Name: התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של Burnetii Coxiella (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: למד שיטת LAMP מבוססת ריאגנטים מיובשים לזיהוי C. burnetii בדגימות חולים. שיטה זו מפשטת אבחון Q fever בהגדרות משאבים מוגבלים ומאפשרת אחסון ללא קירור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי צי מחקר רפואי מרכז, יחידת עבודת מחקר 6000.RAD1.J.A0310. הדעות המובאות במאמר זה הן של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את המדיניות הרשמית או עמדת מחלקת הצי, משרד ההגנה, או ממשלת ארצות הברית. ויי-מיי ג&#39;ינג הינו עובד של ממשלת ארה&quot;ב. עבודה זו הוכנה במסגרת תפקידיהם הרשמיים שלה. כותרת 17 USC §105 קובע כי &quot;הגנה על זכויות יוצרים תחת הכותרת הזו אינה זמינה עבור כל עבודה של ממשלת ארצות הברית.&quot; הכותרת 17 USC §101 מגדיר יצירת ממשלת ארה&quot;ב כיצירה שהכינה חבר או עובדים שירות צבאי של ממשלת ארה&quot;ב כחלק תפקידיו הרשמיים של אותו האדם.

.1 כן פלסמיד דנ&quot;א דילולים כתקן עבור תגובת LAMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ספקטרופוטומטר למדידת צפיפות אופטית (OD) ב 260 ננומטר, כדי לקבוע את (IS1111a גן המטרה המכיל של ג burnetii RSA 493) פלסמיד ריכוז ה- DNA. OD של 260 של 1 משווה ל 50 מיקרוגרם / μl של ה- DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המר את כמות ה- DNA פלסמיד לתוך מספר עותק. מאז בגודל של הפלסמיד הוא 6,330 נ&quot;ב, המשקל המולקולרי של פלסמיד זה הוא 4.1 x 10 6 גרם (6,330 נקודות בסיס x 649 ג &#39;/ נ&quot;ב). ריכוז ה- DNA של הפלסמיד הוא 34.2 ng / μl (כפי שנקבע משלב 1.1). 1 μl של דגימת DNA זה מכיל 34.2 ng של DNA פלסמיד, שהשוותה ל 5 x 10 9 עותקים (34.2 x 10 -9 גרם / 4.1 x 10 6 GX 6.02 x 10 23) של ה- DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של ה- DNA פלסמיד (5 x 10 9 עותקים / μl) עד 90 μl של מים עבור דילול של פי 10 לבצע דגימת DNA של 5 x 10 8 עותקים / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.3 להכין דגימות DNA של 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, ו -5 x 10 0 עותקים / μl. </li></ol> 2. הכן את ה- DNA תבנית ממדגמים עבור תגובת LAMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מיצוי דנ&quot;א מדגים מפלזמה אנושית באמצעות ערכת מיני DNA מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. השתמש סך של 200 מדגם μl להפקת elute DNA חילוץ בהיקף 20 μl. </li></ol> 3. כן חיץ תגובת LAMP 2x <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 200 μl של 10x Pol הצפת, 320 μl של 5 M trimethylglycine, 12 μl של 1 M MgSO 4, 280 μl של תערובת dNTP (10 מ&quot;מ כל אחד) ו 188 μl של מים כדי להפוך 1 מ&quot;ל של חיץ 2x LAMP. מערבבים על ידי הדופק-vortexing במשך 10 שניות. </li></ol> 4. בצע התגובה הסטנדרטית LAMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 12.5 μl של 2x LAחיץ MP (כפי מוכן בשלב 3, 40 mM Tris-HCl (pH 8.8), 20 KCl מ&quot;מ, 16 מ&quot;מ 4 MgSO, 20 מ&quot;מ (NH 4) 2 4 SO, 0.2% Triton X-100, 1.6 M trimethylglycine, 1.4 מ&quot;מ dNTP תערובת), 1.2 μl של תמהיל פריימר, 1 μl של פולימראז BST DNA (8 U / μl), ו -5.3 μl של מים כדי להפוך תערובת התגובה (20 μl) בצינור 0.2 מ&quot;ל PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של ה- DNA (משלב 1 או 2) לתערובת התגובה 20 μl ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור סגור לדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות באמבט מים או בלוק חימום. זוהי טמפרטורת התגובה האופטימלית נקבעה בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של 10x חיץ ג&#39;ל העמסה כדי לסיים את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl טען 5 של תוצרי התגובה כדי ג&#39;ל 2% agarose מוכתם intercalating כתם חומצות גרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל הג&#39;ל על 100 וולט במשך 35 דקות במאגר 1x TBE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התוצאות על ידי אור UV. </li></ol> 5. בצע תגובת LAMP עם מחדשריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 125 μl של 10x Pol הצפת, 200 μl של 5 M trimethylglycine, 7.5 μl של 1 M MgSO 4, 667.5 μl של מים כדי להפוך 1 מ&quot;ל של חיץ הכינון מחדש. מערבבים על ידי הדופק-vortexing במשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינורות המכילים חומרים כימיים lyophilized מהשקית רדיד אלומיניום האטומה. אין להשתמש צינורות אם השקית בנייר אלומיניום אינו אטום או אם הוא פגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של חיץ הכינון מחדש לתוך צינור אחד מחדש להשעות ריאגנטים lyophilized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים על ידי pipetting למעלה חיץ ולמטה 5 פעמים. תסתכל לוודא ריאגנטים lyophilized מחדש תלויים לחלוטין. האבקה הלבנה צריכה להיעלם בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של תבנית ה- DNA (משלב 1 או 2) אל ריאגנטים מחדש ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור סגור לדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות באמבט מים או בלוק חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של 10x חיץ ג&#39;ל העמסה כדי לסיים את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 5 μl של תגובהמוצרים ג&#39;ל 2% agarose מוכתם intercalating כתם חומצות גרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל הג&#39;ל על 100 וולט במשך 35 דקות במאגר 1x TBE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התוצאות על ידי אור UV. </li></ol> 6. בצע תגובת LAMP עם הצפת כינון המכילה HNB או פלורסנט intercalating דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 125 μl של 10x Pol הצפת, 200 μl של 5 M trimethylglycine, 7.5 μl של 1 M 4 MgSO, 7.5 μl של 20 מ&quot;מ HNB (או 12.5 μl של 100x לצבוע intercalating פלורסנט) ו 660 μl (או 655 μl) של מים לעשות 1 מ&quot;ל של חיץ הכינון מחדש. מערבבים על ידי הדופק-vortexing במשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש החיץ מחדש מוכן בסעיף 6 לחזור על השלבים 5.2 - 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התוצאות על ידי בעין בלתי המזוינת (תגובה המכילה HNB) או אור UV (תגובה המכילה לצבוע intercalating פלורסנט). </li></ol> 7. בצעו תגובת LAMP בזמן אמת עם סורק Tube <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl DNA אל reconstitutריאגנטים ed המכיל לצבוע intercalating פלורסנט, צינור קרוב ולהכניס אותו לסורק צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורת דגירת גדר ב 60 ° C. למדוד את הקרינה ב 520 ננומטר במשך 60 דקות. </li></ol>

