Name: בנייה מבוססת תאים נוירוטרנסמיטר פלורסנט Engineered כתבים (CNiFERs) עבור זיהוי אופטי של נוירוטרנסמיטורים In vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: חקור בניית דוחות פלואורסצנטיים מבוססי תאים (CNiFERs) לניטור שחרור נוירוטרנסמיטורים בזמן אמת במוח. השיטה משתמשת בתאי HEK293 ומיקרוסקופיה דו-פוטונית לחקר דינמיקה עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ב קונקלין (אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו) למתן qi5 G ו- G qs5 cDNAs, א שווייצר לסיוע עם אלקטרוניקה, נ טיילור לסיוע עם הקרנת שיבוטים, איאן Glaaser ורוברט ריפקין לקריאה הוכחה , ואוליבייה Griesbeck עבור TN-XXL. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר באמצעות המוסד האמריקני הלאומי לשימוש בסמים (NIDA) (DA029706; DA037170), המכון הלאומי של הדמיה ביו Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffmann-La Roche (88610A) ו &quot;Neuroscience הקשור לתרופות של מענק הכשרה לרעה &quot;דרך NIDA (DA007315).

<ol><li>Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+vivo.+microdialysis+to+the+study+of+cholinergic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems.</a> Methods. 23, 21-39 (2001).</li>
<li>Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+subsecond+dopamine+release+with+fast-scan+cyclic+voltammetry+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo.</a> Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).</li>
<li>Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Chemical+Neurotransmission+with+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors.</a> ACS Chem Neurosci. , (2015).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extrasynaptic+glutamate+dynamics+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).</li>
<li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+fluorescent+probe+for+visualizing+glutamate+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission.</a> Nat Methods. 10, 162-170 (2013).</li>
<li>Nguyen, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+biosensor+for+neurotransmitter+release+and+in+situ+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity.</a> Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).</li>
<li>Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+reporters+reveal+in+vivo+dynamics+of+dopamine+and+norepinephrine+release+in+murine+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex.</a> Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. , e3998(2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq%CE%B1+to+that+of+Gj%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).</li>
<li>Yamauchi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+ligand-gated+ion+channel+receptors+with+genetically+encoded+Ca2%2B+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors.</a> PLoS One. 6, e16519(2011).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+during+action+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation.</a> Nature. 494, 238-242 (2013).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

יצירת CNiFERs מספקת אסטרטגיה חדשנית וייחודית למדידה אופטית שחרור של נוירוטרנסמיטורים במוח in vivo. CNiFERs מותאם באופן אידיאלי למדידת שחרור extrasynaptic, כלומר, הולכת נפח, מסרים עצביים. חשוב לציין, כל CNiFER בעל המאפיינים של GPCR הילידים, מתן מדידה אופטית פיזיולוגית של השינויים ברמות של נוירוטרנסמיטורים במוח. נכון להיום, CNiFERs נוצרו לאיתור אצטילכולין (M1-CNiFER) 6, דופמין (D2-CNiFER) 7 ונוראפינפרין (α1a-CNiFER) 7. <p class=...

