותר של עקומת הלמידה בטכניקה זו הוא תחילה ללמוד ליישר את קיטוב העירור p ו-s, כך שהם עוברים דרך הציר האופטי של המיקרוסקופ ומאירים את אותו חלק של שדה ההדמיה. סוגיה שנייה שעולה לעתים קרובות נוגעת לצביעה של תאים, כלומר כמה זמן לחשוף תאים ל-dd ומה מהווה תא צבוע היטב לעומת תא צבוע בצורה גרועה.

שתדגים את ההליך תהיה TA Square Row, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל להפעיל את כל רכיבי המיקרוסקופ, לייזרים ומחשבים מכוונים קרן מהלייזר של 488 ננומטר למישור המוקד האחורי של עדשת הצמצם המספרי של 1.49. אם קרן הלייזר ממוקדת במישור המוקד האחורי, היא תצא, תיאסף ותופיע כנקודה קטנה ומוגדרת היטב על התקרה ישירות מעל המטרה.

לאחר מכן כוונן את מראה הגלוונומטר X כך שקרן הלייזר תזוז מהציר ותצא מהמטרה בזוויות תלולות יותר ויותר לנורמלי האובייקטיבי. לאחר מכן, ודא כי הושגה השתקפות פנימית מוחלטת או TIR. הוסף 10 מיקרוליטר של מיקרוספירות פלואורסצנטיות לנפח מיליליטר אחד של תמיסת מלח פיזיולוגית ויש לזהות צלחת תחתית זכוכית רק פלואורסצנטיות ממיקרוספירות בתחתית הכלי הקרוב ביותר לממשק TIR.

זיהוי מיקרוספירות צפות מצביע על כך שהזווית בין האור הפוגע לנורמלי האובייקטיבי אינה מספקת. להדמיה מבוססת קיטוב, השתמש בקרן 488 ננומטר מיושרת כמדריך והתאם את המיקום של קרן הלייזר הגולמית של 561 ננומטר כך שהיא נעה לאורך נתיב אופטי זהה. הלייזר של 561 ננומטר ישמש להדמיה של צבע הקרבו ציאניד.

עדשה ומראות מתפצלות נמצאות במורד הזרם של לייזר 561 ננומטר. בעזרת כפתורי הכוונון במראות, כוונן את הקורה כך שהיא תהיה מיושרת עם הקורה של 488 ננומטר והנקודה תהיה ממוקדת בתקרה. כאשר מראות הגלוונומטר נמצאות במצב אפס, קוביית קיטוב משקפת את הרכיב האנכי של השדה החשמלי ומעבירה את הרכיב האופקי.

הוא ממוקם במורד הזרם של הקרן המקוטבת אליפטית על שלב תרגום קטן. כדי להקל על יישור הקיטוב לאחר מכן, נתיבי אלומה משתמשים בקוביית קיטוב שנייה ובמראות כדי לשלב מחדש את הקורות. תריס ממוקם בין קוביית הקיטוב הראשונה למראה הרכיב האנכי.

תריס שני ממוקם בין מראה הרכיב האופקי לקוביית הקיטוב השנייה. תריסים אלה נשלטים על ידי תוכנת ההדמיה ומאפשרים למשתמש לבחור במהירות בין קיטוב אלומה. השתמש במסנן מקטב כדי לאמת את כיוון השדה החשמלי בכל נתיב אלומה.

מסנן מקטב יאפשר שידור רק בקו אחד עם ציר המסנן. ודא שהרכיבים האנכיים והאופקיים של קרן הלייזר מיושרים זה עם זה ועם קרן 488 ננומטר, בצע התאמות לפי הצורך. שלוש הקורות צריכות להיות ממוקדות כולן במישור המוקד האחורי ולצאת מהמטרה לאותה נקודה בתקרה.

ניתן לסמן נקודה זו ב-X כדי להקל על יישור עתידי. לאחר מכן, הניחו טיפת שמן טבילה על המטרה. מניחים את הכלי המכיל מיקרוספירות פלורסנט.

במטרה, הזן TIR על ידי הזזת מראה הגלוונומטר X בתוכנת הזזת המראה ב-TIR. המרכיב האנכי של הקרן הוא קיטוב S והמרכיב האופקי של הקרן הוא כעת מרכז הקיטוב P, לוח רבע גל או qw בנתיב האלומה. מיד במורד הזרם של צמצם הלייזר צפו בכל שדה חולף מקוטב עם דגימת דומין מוט, שצפויה להיות מכוונת באופן אקראי.

סובבו את לוח ה-qw כך שיתאים לעוצמות הפיקסלים הממוצעות. בודדו תאי כרומין בריאים מבלוטת יותרת הכליה של החתול כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ספרו תאים באמצעות ציטומטר המו והתכוננו לטרנספקציה של תאי טרנספקט עם DNA המקודד את החלבון המעניין באמצעות מערכת האלקטרופורציה בהתאם להמלצות היצרן. ההגדרות המספקות את האיזון הטוב ביותר בין יעילות טרנספקציה לשיעור הישרדות התאים.

להכנה זו של תאי כרום בקר הם 1, 100 וולט, 40 אלפיות השנייה, ופולס אחד לאחר תאי צלחת טרנספקציה בעדינות על כלים שטופלו בפולי דה ליצין וקולגן במיליליטר אחד של מצעד אלקטרו מחומם. מניחים את הכלים בחממה של 37 מעלות צלזיוס. הוסף מיליליטר אחד של שני x חומר אנטיביוטי לכל מנה לאחר שש שעות, החלף את המדיה למדיה רגילה למחרת.