<ol><li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States%2C+2013%3A+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Recomm.+Rep%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li>
<li>Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+ratio+of+serum+doxycycline+concentration+to+MIC+and+rapid+decline+of+antibody+levels+during+treatment+of+Q+fever+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+and+Chemother%22%5BJournal%5D)">Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis.</a> Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).</li>
<li>Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+PCR+and+serology+assays+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).</li>
<li>Schneeberger, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+with+serum+samples+is+indispensable+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever.</a> Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).</li>
<li>Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+acute+Q+fever+by+PCR+on+sera+during+a+recent+outbreak+in+rural+South+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N+Y+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia.</a> Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).</li>
<li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).</li>
<li>Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+rapid+and+sensitive+detection+of+Orientia+tsutsugamushi.+by+loo-isothermal+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Soc.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).</li>
<li>Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+E+%22J.+Med.+Microb.+Diagn%22">J. Med. Microb. Diagn</a>. 1 (112), (2012).</li>
<li>Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+sensitive+detection+of+the+ompB+gene+of+spotted+fever+group+rickettsiae+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification.</a> BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).</li>
<li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).</li>
<li>Qiao, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+for+rapid+detection+of+Bacillus+anthracis.spores%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores.</a> Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).</li>
<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Thekisoe, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+%28LAMP%29+reagents+and+its+amplification+efficiency+on+crude+trypanosome+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vet.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates.</a> J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).</li>
<li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

בעבר, פיתחנו assay LAMP רגיש וספציפי מיקוד אלמנט הכניסה IS1111a 14. מרכיב IS1111 נבחר משום שהיא נשמרת מאוד בקרב הזנים השונים של C. burnetii ומספר גבוהים של עותקים (7 עד 110) החיידקים (קליי 2006). תוצאותינו הראו כי LAMP יכול לזהות כ -25 עותקים של אלמנט IS1111, אשר עשוי לתאם קטנה כמו עותק כרומוזומליות אחד Coxiella DNA. במחקר זה, DNA פולימרז BST, פריימרים LAMP, ו dNTPs היו lyophilized ו ארוז בשקית נייר אלומיניום מכווצת....

