בנייה מבוססת תאים נוירוטרנסמיטר פלורסנט Engineered כתבים (CNiFERs) עבור זיהוי אופטי של נוירוטרנסמיטורים

המטרה הכללית של סרטון זה היא לתאר את המתודולוגיה לבנייה ובדיקה של דווחים פלואורסצנטיים של מוליכים עצביים מבוססי-תאים, או CNiFERs, אשר ניתן להשתמש בהם לניטור אופטי של שחרור מוליכים עצביים ספציפיים in vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח במדעי המוח הנוגעות לעיתוי ולשחרור של נוירומודולטורים במוח. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להתאימה לכל סוג של מוליך עצבי או נוירומודולטור, המאותת דרך GPCS.

הדגמה אזורית של שיטה זו היא מועילה. ההזרקה in vivo והדימיון העוקב של CNiFERs מאתגרים מבחינה טכנית. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, ראו את תאי HEK293 המכילים את גלאי הסידן מבוסס הפרונט ואת ה-g protein הכימרי בבקראת T-25.

לאחר מכן, גדלו את התאים באינקובטור עם לחות, בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2, עד להגעה לכ-50% התלכדות (confluent). לאחר מכן, שאבו את המצע מבקבוק ה-T-25. הוסיפו 2 mL של תערובת מצע ה-lenta virus, והדגירו את בקבוק ה-T-25 בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2.

ביום למחרת, קצרו את תאי ה-HEK293 המודבקים על ידי הוספה של מיליליטר אחד של trypsin. לאחר מכן, השעו מחדש את משקע התאים בחמישה מיליליטרים של מצע גידול עבור HEK293. זרעו מיליליטר אחד של תאים בבדיל T-75 לצורך הקפאה ואחסון, ו-1.5 מיליליטר של תאים בבדיל T-25 לצורך ניתוח FACS.

עבור עקומת האגוניסט בעלת 10 נקודות, לבדיקת התאים המודבקים, זרע את שתי השורות הראשונות של פלטת 96 בארות מצופה בפיברונקטין עם 100 microliters של תמיסת התאים לכל באר. לאחר מכן, דגור את תאי ה-HEK293 הגדלים בבקבוק T-25, בקבוק T-75 ובפלטת 96 בארות עד להגעה לכ-90% התמסגרוּת (confluence) בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 5%CO2 למשך יום עד יומיים. לפני ניתוח FACS, קבע את הביטוי התפקודי של ה-GPCR על ידי הכנת פלטת תרופות עם 10 ריכוזים שונים של אגוניסט המקיפים את ה-EC 50 החזוי.

הכינו ריכוזים שונים של אגוניסט באמצעות שיטת דילול סדרתי, והכינו תבנית למעקב אחר ריכוזי התרופה. לאחר מכן, הגדירו את טמפרטורת קורא הלוחיות ל-37 °C. לאחר מכן, תכנתו את קורא הלוחיות הפלורומטרי בעל 96 בארות למדידת FRET ולביצוע העברות של תמיסות.

למדידת FRET באמצעות חיישן סידן מבוסס FRET המקודד גנטית, TNXXL, הגדירו את אורך גל העירור ל-436 פלוס או מינוס 4.5 ננומטרים. לאחר מכן, הגדירו את מסנני הפליטה ואת מסנני החסימה (cut off) עבור ECFP ו-citrine. כעת, תכנתו את קורא הלוחיות למדוד את הפליטות מדי ארבע שניות, למשך 180 שניות בסך הכל.

בחרו באפשרויות עבור נפח פלטה של 100 µL, גובה פיפט של 150 µL, והגשה של 50 µL של תרופה מפלטת תרכובות משולשת. הגדירו את נקודת הזמן להגשת התרופה ל-30 שניות. לאחר מכן, שאבו את המצע משורות A ו-B, והוסיפו 100 µL של ACSF לפלטת ה-sniffer בעלת 96 בארות, שהיא בערך ב-90% התמזגות (confluent).