כדי להבין כיצד נוירונים לתקשר במוח, יש צורך להיות שיטה למדוד את שחרורו של נוירוטרנסמיטורים in vivo. ישנן מספר ומבוסס טכניקות למדידת נוירוטרנסמיטורים in vivo. טכניקה נפוצה אחת היא microdialysis, שבו צינורית מוכנס לתוך מוח נפח קטן של נוזל השדרתי נאסף ונותח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים אלקטרוכימיים זיהוי 1. Microdialysis בעל רזולוציה מרחבית בסדר גודל של כמה בקטרים ​​של החללית, למשל, ~ 0.5 מ&quot;מ עבור microprobe בקוטר 200 מיקרומטר. ההחלטה הזמנית של טכניקה זו, לעומת זאת, הוא איטי בגלל מרווחי דגימה אשר בדרך הכלל האחרון ~ 5 דקות או יותר 1. יתר על כן, ניתוחים אינם עשויים בזמן אמת. טכניקה נוספת היא voltammetry המחזורית הסריקה מהירה (FSCV), אשר משתמשת במכשיר בדיקה סיבי פחמן מוכנס לתוך המוח. יש FSCV טמפ מעולהרזולוציה אוראלית (subsecond), רגישות גבוהה (nanomolar), ברזולוציה מרחבית בקטרי בדיקה של 5 עד 30 מיקרומטר. עם זאת, FSCV מוגבל משדרי המייצרים חמצון מאפיין ופרופיל הפחתה במתח על בדיקת פוטנציומטרית פחמן 2. טכניקה שלישית למדוד נוירוטרנסמיטורים היא ישירות דרך הנוירוטרנסמיטר גנטי בקידוד (NT) biosensors 3. באמצעות שיטה זו, חלבון היתוך חדש שמכיל תחום מחייב ליגנד עבור משדר מצמיד את העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) זוג מבוסס של fluorophores 4 או permutated GFP 5. בניגוד לשתי השיטות הקודמות, חיישנים ביולוגיים אלה מקודדים גנטיים והביעו על פני השטח של תא מארח, כגון תא עצב, דרך הייצור של חיות טרנסגניות או בחריפות עם השימוש בחומרים ויראלי להדביק תאים. נכון להיום, biosensors גנטית בקידוד פותחו רק detectinגלוטמט g ו- GABA 3-5. מגבלות עם טכניקות אלה היו רגישים הנמוכים, בטווח ננומטר, וחוסר היכולת להרחיב את זיהוי המספר הגדול של משדרים, למשל, נוירוטרנסמיטורים קלסי, נוירופפטידים ו neuromodulators, אשר אות דרך החלבון בשילוב קולטנים G (GPCRs). למעשה, ישנם קרוב ל -800 GPCRs בגנום האנושי. כדי לתת מענה הגירעונות הללו, פתחנו כלי חדשני לשחרורו מידה האופטי של כל נוירוטרנסמיטר סיגנלים דרך GPCR. CNiFERs (כתבים מהונדסים פלורסנט הנוירוטרנסמיטר מבוסס תאים) הם תאים משובטים HEK293 המהונדס להביע GPCR ספציפי, כאשר מגורה, מפעיל עלייה תאית [Ca 2 +] כי הוא זוהה על ידי חיישן סריג מבוסס מקודדים גנטיים Ca 2+, TN-XXL. לפיכך, CNiFERs להפוך קולטן הנוירוטרנסמיטר מחייב לכדי שינוי קרינה, מתן r האופטי ישירה בזמן האמתקצוב EAD של פעילות הנוירוטרנסמיטר מקומית. על ידי ניצול של קולטן המקורי עבור נוירוטרנסמיטר נתון, CNiFERs לשמר את וספציפיות כימיות, זיקה ודינמיקה זמנית של קולטנים הביע באופן אנדוגני. נכון להיום, יצרו לנו שלושה סוגים של CNiFERs, אחד לאיתור אצטילכולין באמצעות קולטן M1, אחד לאיתור דופמין באמצעות קולטן D2, ואחד לאיתור נוראפינפרין באמצעות 6,7 קולטן α1a. טכנולוגית CNiFER היא בקלות להרחבה, וניתן להרחבה, מה שהופך אותו מי שפתוח לכל סוג של GPCR. במאמר יופיטר זה נתאר ולהמחיש את המתודולוגיה לעצב, להבין, ובדקו CNiFERs vivo עבור כל יישום.