החיידק גראם שליליים קטנים Coxiella burnetii הוא הגורם הסיבתי של קדחת Q, שהינה זואונוסיס ברחבי העולם. בשל ההפצה העולמית של קדחת Q ואת ההדבקה גבוהה של ג burnetii, ארה&quot;ב אנשי צבאיים ואזרחיים בפריסה רב לאומית נמצאים בסיכון להידבק בתחומי אנדמיים. קדחת Q מבטאת בשתי צורות: זיהומים אקוטיים וכרוניים. Q-חום חריפה מציג את עצמו עם תסמינים דמויי שפעת, דלקת כבד, או דלקת ריאות, והוא בדרך כלל מחלה מעצמם עם שיעור תמותה נמוך. Q-חום כרוני, בעוד פחות נפוץ, לעתים קרובות תוצאות אנדוקרדיטיס, אשר יש שיעור תמותה גבוה בהרבה אם נותר 1,2 המטופל. לכן, אבחון מוקדם כדי להנחות את הטיפול מתאים הוא קריטי עבור טיפול בחולים. מבחני תגובת שרשרת פולימראז (PCR) בזמן אמת PCR כמותי (qPCR) פותחו לאיתור ג DNA burnetii בתרביות דגימות קליניות 3-5 &lt;/ Sup&gt;. שני PCR ו qPCR הם יקרים ולעתים קרובות לא זמינים באזורים מוגבל משאב לעבודה שגרתית. במקור שתאר Notomi 6, הגברת isothermal בתיווך לולאה (LAMP) מציעה שיטת הגברת DNA חלופית. LAMP משתמשת DNA פולימרז BST לסינתזת גדיל DNA עקירה יחד עם סטים פריימר ומעוצבים שמזהים לפחות לשישה אזורים עצמאיים של גן המטרה. היתרון המשמעותי ביותר של LAMP הוא הגברה מתרחשת בתנאי isothermal. לכן, רק באמבט מים, בלוק חימום או באינקובטור נדרש. שיטה זו נעשה שימוש כדי לזהות פתוגנים כמה ריקציאלי 7-9. ויזואליזציה של מוצרי ה- DNA מוגברים על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה היא השיטה המדויקת ביותר שיכול להבדיל חיוביות אמיתית תוצאות חיוביות שגויות עקב הגברה ספציפית. עם זאת בהליכי ג&#39;ל אלקטרופורזה אינם מעשיים עבור ar משאב מוגבלEAS. מספר שיטות חלופיות שפותחו כדי לגלות את תוצרי התגובה. חלופיים אלה, כגון עכירות נגזר היווצרות מגנזיום pyrophosphate 10 או באמצעות צבע intercalating פלורסנט להיות דמיינו תחת אור UV 11,12 הם נוחים יותר פועל ג&#39;ל. ריאגנטים LAMP היו יציבים במשך חודש, כאשר הם מאוחסנים על 25 מעלות צלזיוס ו -37 מעלות צלזיוס, אשר בטמפרטורות סביבה במדינות טרופיות ותת טרופיות שבו הקדחת Q היא 13 אנדמיים. Assay LAMP פותח במעבדה שלנו כדי לזהות את נוכחותו של ג burnetii בדגימות פלזמה 14. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט להכנת תערובת התגובה LAMP מן ריאגנטים lyophilized. ריאגנטים lyophilized יציבים במשך חודש אחד, כאשר הם מאוחסנים ב RT. בשילוב עם שיטת הדמיה קלה, זוהי שיטה אידיאלית לשימוש לאיתור ג burnetii בסביבת משאב מוגבל.

<table><tbody><tr><td>פריימרים LAMP</td><td>Eurofins MWG אופרון</td><td>10 ננומול, ללא מלח</td><td>רצף שתוכנן על ידי הלקוח</td></tr><tr><td>Bst DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>10x מאגר תרמו פול</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>תערובת dNTP</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 מ"מ כל אחד</td></tr><tr><td>בטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B0300</td><td>5 מ', טרימתילגליצין</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>מאגר טעינת ג'ל</td></tr><tr><td>SYBR ירוק</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10,000x, לדמיין מוצרים בצינורות</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phoenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10,000x, לדמיין מוצרים בג'לים</td></tr><tr><td>ריאגנטים ליופיליים</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxynaphthol כחול</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQuant סורק צינור</td><td>Qiagen</td><td></td><td>זיהוי בזמן אמת</td></tr></tbody></table>

