אפיון רקמות לאחר שיטה חדשה חלוקה לעור מיקרו שתלי הדור

המטרה הכוללת של המצאה כירורגית זו היא להפיק מיקרו-השתלות עור אוטולוגיות שיהיו מוכנות לשימוש מיידי באותה הניתוח לצורכי ריפוי פצעים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הרפואה הרגנרטיבית והנדסת רקמות העור בנושאים כגון ריפוי פצעים כרוניים, כוויות ואולקוסים פוסט-טראומטיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא קלה מאוד לשימוש על ידי רופא ללא צורך בטכניקה מומחית, והיא מהירה וזולה.

כדי להתחיל, השתמשו במקדח ביופסיה כדי לאסוף דגימות עור ממטופל. לאחר מכן, הסירו והשליכו את שכבת האפיתל. שלבו כל דגימת רקמה עם 1 milliliter של תמיסת סלין כדי להפיק מיקרו-השתלות אוטולוגיות.

להכנת ביו-קומפלקסים ליישום קליני, העבירו 1 milliliter של תמיסת המיקרו-השתל אל ספוגי קולגן. יישמו מיד את הביו-קומפלקס על האזור הפגוע של המטופל. לבדיקה in vitro, בחנו את חיוניות הביו-קומפלקס.

לאחר שלושה ימי תרבית, שפכו פורמלין 0.3% ישירות על הביוקומפלקסים וקבעו אותם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השתמשו במיקרוטום כדי לחתוך דגימות בעובי 5 micrometers והצמידו אותן ישירות לעגלה מזכוכית. לאחר מכן, הניחו את הדגימות ב-15 עד 20 milliliters של xylene למשך שלוש דקות.

בשלב הבא, טבלו את הפרוסות בדרגות יורדות של אתנול למשך שעה בכל ריכוז, לפני ההעברה למים דה-יוניים כדי להסיר את הפרפין ולהחזיר לחות לחתכים. לאחר מכן, השתמשו ב-1 עד 2 מיליליטר של hematoxylin בריכוז 1 גרם לליטר למשך דקה עד שתי דקות לצביעת החתכים. העבירו למים כדי לשטוף את הצבע.

כעת, בעזרת 1 עד 2 מיליליטר של 1%Eosin Y ו-70%ethanol המדוללים במים, צבעו את הנגדים במשך ארבע עד חמש דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות תחת זרימה של מי ברז. טבלו את הנגדים בריכוזים עולים של ethanol למשך שעה בכל ריכוז, לפני דגירה של שעה ב-xylene.

לבסוף, מרחו חומר הרכבה על הדגימות לפני הוספת זכוכית כיסוי. לאחר מכן, בצעו תצפית תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 100x. באמצעות דרמטום, קחו דגימות בשכבה הפפילרית, רקמה מתה או דרמיס בעובי של 0.6 מילימטר, 1 מילימטר או 0.2 מילימטר, בהתאמה, מאזורי הגב של ארבעה תורמי רב-רקמות בני 40 עד 55, בהתאם לכללים הלאומיים לאיסוף רקמות.

העבירו את הדגימות ל-0.9%NaCl והניחו אותן על שייקר אורביטלי למשך חמש דקות כדי לשטוף בעדינות את הרקמה. באמצעות מחץ ביופסיה של 5 מילימטר, צרו דגימות בעלות קוטר אחיד מרקמת העור, מהאפידרמיס והדרמיס, ושקלו את כל דגימות הרקמה. לאחר מכן, הכניסו לשובר הרקמות שמונה, שלושה או ארבעה דגימות אחידות של רקמת עור, מהאפידרמיס או מהדרמיס, בהתאמה, והוסיפו 1.5 מיליליטר של תמיסת סלין לצורך הדיסאגרגציה.

בצעו פירוק (disaggregation) לכל דגימות הרקמה כפי שצוין בטבלה זו. השתמשו במספר תואם של ביופסיות נקביות (punch biopsies) שהופקו מדגימות רקמה שלמות כביקורות. לאחר הפירוק המכני, שאבו את תמיסת המלח המכילה את השתלים המיקרוסקופיים (micro-grafts) והניחו כל דגימה בנפרד בבאר אחת של פלטת 12 בארות.