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&nbsp;</td><td>שיבוט System Biosciences</td><td>CD510B-1</td>: <td>ליצירת lentivirus</td></tr><tr><td>12 x 75 *BD Falcon מבחנה תחתונה עגולה פוליפרופילן בהירות גבוהה</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 um מסנני תאי פלקון</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0.05% טריפסין EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96 צלחת באר, תחתית שטוחה, שקופה&nbsp;</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>FACS 96 לוחות תרבית תאים באר&nbsp;</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux תחתון שחור שקוף&nbsp;</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Flexstation Flexstation קצות פיפט</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>אצטילכולין כלוריד&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2661</td><td>פלקסטיישן</td></tr><tr><td>נוראדרנלין&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7256</td><td>פלקסטיישן</td></tr><tr><td>דופמין הידרוכלוריד&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>PHR1090</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>GABA&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2129</td><td>פלקסטיישן</td></tr><tr><td>היסטמין&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H7125</td><td>פלקסטיישן</td></tr><tr><td>גלוטמט&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>49621</td><td>פלקסטיישן</td></tr><tr><td>אפינפרין&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E4642</td><td>פלקסטיישן</td></tr><tr><td>סומטוסטטין&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S1763</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>5HT&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H9523</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>VIP&nbsp;</td><td>אלפא דיאגנוסטיקס בע"מ&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SP-69627</td><td>פלקסטיישן</td></tr><tr><td>אורקסין</td><td>אלפא דיאגנוסטיקה בע"מ&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>12-p-01</td> חומר <td>פלקססטיישן</td></tr><tr><td>P&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S6883</td><td>פלקססטיין</td></tr><tr><td>אדנוזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4036</td><td>פלקססטיין</td></tr><tr><td>מלטונין&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>קורא צלחות פלואורסצנטי ותוכנה</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM (גלוקוז גבוה) עם גלוטמקס&nbsp; &nbsp;</td><td>לייף טכנולוג'יז</td><td>10569-010</td><td>תרבית רקמות</td></tr><tr><td>&nbsp; סרום בקר עוברי</td><td>Life Technologies</td><td>10082-139</td><td>תרבית רקמות</td></tr><tr><td>&nbsp; עט/סטרפטוק&nbsp; אנטיביוטיקה</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>תרבית רקמות</td></tr><tr><td>&nbsp; פורומיצין&nbsp; &nbsp;</td><td>תרבית רקמות</td> <td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td></tr><tr><td>&nbsp; פיברונקטין&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>תרבית רקמות</td></tr><tr><td>CoolCell LX קופסת הקפאת תאים מבוקרת ללא אלכוהול</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508)</td> <td>תרבית רקמות</td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט&nbsp;</td><td>לוקטיט</td><td>לוקטיט מס' 495</td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>, סרט פרפין פלסטי&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Parafilm&reg;</td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>ננו-מזרק</td><td>דראמונד</td><td>3-000-204</td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>אלקטרודות זכוכית</td><td>דראמונד</td><td>3-000-203G</td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>מקדחה ידנית</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>קוצים למקדחה</td><td>Fine Scientific</td><td>19007-05; 19007-07)</td> <td>ניתוח והזרקה</td></tr> <tr><td>סטריאוטקסיתאמבט עיקור</td><td>FST</td><td>18000-45, ניתוח מעקר חרוזים חמים</td><td>והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>תא/מסכה איזופלורן</td><td>ציוד רפואי היילנד</td><td>564-0427, HME 109 מכונת הרדמה שולחנית עם וופורייזר איזופלורן, מד זרימה O2, שסתום כנופיה; 564-0852, ניתוח תא אינדוקציה 16X7X7.5 ס"מ</td><td>והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>היקף תלת מימד עם ניתוח זייס</td><td></td><td></td> בזרוע <td>והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr>ניתוח אור <td></td><td></td><td>סיבים אופטיים</td><td>והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;</td><td></td><td></td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>70% (V/V) ניתוח אלכוהול</td><td></td><td></td> איזופרופיל <td>והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Prep Pads</td><td>ניתוח dynarex</td><td>1108</td><td>והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>NaCl 0.9% (הזרקה, USP, 918610)</td><td></td><td></td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>ציקלוספורין (הזרקה, USP)</td><td></td><td></td><td>ניתוח ו הזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>בופרנקס (הזרקה) בופרנורפין (0.03 &mu; גרם לגרם מכרסם)</td>ניתוח <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>משחת עיניים&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>ניתוחי קצף</td><td>אתיקון</td><td></td><td>והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>אחיזה צמנט דנטלי</td><td>Dentsply</td><td>#675571, ניתוח 675572</td><td>והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>Instant SuperGlue&nbsp;</td><td>ניתוח NDindustries</td><td></td><td>והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C& ניתוח B</td><td></td><td>והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>מס' 0 כיסוי זכוכית</td> ניתוח <td>פישר</td><td></td><td>והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>מסגרת סטריאוטקסית&nbsp;</td>ניתוח <td>קופף</td><td></td><td>והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>בדיקה רקטלית וכרית חימום</td><td>FHC</td><td>40-90-8D, בקר טמפרטורת DC, 40-90-2-06, כרית חימום 6.5X9.5 ס"מ 40-90-5D-02, ניתוח בדיקת תרמיסטור רקטלי</td> ולוח לחם אופטי <td>בהזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>להדמיית</td> ניתוח <td>Thorlabs</td><td></td><td>והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr>שמן<td>מינרלי</td><td>ניתוח פישר</td><td>S55667</td><td>ו הזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>קוויק-קאסט (אלסטומר סיליקון)</td>ניתוח <td>מכשירים מדויקים</td><td></td> עולמיים <td>ותפר הזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>אתיקון</td><td>18' ', 1667, 4-0</td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>91500-09, 15018-10</td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10</td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>סטודנט Halsted-Mosquito Hemostats</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91308-12</td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>ערכת צריבה לכלי קטן</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18000-00</td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>מעקרי חרוזים חמים</td><td>כלים מדעיים משובחים</td><td>18000-45</td><td>ניתוח והזרקה</td></tr> <tr><td>סטריאוטקסיתמארז מכשירים עם מחצלת סיליקון</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20311-21</td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>מיכלי עיקור מפלסטיק עם מחצלת סיליקון</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20810-01</td><td>ניתוח והזרקה סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>2P היקף פלואורסצנטי בשלב קבוע עבור in vivo הדמיה</td><td>אולימפוס</td><td>FV1200</td><td>MPE in vivo הדמיה</td></tr><tr><td>לייזר</td> <td>מולטיפוטוןSpectraPhysics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td>in vivo הדמיה</td></tr><tr><td>לייזר ירוק</td><td>אולימפוס</td><td>473 ננומטר לייזר</td><td>in vivo הדמיה</td></tr><tr><td>xy בסיס תרגום</td><td>Scientifica</td><td>MMBP</td><td>in vivo הדמיה</td></tr><tr><td>קוביית מסנן FRET עבור YFP ו-CFP</td> הדמיית <td>אולימפוס</td><td></td><td>in vivo</td></tr><tr><td>10x ו-40x מטרות טבילה במים</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>in vivo שולחן אוויר הדמיה</td></tr><tr><td></td><td>Newport</td><td></td><td>in vivo Imaging</td></tr><tr><td>כלוב אטום לאור שנבנה בהתאמה אישית</td><td>Thorlab</td><td></td><td>in vivo</td></tr></tbody></table>