תאי כרומין מצולמים בדרך כלל 48 שעות עד חמישה ימים לאחר אלקטרופורציה עם מערכת ההדמיה בתוכנת הרכישה ההתחלתית. ודא שהלייזרים מיושרים. בדוק פרופיל שדה חולף באמצעות מיקרוספרות.

הכן את מערכת השפע העולמית והמקומית. נקו את מאגרי התמיסה במים נטולי יונים מסוננים ומלאו בתמיסות מלח פיזיולוגיות בסיסיות ומגרות. לפני הדמיה, תאי כרומין מוודאים כי קיטוב P ועירור קיטוב S מאירים את אותו אזור בשדה הצפייה וכי עוצמות התאורה שוות ערך בערך כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

כעת המשך לצבוע תאי כרומה בקר עם DD.שטוף את אמצעי התרבית מהצלחת המכילה את תאי הכרום והחלף בשני מיליליטר של תמיסת מלח פיזיולוגית בסיסית. הוסף 10 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי DD ישירות לצלחת המכילה את התאים. מערבבים בעדינות את המנה במשך שתיים עד 10 שניות לפני הסרת התמיסה.

שטפו את הכלי שלוש עד ארבע פעמים בתמיסת מלח פיזיולוגית בסיסית כדי להסיר שאריות DD, התאים מוכתמים כעת ומוכנים לשימוש. הוסף טיפת שמן טבילה למטרה. מניחים את הכלי המכיל תאי כרום מוכתמים Dai D על גבי המטרה.

מקם את מחט הזלוף המקומית כך שתהיה במרחק של כ-100 מיקרון מהתא. התמקד בקרום התא והפעל את חומרת המיקוד האוטומטי מיד לפני רכישת תמונת גירוי תאי. התחל ברכישת תאי החדרה למשך 10 שניות עם תמיסה בסיסית, ולאחר מכן למשך 60 שניות עם תמיסת אשלגן כלורי 56 מילי-מולרית דה-פולריזציה.

רכוש תמונות תוך סגירה מהירה בין קיטוב P של 561 ננומטר לקיטוב של 561 ננומטר s כדי לנטר שינויים בפליטות p ו-s של DD ועירור של 488 ננומטר. כדי לדמות את בדיקת השלפוחית המועברת תיוג ממברנה שופעת של תאי כרום מושג לאחר דגירה קצרה עם דאי D.In דוגמה זו, קרום התא מוכתם היטב. תא דבק בריא יציג הבדלים ברורים בפליטות p ו-s.

תמונת פליטת הזרחן מציגה גבול תא בהיר יותר ביחס לשאר התא. תמונת פליטת ה-S מציגה פלואורסצנטיות אחידה בערך על פני טביעת הרגל של התא, מחושבת פיקסל לפיקסל P על פני S ו-p ועוד שני s. התמונות רגישות לעקמומיות הממברנה ולריכוז הצבע בהתאמה.

ה-CHRO והתא המוצגים הועברו גם הם עם סינאפ OIN פלורין אחד לסימון שלפוחיות הפרשה. ה-CHRO והתא מגורים עם אשלגן כלורי כדי לדה-פולריזציה של קרום התא ולעורר אקסוציטוזיס. מספר כתמים פלואורסצנטיים בצדק מתגלים לפתע כאשר שלפוחיות ליבה צפופות מתמזגות.

קופסה לבנה מצויירת סביב אירוע היתוך אחד כדי לנתח את אירוע ההיתוך הזה מסגרת אחר מסגרת נבדקו עוצמות תמונה אחת של פלורין po VS ו-p ועוד שתי עוצמות תמונה. עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של CIT 1 פוחתת במהירות כאשר החלבון מתפזר הרחק מאתר ההיתוך. הכניסה המייצגת את קומפלקס קרום הפלזמה של השלפוחית המאוחה פוחתת בקצב איטי יחסית.

איור זה מתאר פירוש אחד למדידות אלה. עיוות הממברנה המהיר והמקומי הוא תוצאה של דפולריזציה של ממברנת זרם סידן מעוררת גירוי גורמת לעלייה משמעותית בקרינה G Camp 5G המסמלת עלייה ברמות הסידן התת-פלזמליות. אזור של 30 על 20 פיקסלים של התא נבחר ושינויים מסגרת אחר מסגרת ב-G camp 5G PS ו-p ועוד שני s.

עוצמות פיקסלים מוצגות בתמונות ובגרפים. פעמים אפס מציין את המסגרת לפני שנראה שינוי ב-PS. ראשי החצים הלבנים מצביעים על כך שעיוות הממברנה מלווה בירידה בפליטת p ועוד שני S.

החלבון הציטוזולי G CAMP 5G אינו נכלל באזור על ידי שלפוחית הליבה הצפופה הממוזגת. שימו לב גם לירידה הפתאומית בעוצמת G camp 5G לפעמים אפס. העלייה ארוכת הטווח ב-POS והירידה ב-p ועוד 2 s מרמזת על נקבוביות היתוך שמתרחבות לאט כפי שמוצג באיור.

כאן לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות מערכת PTU F ותאי תמונה כדי לצפות בשינויים טופולוגיים של הממברנה בזמן הדשא לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור שינויים בצורת הממברנה במהלך אקסוציטוזיס, אנדוציטוזיס, ציטוקינזיס ותנועתיות תאים בתאים חיים.