בנייה מבוססת תאים נוירוטרנסמיטר פלורסנט Engineered כתבים (CNiFERs) עבור זיהוי אופטי של נוירוטרנסמיטורים In vivo

המטרה הכוללת של סרטון זה היא לתאר את המתודולוגיה לבנייה ובדיקה של מדווחים פלואורסצנטיים של נוירוטרנסמיטורים מבוססי תאים, או CNiFERs, שניתן להשתמש בהם כדי לנטר אופטית את השחרור של נוירוטרנסמיטורים ספציפיים in vivo. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי המוח הנוגעות לתזמון ושחרור של נוירומודולטורים במוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להתאים אותה לכל סוג של נוירוטרנסמיטר או נוירומודולטור, המאותת דרך GPCS.

הדגמה אזורית של שיטה זו מועילה. זוהי הזרקת in vivo, וההדמיה שלאחר מכן של CNiFERs מאתגרת מבחינה טכנית. כדי להתחיל בהליך זה, ראה את תאי HEK293 המכילים את גלאי הסידן הקדמי וחלבון g כימרי בבקבוק T-25.

לאחר מכן, גדלו את התאים באינקובטור לח, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם חמישה אחוזי CO2, עד לחיבור של כ-50%. לאחר מכן, שאפו את התקשורת מבקבוק ה-T-25. הוסיפו שני מיליליטר מתערובת המדיה של נגיף הלנטה, ודגרו על בקבוק ה-T-25 ב-37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO2.

למחרת, קצרו את תאי HEK293 הנגועים על ידי הוספת מיליליטר אחד של טריפסין. לאחר מכן, השעו מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של מצע גידול HEK293. זרע מיליליטר אחד של תאים בבקבוק T-75 להקפאה ואחסון, ו-1.5 מיליליטר תאים בבקבוק T-25 לניתוח FACS.

עבור עקומת אגוניסט של 10 נקודות, כדי לבדוק את התאים הנגועים, זרע את שתי השורות הראשונות של צלחת 96 בארות מצופה פיברונקטין עם 100 מיקרוליטר של תרחיף התאים לבאר. לאחר מכן, דגרו על תאי HEK293 הגדלים בבקבוק T-25, בקבוק T-75 וצלחת 96 בארות עד לכ-90% ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך יום עד יומיים. לפני ניתוח FACS, קבע את הביטוי הפונקציונלי של ה-GPCR על ידי הכנת לוחית תרופה עם 10 ריכוזי אגוניסטים שונים הסוגרים את ה-EC 50 החזוי.

הכן ריכוזים שונים של אגוניסטים בשיטת דילול סדרתי, וצור תבנית, כדי לעקוב אחר ריכוזי התרופות. לאחר מכן, הגדר את טמפרטורת קורא הצלחות ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, תכנת את קורא הלוחות הפלואורומטרי 96 בארות למדידת שריג וביצוע העברות תמיסות.

למדידת שריג עם חיישן סידן מבוסס שריג מקודד גנטית, TNXXL, הגדר את אורך גל העירור ל-436 פלוס מינוס 4.5 ננומטר. לאחר מכן, הגדר את מסנני הפליטה, ואת המסננים החתוכים, עבור ECFP וסיטרין. לאחר מכן, תכנת את קורא הלוחות למדוד את הפליטות כל ארבע שניות, בסך הכל 180 שניות.

בחר את האפשרויות לנפח צלחת מיקרולידר 100, גובה פיפטה של 150 מיקרוליטר ומשלוח של 50 מיקרו ליטר תרופה מהצלחת המורכבת המשולשת. הגדר את נקודת הזמן למתן תרופות ל-30 שניות. לאחר מכן, שאפו את המדיה משורות A ו-B, והוסיפו 100 מיקרוליטר של ACSF לצלחת הרחרחן של 96 בארות, כלומר כ-90% מתלכדים.

לאחר מכן, טען את צלחת הסמים המשולשת וצלחת הרחרחן 96 באר לתוך קורא הצלחות. אפשר 30 דקות לאזן את הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס, לפני תחילת התוכנית. לאחר הפעלת קורא הלוחות, ייצאו את ערכי קורא הקרינה לקובץ טקסט.

לאחר מכן, ייבא קובץ זה לתבנית גיליון אלקטרוני שנוצרה בעבר המנרמלת את עוצמות הפריחה לקווי הבסיס שלפני הגירוי, מחשבת את יחס השיא של השריג עבור כל ריכוז אגוניסט ויוצרת עקומת תגובת מינון. הכן את פיפטת הזרקת CNiFER על ידי הנחת נימי זכוכית על מושך אלקטרודות אנכי. השתמש בזוג מלקחיים כדי לשבור את קצה האלקטרודה לקוטר של כ -40 מיקרומטר.

הניחו ספוג ACSF על חלון גולגולת דק של שניים על שלושה מילימטר שנוצר בעבר של עכבר מורדם, כדי לשמור על לחות בזמן הכנת התאים להזרקה. לאחר מכן, קצרו את שיבוט CNiFER שגדל בבקבוק T-75 לכ-80% מפגש. שאפו את המדיה ושטפו את התאים עם PBS סטרילי.

הסר PBS והשתמש ב-10 מיליליטר ACFS כדי לעקור את התאים מתחתית הבקבוק. לאחר מכן, טריצ'ר את התאים כדי לפרק את גושי התאים. צנטריפוגה למשך שתי דקות בצנטריפוגה של תרבית תאים.

הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר ACSF. לאחר מכן, צנטריפוגה למשך 30 שניות ב-1400 כפול G, והסירו את הסופרנטנט, והשאירו כדור, מכוסה ב-ACSF. לאחר מכן, יש למלא את פיפטת ההזרקה בשמן מינרלי.

טען את הפיפטה על מזרק ננו. שים חמישה מיקרוליטר של תרחיף תאי CNiFER על רצועת סרט פרפין מפלסטיק ליד תכשיר העכבר. משוך את תאי ה-CNiFER לתוך הפיפטה הנמשכת.

כעת, העבר את הפיפטה לקואורדינטות המטרה x ו-y. הורד את הפיפטות, ונקב את הגולגולת הדקה, שהוכנה קודם לכן. המשיכו עד כ-200 עד 400 מיקרומטר מתחת לפני הגולגולת, בשכבות 2 ו-3 של קליפת המוח.

הזרקו 4.6 ננוליטר של תאי CNiFER באתר העמוק ביותר עם מזרק הננו. שימו לב לתנועה בממשק השמן והתא. ואז, המתן חמש דקות עד שהתאים יתפזרו.

משוך את הפיפטה כ-100 מיקרומטר והזריק עוד 4.6 ננוליטר של תאי CNiFER ושוב, המתן חמש דקות. לאחר מכן, משוך את הפיפטה לאט ובעדינות כדי למנוע זרימה חוזרת של ה-CNiFERs. בהליך זה, הנח את פלטפורמת ההדמיה עם העכבר המרוסן בראש מתחת לאובייקט טבילה במים פי 10 במיקרוסקופ הדמיה של שני פוטונים.

הכנס את קוביית המסנן להדמיית שריג שיש לה מראה דיכרואית ב-505 ננומטר ומסנני מעבר פס המשתרעים על פני 460 ננומטר עד 500 ננומטר למדידת ECFP ו-520 ננומטר עד 560 ננומטר למדידת סיטרין. לאחר מכן, הוסף ACSF לבאר, המכיל את חלון הגולגולת הדליל והורד את יעד הטבילה במים פי 10 לתוך ה-ACSF. השתמש בחתיכת העין בשילוב עם כספית lamp, וקוביית מסנן GFP כדי לאתר את ה-CNiFERs.

כעת, עבור ליעד הטבילה במים פי 40. לאחר מכן, בחר את נתיב האור המתאים להדמיית שני פוטונים. הפעל את לייזר הדופק הפמטו-שנייה הקרוב לאינפרא אדום.

בחר את אורך הגל של 820 ננומטר, והגדרת הספק של חמישה עד 15%הגדר את מתח ה-pmt אחד ו-pmt שני לערך תת-מקסימלי, בדרך כלל 500-1000 וולט, בהתאם ל-pmt. לאחר מכן, הגדר את הרווח לאחד עבור כל ערוץ, ואפס את מיקום z עבור המטרה. הורד את המטרה כ-100 עד 200 מיקרומטר מפני השטח של קליפת המוח, והתחל את סריקת ה-xy.

התאם את עוצמת הלייזר, הרווח ומתח ה-PMT עבור כל ערוץ כדי לייעל את יחס האות לרעש של התפרחת של ה-CNiFER. לאחר מכן, השתמש בתוכנה כדי להגביל את ההדמיה לאזור המכיל את תאי CNiFER, כמו גם לאזור רקע. בחר את קו הבוקר, בממוצע לשניים, ליחס אות לרעש מתאים, והשתמש בקצב סריקה של 3 עד הרץ אחד בארבע מיקרו-שניות לפיקסל.

לאחר מכן, צייר החזר ROI סביב תאי CNiFER. מקיף כשלושה עד ארבעה תאים לכל מישור. הגדר ניתוח בזמן אמת של עוצמות החזר ההשקעה הממוצעות.

לאחר מכן, התחל ברכישה כדי לנטר את התפרחת של CNiFER לאורך זמן והתחל גירוי חשמלי או ניסוי התנהגותי, תוך ניטור השריג. בדוגמה זו, התגובה של D2R CNiFER frite נמדדה על קורא צלחות עם מערכת אספקת תמיסה. גרף זה מציג את תגובת העצב במהלך היישום של דופמין על D2 CNiFERs.

שימו לב שפליטת ECFP פוחתת בעוד שפליטת הציטרין עולה עם דופמין. והנה עלילה של יחס השריג המתאים. מוצגות כאן עקומות תגובת המינון לתגובה של D2 CNiFERs לדופמין ולנוראדרנלין.

בנוסף, מוצג CNiFERs בקרה רספונסיבית חסרי D2R. גרף עמודות זה מציג את תגובת יחס הפריט עבור נוירוטרנסמיטורים ומודולטורים אחרים ב-50 ננו טוחנת ומיקרו טוחנת אחת. כאן, גירוי חשמלי של נוירוני DA בחומר השחור, מעורר שינוי גדול ביחס השריג עבור D2 CNiFERs.

שימו לב כיצד משרעת התגובה גדלה עם עלייה בעוצמה של גירוי חשמלי. גירוי צימוד עם הזרקת קוקאין מגביר את תגובת CNiFER. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד ליצור, לבדוק ולהשתמש ב-CNiFERs להדמיה in vivo.

לאורך התפתחות CNiFERs, חיוני לשמור על טכניקה סטרילית, מכיוון שתאים אלה יושתלו בסופו של דבר בעכברים חיים. המימוש של CNiFERs מספק כלי חשוב לחוקרים בתחום מדעי המוח למדידה אופטית של שחרור של כל נוירוטרנסמיטר או נוירומודולטור, שמאותת דרך קולטן מצומד לחלבון G. תודה על הצפייה, ובהצלחה בניסויים שלך.