בנייה מבוססת תאים נוירוטרנסמיטר פלורסנט engineered כתבים (cnifers) עבור זיהוי אופטי של נוירוטרנסמיטורים<em&gt; in vivo</em

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

כתבים מהונדסים פלורסנט הנוירוטרנסמיטר מבוסס תאים (CNiFERs) לספק כלי חדש עבור מדעני מוח כדי אופטי לזהות את השחרור של נוירוטרנסמיטורים במוח in vivo. ספציפית CNiFER נוצר מתא כליה עוברי אנושי ביציבות מבטא G- חלבון בשילוב ספציפי לקולטן, אשר זוגות q G / 11 חלבוני G, וכן סריג מבוסס Ca 2+ -detector, TN-XXL. הפעלת הקולטן מובילה לעליית אות הסריג. CNiFERs יש ננומטר רגיש תגובה זמנית של שניות, כי שיבוט CNiFER מנצל את הקולטן המקורי עבור נוירוטרנסמיטר מסוים, למשל, D2R עבור דופמין. CNiFERs מושתל ישירות לתוך המוח, מה שמאפשר להם לחוש שחרור הנוירוטרנסמיטר עם רזולוציה מרחבית של פחות ממאה מיקרומטר, מה שהופך אותם אידיאליים כדי למדוד הולכת נפח in vivo. CNiFERs יכול גם לשמש מסך תרופות אחרות עבור תגובתיות צולבת הפוטנציאל viVO. לאחרונה הרחיבה משפחת CNiFERs לכלול GPCRs כי בני הזוג G i / o G חלבונים. CNiFERs זמין לאיתור אצטילכולין (ACH), דופמין (DA) ונוראפינפרין (NE). בהתחשב בכך כל יכול לשמש GPCR ליצור רומן CNiFER וכי ישנם כ 800 GPCRs בגנום האנושי, אנו מתארים כאן את ההליך באופן כללי לתכנן, להבין, ולבדוק כל סוג של CNiFER.