הוסף 1 milliliter של מצע RPMI-1640 מועשר ב-10%FBS ואנטיביוטיקה לכל דגימה. כדי להעריך את חיוניות התאים, הוסף לכל באר 1 milliliter של מצע המכיל 0.5 milligrams per milliliter של תמיסת MTT, והדגר בטמפרטורה של 37-degree Celsius ו-5%carbon dioxide למשך שלוש שעות. לאחר ההדגרה, הסר את מצע ה-MTT והחלף אותו ב-1 milliliter של DMSO.

לאחר דגירה למשך 10 דקות, העבירו כל דגימה ב-DMSO לקובטה והשתמשו בספקטרופוטומטר לקריאת הצפיפות האופטית ב-570 ננומטר. חשבו את חיוניות התאים כיחס בין הבליעה ב-570 ננומטר לבין משקל הרקמה בגרמים שנעשה בה שימוש לפני הפירוק. לאחר מכן, ברגע שסביב התמיסת המלח מרקמת העור, דגימות מהדרמיס והדֶרמיס של תורם בודד, הניחו כל דגימה בנפרד בבאר של פלטה בעלת 12 בארות לבדיקת חיוניות תאים או בבקבוק תרבית לניתוח מורפולוגי.

הוסיפו 1 milliliter של RPMI-1640 עם 10% FBS ואנטיביוטיקה לפלטת 12 הבארים, או 5 milliliters לבקבוק תרבית, ודגרו בטמפרטורה של 37-degree Celsius ו-5% carbon dioxide למשך 24 שעות או שבעה ימים, בהתאמה. לאחר 24 שעות, השתמשו במיקרוסקופיית אור כדי לבצע ניתוח מורפולוגי על ידי הערכת נוכחות של תרחיף תאים. חזרו על הפעולה ביום השביעי.

באמצעות אנליזת FACS, נתחו את דגימות הדרמיס לסממנים של תאים מזנכימליים והמטופויטיים, כגון CD146, CD34 ו-CD45. הוסיפו מצע גידול לתאים המופרדים, ולאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 37-degree Celsius למשך שלושה ימים. והעריכו את סטריליות הרקמה על ידי ביצוע אנליזה מיקרוביולוגית כפי שתואר בעבר.

כפי שמוצג כאן, מיקרו-שתלים אוטולוגיים אנושיים שהועמסו באופן מיידי על תמיכת קולגן הושתלו בנגע ברגל. לאחר 30 ימים נצפתה רה-אפיתליזציה מלאה המלווה בתיקון רקמות. יתרה מכך, המעקב הקליני הראה מרקם ורכות טובים של האזור הפגוע לאחר חמישה חודשים.

כפי שרשום בטבלה זו, נקבעו ספי של שמונה, ארבעה ושלוש ביופסיות שניתן לעבד בשלב אחד, והרקמות פורקו בארבעה זמנים שונים כדי לזהות את תנאי הפירוק האופטימליים לשמירה על חיוניות תאים טובה. הפירוק המכני המוצג בסרטון זה שומר על ערך ממוצע של 30% cell viability בכל דגימות העור, האפידרמיס והדרמיס, כאשר הן נבחנות בזמנים שונים ביחס לרקמה שלמה. גרף זה מראה כי לאחר 24 שעות, או שבעה ימים בתרבית, לא נצפתה שונות משמעותית ב-cell viability בדגימות רקמת עור עד למועד ההומוגניזציה בתרבית בהשוואה לזמן ההתחלה.

עם זאת, נצפתה חיוניות מופחתת של דגימות מתות לאחר 24 שעות בתרבית בהשוואה לנקודת ההתחלה. אך חיוניות התאים הושבה לאחר שבעה ימים בתרבית. תוצאות דומות נצפו עבור הדרמיס.

במידה ושולטים בטכניקה זו, ניתן לבצעה בחמש דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להסיר את השכבה האפיתליאלית מהעור. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון פירוק רקמת עצם, כדי לענות על שאלות אחרות כמו מנגנון ריפוי העצם.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי הרפואה הרגנרטיבית והנדסת הרקמות לחקור ריפוי רקמות במטופלים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבצע הליך השתלת מיקרו-רקמה זה. זכרו כי עבודה עם רקמות עלולה להיות מסוכנת ביותר.

יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון הרכבת משקפי מגן, בעת ביצוע פרוצדורה זו.