לשון אלקטרונית יצירת דפוסי הכרה רציפה לניתוח חלבון

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבנות לשון אלקטרונית המבוססת על גישה קומבינטורית ולבצע הדמיית פלזמה ותהודה על פני השטח לניתוח חלבונים. זה מושג על ידי שימוש בלקטוז ולקטוז גופרתי כאבני בניין והנחת התערובות שלהם על משטח הזהב של פריזמה להרכבה עצמית ליצירת מערך של קולטנים קומבינטוריים צולבים. כמשטח שלב שני, מיושמת הדמיית פלזמה ותהודה, המנטרת אירועי קשירה בזמן אמת ומייצרת תמונות SPR וסדרה של עקומות קשירה קינטיות הנקראות חיישן גרם.

עיבוד הנתונים הבא מתבצע על סמך גרמי החיישן באמצעות תוכנת מחשוב מתמטית על מנת ליצור פרופיל אבולוציה רציפה דו-ממדית ונוף אבולוציה רציפה תלת מימדית עבור כל דגימה, התוצאות מראות שהלשון האלקטרונית מסוגלת ליצור נופי אבולוציה רציפה תלת מימדיים מובהקים עבור חלבונים מטוהרים נפוצים, ויעילה להבחנה שלהם על סמך זיהוי דפוסים. לטכניקה זו מספר יתרונות על פני שיטות קיימות כמו גנוסיס אלקטרוני קלאסי ולשונות. ראשית, הכנת קולטני השירה מפושטת במידה רבה.

מגוון גדול של קולטנים צולבים יכולים לבחור על ידי ערבוב מספר קטן של מולקולות. שנית, הודות לגישה הקומבינטורית, דפוסי הזיהוי שנוצרים על ידי הלשון האלקטרונית שלנו יכולים להיחשב רציפים, כך שניתן לזהות אותות חריגים ביתר קלות. לכן, ניתן להשיג ניתוח אמין יותר להכנת מערך הקולטנים הצולבים הקומבינטוריים.

ראשית, נקו את משטח הזהב של המנסרה 48 שעות לפני השימוש עם מנקה פלזמה למשך שלוש דקות בהספק של 75% חמצן, 25% ארגון, 0.6 מיליבר ו-40 וואט. לאחר מכן הכינו 100 מיליליטר של תמיסת חיץ פוספט המכילה 10% גליצרול או PBSG. הוספת גליצרול ל-PBS חשובה מאוד להפחתת אידוי הממס ושינויים באבן הבניין או בריכוז ה-BBB לאחר השקיעה.

לאחר מכן הכינו תמיסות מלאי של לקטוז או אבן בניין אחת ולקטוז גופרתי, או אבן בניין שתיים מתמיסות המלאי. הכן 11 תמיסות טהורות ומעורבות עם יחסים בין אפס ל-100% במרווחים של 10% וריכוז כולל של אבני בניין של 0.1 מילי-מולר ב-PBSG הפקידו שמונה טיפות ננוליטר של תמיסות טהורות ומעורבות אלה על פני המנסרה באמצעות ספוטר ללא מגע בשכפול מרובע לכל יחס עם 44 נקודות בסך הכל הניחו את המנסרה בתוך צלחת פטרי המכילה מיליליטר אחד של מים טהורים במיוחד והשאירו אותה למשך הלילה טמפרטורת החדר להרכבה עצמית של BB one ו-BB two על משטח הזהב כאן. ההנחה היא שהרכב פני השטח הממוצע בחד-שכבות המעורבות בהרכבה עצמית משקף את הרכב התמיסה המעורבת של התצהיר.

למחרת, שטפו היטב את המנסרה במים טהורים במיוחד לפני ייבושה תחת זרימה של ארגון. הגדר את החממה שבה פלזמת פני השטח ומנגנוני הדמיית התהודה ממוקמים ב-25 מעלות צלזיוס כדי למנוע שינויים במקדם השבירה הנגרמים על ידי שינוי טמפרטורה במהלך חישת חלבון. הכנס מנסרת שטיפה לא מתפקדת בתא הזרימה של 10 מיקרוליטר פוליאתר קטון המחובר למשאבת מזרק מבוקרת מחשב, מסיר ושסתום הזרקה בלחץ בינוני עם שש יציאות.