לאחר מכן, הכניסו את פלטת התרופות המשולשית ואת פלטת ה-sniffer בעלת 96 הבארים לקורא הפלטות. המתינו 30 דקות להגעה לשיווי משקל של הפלטות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני תחילת התוכנית. לאחר הרצת קורא הפלטות, ייצאו את ערכי קריאת הפלואורסצנציה לקובץ טקסט.

לאחר מכן, ייבא קובץ זה לתבנית גיליון אלקטרוני שהוכנה מראש, המנרמלת את עוצמות הפלואורסצנציה לקווי הבסיס שלפני הגירוי, מחשבת את יחס ה-FRET השיא עבור כל ריכוז של אגוניסט, ומייצרת עקומת תגובה למינון. הכן את פיפט ההזרקה של ה-CNiFER על ידי הנחת קפילרית זכוכית במכשיר למשיכת אלקטרודות אנכי. השתמש בפינצטה כדי לשבור את קצה האלקטרודה לקוטר של כ-40 micrometers.

הניחו ספוג ספוג ב-ACSF על חלון גולגולת דק בגודל שני על שלושה מילימטרים שנוצר קודם לכן בעכבר מורדם, כדי לשמור על לחות בזמן הכנת התאים להזרקה. לאחר מכן, קצרו את שיבוט ה-CNiFER שגודל בבקבוק T-75 עד לכ-80% התלכדות (confluency). שאבו את המדיום, ושטפו את התאים עם PBS סטרילי.

הסיר את ה-PBS, והשתמש ב-10 milliliters של ACFS כדי לנתק את התאים מתחתית הבקבוק. לאחר מכן, בצע טריטורציה (tritcherate) לתאים כדי לפרק את גושי התאים. צנטריפוגה למשך שתי דקות בצנטריפוגה לתרביות תאים.

הסר את העל-נוזל (supernatant), וסספנד מחדש את המשקע ב-100 µL של ACSF. לאחר מכן, סבב במערך צנטריפוגה למשך 30 שניות ב-1400 ×g, והסר את העל-נוזל, כך שיישאר משקע מכוסה ב-ACSF. לאחר מכן, מלא שוב את פיפטת ההזרקה בשמן מינרליים.

טען את הפפיתה למזרק ננו (nano injector). הנח חמישה µL של תרחיף תאי CNiFER על רצועת סרט פרהפין פלסטיק ליד הכנה של העכבר. שאב את תאי ה-CNiFER לתוך הפפיתה המגולשת.

כעת, העבירו את הפיפטה לקואורדינטות x ו-y של היעד. הורידו את הפיפטות וחדרו דרך הגולגולת שדוקקה קודם לכן. המשיכו לעומק של כ-200 עד 400 micrometers מתחת לפני השטח של הגולגולת, אל השכבות השנייה והשלישית של הקורטקס.

הזריק 4.6 nanoliters של תאי CNiFER לאתר העמוק ביותר באמצעות הננו-מזרק. שים לב לתנועה בממשק שבין השמן לתאים. לאחר מכן, המתן חמש דקות לסיום פריסת התאים.

הסיגו את הפ pipette בערך 100 micrometers והזריקו 4.6 nanoliters נוספים של תאי CNiFER, ושוב, המתינו חמש דקות. לאחר מכן, הסיגו את הפ pipette באיטיות ובזהירות כדי למנוע זרימה חוזרת של ה-CNiFERs. בהליך זה, הניחו את פלטפורמת הדימות עם העכבר שראשו מקובע תחת עדשת שיקוע במים 10x במיקרוסקופ דימות דו-פוטוני.

הכנס את קוביית המסננים עבור דימוי FRET, בעלת מראה דיכרואית ב-505 nanometers ומסנני חסימת פס (band pass) בטווח של 460 nanometers עד 500 nanometers למדידת ECFP, ו-520 nanometers עד 560 nanometers למדידת citrine. לאחר מכן, הוסף ACSF לבאר, המכילה את חלון הגולגולת המודקק, והורד את עדשת המיקרוסקופ 10x עם טבילת מים אל תוך ה-ACSF. השתמש בעין בשילוב עם נורת כספית וקוביית מסנני GFP כדי לאתר את ה-CNiFERs.