CNiFER נגזר תא כליה עוברית אנושי (HEK293) כי הוא שהונדס ביציבות לפחות שני חלבונים: קולטן מסוים G- חלבון בשילוב (GPCR) ו מקודדים גנטיים [Ca 2 +] חיישן, TN-XXL. TN-XXL עובר תהודת העברת אנרגית פלואורסצנטי (סריג) בין חלבונים ציאן וצהוב ניאון, ECFP סיטרין, בהתאמה, בתגובת יוני Ca 2 + 6,15. הפעלת GPCRs כי בני הזוג חלבונים G q G אנדוגני לעורר עלייה cytosolic [Ca 2 +] דרך מסלול 3 PLC / IP, מה...

אנו מציגים פרוטוקול ליצור לכתבים מהונדסים פלורסנט הנוירוטרנסמיטר מבוססי תאים (CNiFERs) לצורך זיהוי אופטי של שחרור הנוירוטרנסמיטר נפח.

בנייה מבוססת תאים נוירוטרנסמיטר פלורסנט Engineered כתבים (CNiFERs) עבור זיהוי אופטי של נוירוטרנסמיטורים<em&gt; In vivo</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

המטרה הכללית של סרטון זה היא לתאר את המתודולוגיה לבנייה ובדיקה של דווחים פלואורסצנטיים של מוליכים עצביים מבוססי-תאים, או CNiFERs, אשר ניתן להשתמש בהם לניטור אופטי של שחרור מוליכים עצביים ספציפיים in vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח במדעי המוח הנוגעות לעיתוי ולשחרור של נוירומודולטורים במוח. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להתאימה לכל סוג של מוליך עצבי או נוירומודולטור, המאותת דרך GPCS.הדגמה אזורית של שיטה זו היא מועילה. ההזרקה in vivo והדימיון העוקב של CNiFERs מאתגרים מבחינה טכנית. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, ראו את תאי HEK293 המכילים את גלאי הסידן מבוסס הפרונט ואת ה-g protein הכימרי בבקראת T-25.לאחר מכן, גדלו את התאים באינקובטור עם לחות, בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2, עד להגעה לכ-50% התלכדות (confluent). לאחר מכן, שאבו את המצע מבקבוק ה-T-25. הוסיפו 2 mL של תערובת מצע ה-lenta virus, והדגירו את בקבוק ה-T-25 בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2.ביום למחרת, קצרו את תאי ה-HEK293 המודבקים על ידי הוספה של מיליליטר אחד של trypsin. לאחר מכן, השעו מחדש את משקע התאים בחמישה מיליליטרים של מצע גידול עבור HEK293. זרעו מיליליטר אחד של תאים בבדיל T-75 לצורך הקפאה ואחסון, ו-1.5 מיליליטר של תאים בבדיל T-25 לצורך ניתוח FACS.עבור עקומת האגוניסט בעלת 10 נקודות, לבדיקת התאים המודבקים, זרע את שתי השורות הראשונות של פלטת 96 בארות מצופה בפיברונקטין עם 100 microliters של תמיסת התאים לכל באר. לאחר מכן, דגור את תאי ה-HEK293 הגדלים בבקבוק T-25, בקבוק T-75 ובפלטת 96 בארות עד להגעה לכ-90% התמסגרוּת (confluence) בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 5%CO2 למשך יום עד יומיים. לפני ניתוח FACS, קבע את הביטוי התפקודי של ה-GPCR על ידי הכנת פלטת תרופות עם 10 ריכוזים שונים של אגוניסט המקיפים את ה-EC 50 החזוי.הכינו ריכוזים שונים של אגוניסט באמצעות שיטת דילול סדרתי, והכינו תבנית למעקב אחר ריכוזי התרופה. לאחר מכן, הגדירו את טמפרטורת קורא הלוחיות ל-37 °C. לאחר מכן, תכנתו את קורא הלוחיות הפלורומטרי בעל 96 בארות למדידת FRET ולביצוע העברות של תמיסות.