מלאו את מערכת הזרימה במאגר ריצה מסוננים טריים וערימות דגה. הסר את מנסרת השטיפה והכנס את המנסרה המכילה את מערך הקולטנים הצולבים המשולב בערימות ריצת תאי הזרימה בקצב זרימה של 100 מיקרוליטר לדקה. בעזרת מצלמת ה-CCD, הסר את כל בועות האוויר הקיימות על משטח המנסרה על ידי העברת מאגר פועל.

הגדר במהירות את אזור המחקר עבור כל נקודה על ידי ציור עיגול בקוטר זהה לאזור העניין על סמך תמונה מנוגדת היטב של המערך, ובעזרת תוכנה משולבת במערכת הדמיית הפלזמה והתהודה של פני השטח, עקומות פלזמה עקבות, המייצגות עקומות רפלקטיביות כפונקציה של זווית האירוע עבור כל הכתמים. בחר את זווית העבודה, שהיא המיקום שבו יירשמו עקומות קינטיות בשיפוע הגבוה ביותר של עקומות הרפלקטיביות. סובב את מראת הסריקה כדי לתקן את זווית העבודה שנבחרה למדידות קינטיות.

המשך להריץ ערימות דרך מערכת הזרימה עד שאות ההשתקפות עבור כל הכתמים יציב וקבוע. לאחר מכן השתמש במזרק כדי להזריק מיליליטר אחד של לקטין בוטנים או תמיסת HL לתוך לולאת הדגימה של 500 מיקרוליטר עם שסתום ההזרקה במצב העומס כאשר קצב הזרימה מוגדר ל-100 מיקרוליטר לדקה, הכנס את שסתום ההזרקה למצב ההזרקה. התחל מדידות קינטיות על ידי ניטור וריאציות רפלקטיביות מול הזמן בו זמנית על כל הנקודות בסוף הזרקת החלבון.

שטפו את המערך עם מאגר פועל למשך שמונה דקות. לבסוף, הזריק מיליליטר אחד של 1% DS כדי ליצור מחדש את המערך. חזור על אותו הליך עבור החלבונים האחרים לאחר כניסת תמיסת החלבון לתא הזרימה.

קשירה מולקולרית מתרחשת וגורמת לשינוי של עקומות הפלזמה ולוריאציה של רפלקסיביות. תוכנת רכישת התמונות ממירה את ערכי עוצמת האור הנמדדים לרמות בקנה מידה אפור, מעניקה תמונות SPR ויוצרת את השונות של רפלקטיביות לעומת זמן המעניקה גרמים של חיישנים. לאחר מכן, השתמש בתוכנת מחשוב מתמטית כדי לשרטט את הרפלקטיביות בסוף כל הזרקת חלבון לעומת יחס אבני הבניין כדי ליצור פרופיל אבולוציה רציפה דו-ממדי עבור כל דגימה.

לבסוף, הוסף את יחס אבני הבניין לגרמים של החיישן כדי ליצור דפוס זיהוי רציף תלוי זמן הנקרא נוף אבולוציה רציפה תלת מימדית עבור כל חלבון כדי לחקור את יכולת הלשון האלקטרונית לניתוח חלבון משותף, שלושה חלבונים שימשו מיוגלובין HL וליזוזים עבור כל חלבון. פרופיל אבולוציה רציפה דו-ממדי מובהק נוצר על ידי הלשון האלקטרונית כפי שמוצג בתלת מימד. נופי אבולוציה מתמשכת נוצרו גם עבור מיוגלובין HL וליזוזים.

הלשון האלקטרונית רגישה למאפייני פני השטח של החלבונים, כגון התפלגות שאריות חומצות אמינו הידרופוביות, ניטרליות וטעונות. פרופילי האבולוציה הרציפה המתקבלים של נופים יכולים לשמש כטביעות אצבע להבחנה יעילה של חלבונים וזיהוי פרוספקטיבי המבוסס על זיהוי דפוסים. בעת ניסיון גישה זו, חשוב לזכור לעקוב אחר נהלי הניסוי המותאמים והסטנדרטיים על מנת להבטיח שחזור טוב של הלשון האלקטרונית.

הליכים אלה כוללים משטח נקי וטוב של הפריזמה, בחירת זווית העבודה להדמיית תהודה פלזמה על פני השטח, ויישום פתרון מתאים לחידוש המערכת לחלוטין לשימוש חוזר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות את הלשון האלקטרונית על סמך גישת COMBINATOR והדמיית תהודה פלזמה SOFA לניתוח חלבונים. בהצלחה לניסויים שלך.