כעת, עברו לעדשת 40x עם טבילה במים. לאחר מכן, בחרו את נתיב האור המתאים להדמיית פוטון כפול. הפעילו את לייזר הפולסים של פמטו-שנייה בטווח האינפרא-אדום הקרוב.

בחר באורך גל של 820 nanometers, ובהגדרת הספק של 5% עד 15%. הגדר את המתח של pmt one ו-pmt two לערך תת-מקסימלי, בדרך כלל 500-1000 volts, בהתאם ל-pmt. לאחר מכן, הגדר את ההגבר (gain) ל-1 עבור כל ערוץ, ואפס את מיקום ה-z עבור העדשה. הורד את העדשה בערך 100 עד 200 micrometers מהשטח הקורטיקלי, והתחל את סריקת ה-xy.

כווננו את עוצמת הלייזר, ההגבר (gain) ואת מתח ה-pmt עבור כל ערוץ כדי למקסם את יחס אות לרעש של הפלואורסצנציה של ה-CNiFER. לאחר מכן, השתמשו בתוכנה כדי להגביל את הדמיה לאזור המכיל את תאי ה-CNiFER, וכן לאזור רקע. בחרו בקו סריקה (scan line) עם מיצוע עבור שניים, כדי להגיע ליחס אות לרעש מתאים, והשתמשו בקצב סריקה של 3 עד 1 הרץ ב-4 מיקרו-שניות לפיקסל.

לאחר מכן, הגדירו ROI (אזור עניין) מסביב לתאי ה-CNiFER, כך שיקיף כ-שלושה עד ארבעה תאים בכל מישור. הגדירו ניתוח בזמן אמת של עוצמות הממוצע של ה-ROI.

לאחר מכן, התחילו ברכישת נתונים כדי לנטר את הפלורסצנציה של CNiFER לאורך זמן, והתחילו בגירוי חשמלי או בניסוי התנהגותי, תוך써 ניטור של ה-fret. בדוגמה זו, תגובת ה-fret של D2R CNiFER נמדדה באמצעות קורא פלטות עם מערכת להגשת תמיסות. גרף זה מראה את תגובת ה-fret במהלך יישום של דופמין ל-D2 CNiFERs.

שימו לב כי פליטת ה-ECFP פוחתת בעוד שפליטת ה-citrine עולה בנוכחות דופמין. וכאן מוצג גרף של יחס ה-fret התואם. מוצגות כאן עקומות תגובה למינון עבור התגובה של D2 CNiFERs לדופמין ולנוראפינפרין.

בנוסף, מוצג ה-CNiFER בעל הבקרה התגובתית החסר את D2R. תרשים עמודות זה מציג את תגובת יחס ה-fret עבור מוליכים עצביים ומודולטורים אחרים בריכוזים של 50 nano molar ו-one micro molar. כאן, גרייה חשמלית של נוירוני DA ב-substantia nigra מעוררת שינוי משמעותי ביחס ה-fret עבור D2 CNiFERs.

שימו לב כי써 האמפליטודה של התגובה עולה עם עלייה בעוצמת הגירוי החשמלי. שילוב של גירוי עם הזרקת קוקאין מגביר את תגובת ה-CNiFER. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו יוצרים, בוחנים ומשתמשים ב-CNiFERs לצילום in vivo.

לאורך תהליך הפיתוח של CNiFERs, חיוני לשמור על טכניקה סטרילית, מכיוון שתאים אלו ישתבצו בסופו של דבר בעכברים חיים. מימוש ה-CNiFERs מספק כלי חשוב לחוקרים בתחום מדעי המוח למדידה אופטית של שחרור כל מוליך עצבי, או נוירומודולטור, המאותת דרך קולטן המצומד לחלבון G. תודה שצפיתם, ובהצלחה בניסויים שלכם.