למדידת FRET באמצעות חיישן סידן מבוסס FRET המקודד גנטית, TNXXL, הגדירו את אורך גל העירור ל-436 פלוס או מינוס 4.5 ננומטרים. לאחר מכן, הגדירו את מסנני הפליטה ואת מסנני החסימה (cut off) עבור ECFP ו-citrine. כעת, תכנתו את קורא הלוחיות למדוד את הפליטות מדי ארבע שניות, למשך 180 שניות בסך הכל.בחרו באפשרויות עבור נפח פלטה של 100 µL, גובה פיפט של 150 µL, והגשה של 50 µL של תרופה מפלטת תרכובות משולשת. הגדירו את נקודת הזמן להגשת התרופה ל-30 שניות. לאחר מכן, שאבו את המצע משורות A ו-B, והוסיפו 100 µL של ACSF לפלטת ה-sniffer בעלת 96 בארות, שהיא בערך ב-90% התמזגות (confluent).לאחר מכן, הכניסו את פלטת התרופות המשולשית ואת פלטת ה-sniffer בעלת 96 הבארים לקורא הפלטות. המתינו 30 דקות להגעה לשיווי משקל של הפלטות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני תחילת התוכנית. לאחר הרצת קורא הפלטות, ייצאו את ערכי קריאת הפלואורסצנציה לקובץ טקסט.לאחר מכן, ייבא קובץ זה לתבנית גיליון אלקטרוני שהוכנה מראש, המנרמלת את עוצמות הפלואורסצנציה לקווי הבסיס שלפני הגירוי, מחשבת את יחס ה-FRET השיא עבור כל ריכוז של אגוניסט, ומייצרת עקומת תגובה למינון. הכן את פיפט ההזרקה של ה-CNiFER על ידי הנחת קפילרית זכוכית במכשיר למשיכת אלקטרודות אנכי. השתמש בפינצטה כדי לשבור את קצה האלקטרודה לקוטר של כ-40 micrometers.הניחו ספוג ספוג ב-ACSF על חלון גולגולת דק בגודל שני על שלושה מילימטרים שנוצר קודם לכן בעכבר מורדם, כדי לשמור על לחות בזמן הכנת התאים להזרקה. לאחר מכן, קצרו את שיבוט ה-CNiFER שגודל בבקבוק T-75 עד לכ-80% התלכדות (confluency). שאבו את המדיום, ושטפו את התאים עם PBS סטרילי.הסיר את ה-PBS, והשתמש ב-10 milliliters של ACFS כדי לנתק את התאים מתחתית הבקבוק. לאחר מכן, בצע טריטורציה (tritcherate) לתאים כדי לפרק את גושי התאים. צנטריפוגה למשך שתי דקות בצנטריפוגה לתרביות תאים.הסר את העל-נוזל (supernatant), וסספנד מחדש את המשקע ב-100 µL של ACSF. לאחר מכן, סבב במערך צנטריפוגה למשך 30 שניות ב-1400 ×g, והסר את העל-נוזל, כך שיישאר משקע מכוסה ב-ACSF. לאחר מכן, מלא שוב את פיפטת ההזרקה בשמן מינרליים.טען את הפפיתה למזרק ננו (nano injector). הנח חמישה µL של תרחיף תאי CNiFER על רצועת סרט פרהפין פלסטיק ליד הכנה של העכבר. שאב את תאי ה-CNiFER לתוך הפפיתה המגולשת.כעת, העבירו את הפיפטה לקואורדינטות x ו-y של היעד. הורידו את הפיפטות וחדרו דרך הגולגולת שדוקקה קודם לכן. המשיכו לעומק של כ-200 עד 400 micrometers מתחת לפני השטח של הגולגולת, אל השכבות השנייה והשלישית של הקורטקס.הזריק 4.6 nanoliters של תאי CNiFER לאתר העמוק ביותר באמצעות הננו-מזרק. שים לב לתנועה בממשק שבין השמן לתאים. לאחר מכן, המתן חמש דקות לסיום פריסת התאים.הסיגו את הפ pipette בערך 100 micrometers והזריקו 4.6 nanoliters נוספים של תאי CNiFER, ושוב, המתינו חמש דקות. לאחר מכן, הסיגו את הפ pipette באיטיות ובזהירות כדי למנוע זרימה חוזרת של ה-CNiFERs. בהליך זה, הניחו את פלטפורמת הדימות עם העכבר שראשו מקובע תחת עדשת שיקוע במים 10x במיקרוסקופ דימות דו-פוטוני.הכנס את קוביית המסננים עבור דימוי FRET, בעלת מראה דיכרואית ב-505 nanometers ומסנני חסימת פס (band pass) בטווח של 460 nanometers עד 500 nanometers למדידת ECFP, ו-520 nanometers עד 560 nanometers למדידת citrine. לאחר מכן, הוסף ACSF לבאר, המכילה את חלון הגולגולת המודקק, והורד את עדשת המיקרוסקופ 10x עם טבילת מים אל תוך ה-ACSF. השתמש בעין בשילוב עם נורת כספית וקוביית מסנני GFP כדי לאתר את ה-CNiFERs.כעת, עברו לעדשת 40x עם טבילה במים. לאחר מכן, בחרו את נתיב האור המתאים להדמיית פוטון כפול. הפעילו את לייזר הפולסים של פמטו-שנייה בטווח האינפרא-אדום הקרוב.בחר באורך גל של 820 nanometers, ובהגדרת הספק של 5% עד 15%. הגדר את המתח של pmt one ו-pmt two לערך תת-מקסימלי, בדרך כלל 500-1000 volts, בהתאם ל-pmt. לאחר מכן, הגדר את ההגבר (gain) ל-1 עבור כל ערוץ, ואפס את מיקום ה-z עבור העדשה. הורד את העדשה בערך 100 עד 200 micrometers מהשטח הקורטיקלי, והתחל את סריקת ה-xy.כווננו את עוצמת הלייזר, ההגבר (gain) ואת מתח ה-pmt עבור כל ערוץ כדי למקסם את יחס אות לרעש של הפלואורסצנציה של ה-CNiFER. לאחר מכן, השתמשו בתוכנה כדי להגביל את הדמיה לאזור המכיל את תאי ה-CNiFER, וכן לאזור רקע. בחרו בקו סריקה (scan line) עם מיצוע עבור שניים, כדי להגיע ליחס אות לרעש מתאים, והשתמשו בקצב סריקה של 3 עד 1 הרץ ב-4 מיקרו-שניות לפיקסל.לאחר מכן, הגדירו ROI (אזור עניין) מסביב לתאי ה-CNiFER, כך שיקיף כ-שלושה עד ארבעה תאים בכל מישור. הגדירו ניתוח בזמן אמת של עוצמות הממוצע של ה-ROI.לאחר מכן, התחילו ברכישת נתונים כדי לנטר את הפלורסצנציה של CNiFER לאורך זמן, והתחילו בגירוי חשמלי או בניסוי התנהגותי, תוך써 ניטור של ה-fret. בדוגמה זו, תגובת ה-fret של D2R CNiFER נמדדה באמצעות קורא פלטות עם מערכת להגשת תמיסות. גרף זה מראה את תגובת ה-fret במהלך יישום של דופמין ל-D2 CNiFERs.שימו לב כי פליטת ה-ECFP פוחתת בעוד שפליטת ה-citrine עולה בנוכחות דופמין. וכאן מוצג גרף של יחס ה-fret התואם. מוצגות כאן עקומות תגובה למינון עבור התגובה של D2 CNiFERs לדופמין ולנוראפינפרין.בנוסף, מוצג ה-CNiFER בעל הבקרה התגובתית החסר את D2R. תרשים עמודות זה מציג את תגובת יחס ה-fret עבור מוליכים עצביים ומודולטורים אחרים בריכוזים של 50 nano molar ו-one micro molar. כאן, גרייה חשמלית של נוירוני DA ב-substantia nigra מעוררת שינוי משמעותי ביחס ה-fret עבור D2 CNiFERs.שימו לב כי써 האמפליטודה של התגובה עולה עם עלייה בעוצמת הגירוי החשמלי. שילוב של גירוי עם הזרקת קוקאין מגביר את תגובת ה-CNiFER. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו יוצרים, בוחנים ומשתמשים ב-CNiFERs לצילום in vivo.לאורך תהליך הפיתוח של CNiFERs, חיוני לשמור על טכניקה סטרילית, מכיוון שתאים אלו ישתבצו בסופו של דבר בעכברים חיים. מימוש ה-CNiFERs מספק כלי חשוב לחוקרים בתחום מדעי המוח למדידה אופטית של שחרור כל מוליך עצבי, או נוירומודולטור, המאותת דרך קולטן המצומד לחלבון G. תודה שצפיתם, ובהצלחה בניסויים שלכם.

construction-cell-based-neurotransmitter-fluorescent-engineered

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

עם העניין הגובר טיפולים בתאי גזע, טכניקות הדמיה מולקולרית הם אידיאליים עבור התנהגות בתאי גזע ניטור לאחר ההשתלה. הגנים כתב בלוציפראז אפשרו פולשני, הערכה חוזרת של הישרדות התא, מיקום התפשטות in vivo. וידאו זה יהיה להדגים כיצד לעקוב אחר התפשטות hESC בעכבר חי.

במבחנה פליטת אור הדמיה vivo ג&#39;ין הכתב של בתאי גזע עובריים אנושיים

פיתחנו שיטה חדשנית של לכימות ניאציניות קולטני אצטילכולין שינויים בתוך אזורים subcellular של תת ספציפיים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית כדי להבין טוב יותר את המנגנונים של התמכרות לניקוטין באמצעות שילוב של גישות כולל תיוג חלבון פלואורסצנטי של הקולטן באמצעות עקום בגישה רפאים confocal הדמיה.

דימות ספקטרלי Confocal של קולטנים ניאציניות מתויג fluorescently ב עקום בעכברים עם מינהל ניקוטין כרונית

מקור: Lacin, E., et al. בניית מדווחים מהונדסים פלואורסצנטיים מבוססי תאים (CNiFERs) לזיהוי אופטי של נוירוטרנסמיטורים in vivo. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית שחרור נוירוטרנסמיטר in vivo באמצעות מדווחים מהונדסים פלואורסצנטיים מבוססי תאים (CNiFERs), תאי דיווח מיוחדים שהוזרקו מראש לקליפת העכבר. העכבר ממוקם תחת מיקרוסקופ של שני פוטונים, ומאפשר הדמיה של איתות סידן המושרה על ידי נוירוטרנסמיטר באמצעות פליטת פלואורסצנטיות. השיטה ממנפת קשירת נוירוטרנסמיטורים לקולטנים מצומדים לחלבון G...

שחרור נוירוטרנסמיטר הדמיה באמצעות נוירוטרנסמיטר מבוסס תאים מדווחים מהונדסים פלואורסצנטיים

עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים...

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

כאן אנו מציגים רומן Ca 2 + גישת -imaging באמצעות כתב bioluminescent. גישה זו משתמשת בGFP-aequorin מבנה התמזגה אשר נקשר Ca 2 + ופולט אור, ומבטל את הצורך בעירור אור. באופן משמעותי בשיטה זו מאפשרת הדמיה ארוכה רציפה, גישה למבני מוח עמוקים ורזולוציה גבוהה זמנית.

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

טכנולוגיה זו מבוססת על-ידי קרינה פלואורסצנטית פיתח ' מאפשר ניטור לטווח ארוך של שעתוק של גנים שעון היממה העל-תצלובתי (SCN) לנוע בחופשיות עכברים בזמן אמת, ברזולוציה הטמפורלית גבוהה.

אין ויוו פיקוח על ביטוי גנים שעון היממה בתצלובתי העכבר באמצעות קרינה פלואורסצנטית כתבים

כאן אנו מציגים פרוטוקול סידן התמונה איתות באוכלוסיות של סוגי תאים בודדים באזור צומת עצב-שריר מאתר.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

אנו מציגים פרוטוקול דו-חלקי המשלב הדמיה של סידן פלורסנט עם היברידיזציה באתרו, ומאפשר לניסויים לתאם דפוסים של פעילות הסידן עם פרופילי ביטוי גנים ברמה של תא אחד.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

באמצעות עכברים פלואורסצנטיים מהונדסים, מתוארים פרוטוקולים מפורטים להערכת הובלה אקסונאלית in vivo של אנדוזומים איתות ומיטוכונדריה בתוך אקסונים מוטוריים וחושיים של העצב הסיאטי השלם בחיות חיות.

הרחבת ערכת הכלים להדמיית In Vivo של תחבורה אקסונלית

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

חקור בניית דוחות פלואורסצנטיים מבוססי תאים (CNiFERs) לניטור שחרור נוירוטרנסמיטורים בזמן אמת במוח. השיטה משתמשת בתאי HEK293 ומיקרוסקופיה דו-פוטונית לחקר דינמיקה עצבית.

בנייה מבוססת תאים נוירוטרנסמיטר פלורסנט Engineered כתבים (CNiFERs) עבור זיהוי אופטי של נוירוטרנסמיטורים

גלה סרטונים נוספים