התפתחות lyophilized loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של<em&gt; burnetii coxiella</em

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Burnetii Coxiella, סוכן גרימת הקדחת Q, הוא חיידק תאי לחייב. מבחני אבחון מבוסס PCR פותחו לאיתור ג DNA burnetii בתרביות דגימות קליניות. PCR דורש ציוד מיוחד והכשרת משתמש קצה נרחבת, ולכן, זה לא מתאים לעבודה שיגרתית במיוחד באזור המוגבל במשאבים. פתחנו הגברת isothermal בתיווך לולאה (LAMP) assay כדי לזהות את נוכחותו של ג burnetii בדגימות המטופל. שיטה זו מבוצעת בטמפרטורה יחידה סביב 60 מעלות צלזיוס באמבט מים או בלוק חימום. הרגישות של assay LAMP זה דומה מאוד PCR עם גבול גילוי של כ -25 עותקים לכל תגובה. דו&quot;ח זה מתאר את הכנת התגובה באמצעות ריאגנטים lyophilized ויזואליזציה של התוצאות באמצעות כחול hydroxynaphthol (HNB) או מנורת UV עם צבע intercalating פלורסנט התגובה. ריאגנטים LAMP היו lyophilized ו לאחסן בטמפרטורת החדר (RT) במשך חודש ללא הפסד של רגישות זיהוי. assay LAMP זהו חזק במיוחד משום הכנת תערובת התגובה אינה כרוך צעדים מורכבים. שיטה זו היא אידיאלית לשימוש הגדרות משאב מוגבל שבו קדחת Q הוא אנדמי.

ריאגנטים LAMP lyophilized בתוך הצינור 0.2 מ&quot;ל מכיל DNA פולימרז BST, תחל ו dNTPs. 20 μl של חיץ הכינון מחדש משמש מחדש להשעות את ריאגנטים lyophilized. איור 1 מציג את תוצאות התגובה LAMP על ג&#39;לים agarose עם ריאגנטים מוכן טרי ריאגנטים lyophilized. מגיב lyophilized לא לצמצם את פעילותו. התגובות LAMP שהכין ריאגנטים שניהם יכולים לזהות 25 עותקים של תבנית ה- DNA. תרשים 2 מציג את זיהוי של תוצרי התגובה עם HNB א...

תיארנו כאן שיטת הגברה איזותרמית פשוטה בתיווך לולאה (LAMP) באמצעות ריאגנטים ליופיליים לזיהוי C. burnetii בדגימות חולים.

התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לפתח שיטת LAMP פשוטה המשתמשת בריאגנטים ליאופיליים (lyophilized) לזיהוי של C.burnetii בדגימות של מטופלים. היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שאינו נדרש קירור לאחסון הריאגנטים. שיטה זו אידיאלית לשימוש בסביבות עם משאבים מוגבלים שבהן חום Q הוא אנדמי.את הפרוצדורה תדגים טטיאנה, טכנאית מהמעבדה שלנו. החל מ-DNA עבור הגן המטרה IS1111a מ-C.burnetii RSA493, קבעו את ריכוז הפלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטר ב-260 ננומטר. המירו את ריכוז ה-DNA הפלסמי למספר עותקים באמצעות החישובים הבאים, כאשר 6330 שווה לאורך זוגות הבסיסים של הפלסמיד, ו-34.2 ננוגרם למיקרוליטר הוא ריכוז הפלסמיד, כפי שנקבע זה עתה באמצעות הספקטרופוטומטר.לאחר מכן, הכינו דילולים סדרתיים של הפלסמיד ביחס של 8 עד 10, כדי להגיע למספר העותקים הבא למיקרוליטר. כדי להכין את תבנית ה-DNA לתגובת ה-LAMP, התחילו עם 200 מיקרוליטר של דגימות פלזמה אנושית, ובאמצעות ערכת DNA miniprep, בצעו את מיצוי ה-DNA בהתאם לפרוטוקול היצרן. דללו את הדגימה הסופית לנפח של 20 מיקרוליטר.הכינו 1 mililiter של באפר תגובה 2x LAMP על ידי ערבוב הרכיבים הבאים. ערבבו באמצעות pulse-vortexing למשך 10 שניות. לביצוע תגובת LAMP סטנדרטית, ערבבו בתוך מבחורת PCR של 0.2 milliliter כמות של 12.5 microliters של באפר 2x LAMP, כ-1.2 microliters של תערובת פריימרים, 1 microliter של Bst DNA polymerase ו-5.3 microliters של מים.בשלב הבא, הוסף 5 µL של DNA לתגובה בנפח 20 µL וערבב היטב, ולאחר מכן דגור בטמפרטורה של 60 °C במקלחית או בבלוק חימום למשך 60 דקות. לאחר הדגירה, הפסק את התגובה על ידי הוספה של 5 µL של 10x gel loading buffer לשפופרת. לאחר מכן, טען 5 µL מתוצרי התגובה על ג'ל agarose בריכוז 2% שנצבע בצבע למסוכים חומצות גרעיניות (intercalating nucleic acid stain).הרץ את הג'ל ב-1x TBE במתח של 100 וולט למשך 35 דקות, ולאחר מכן השתמש באור UV כדי להדמיא את התוצאות. כדי לבצע את תגובת ה-LAMP עם ריאגנטים ששוחזרו, הכן 1 מיליליטר של תמיסת שחזור על ידי שילוב הריאגנטים הבאים. ערבב באמצעות pulse-vortexing למשך 10 שניות.בשלב הבא, הוצאו את המבחנות שהכילו את הרכיבים הליופיליים (lyophilized reagents) מתוך שקיות רדיד האלומיניום האטומות. עבור שלב 4.2, חשוב מאוד לוודא ששקית רדיד האלומיניום אטומה כראוי לפני פתיחתה. אין להשתמש במבחנות אם שקית האלומיניום אינה אטומה או פגומה.הוסיפו 20 µL של תמיסת reconstitution buffer לכל מבחנה של ריאגנטים וערבבו באמצעות פיפוט למעלה ולמטה חמש פעמים. ודאו שהריאגנטים הליופיליים הומסו באופן מלא. לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של תבנית DNA לריאגנטים המומסים וערבבו היטב.דגרו בטמפרטורה של 60 °C באמבט מים או בבלוק חימום למשך 60 דקות. כדי להפסיק את התגובה לאחר הדגירה, הוסיפו 5 µL של gel loading buffer בריכוז 10x, ולאחר מכן טענו 5 µL מתוצרי התגובה על ג'ל agarose בריכוז 2% הצבוע בצבע למסמני חומצות גרעין (intercalating nucleic acid stain). הריצו את הג'ל בבופר 1x TBE במתח של 100 volts למשך 35 דקות, ולאחר מכן הדמינו את התוצאות באמצעות אור UV.לביצוע תגובת LAMP עם hydroxynaphthol blue, או HNB, או צבע אינטרקלטיבי, הכין 1 milliliter של בופר reconstitution על ידי שילוב הרכיבים הבאים הכוללים HNB או צבע אינטרקלטיבי פלואורסצנטי. ערבב באמצעות pulse-vortexing למשך 10 שניות. בצע את תגובת ה-LAMP כפי שתואר לעיל והשתמש באור UV או בעין בלתי מזוינת כדי להדמיאן את התוצאות.לביצוע תגובת ה-LAMP באמצעות סורק מבחנות, הוסף 5 µL של DNA לריאגנטים שהוחזרו למצבם הנוזלי ומכילים את צבע האינטרקלציה הפלואורסצנטי, ולאחר מכן הכנס את המבחנה הסגורה לסורק המבחנות. הגדר את טמפרטורת האינקובציה ל-60 °C ומדוד את הפלואורסצנציה באורך גל של 520 nm למשך 60 דקות. איור זה מציג את תוצאות תגובת ה-LAMP על ג'לים של אגרוז עם ריאגנטים שהוכנו באופן טרי ועם ריאגנטים ליופילים.ניתן להבחין כי הריאגנט הליופיליזד שומר על פעילותו. תגובות LAMP שהוכנו באמצעות שני הריאגנטים זיהו 25 עותקים של תבנית DNA. באיור זה מוצגת זיהוי תוצרי התגובה באמצעות HNB או צבע פלואורסצנטי אינטרקלטיבי בתגובה.הוספת HNB לתגובה גורמת לשינוי צבע ויזואלי, מסגול לכחול, בנוכחות של 25, 50 ו-100 עותקים של תבנית DNA בתגובות. בנוסף, הכללת צבע פלואורסצנטי אינטרקלטיבי (intercalating dye) בתגובה מראה אות פלואורסצנטי חזק תחת אור UV כאשר נוכחים מספרי עותקי DNA דומים. מוצגות כאן התוצאות משימוש בסורק מבחנות לניטור אותות הפלואורסצנציה בזמן אמת באמצעות צבע פלואורסצנטי אינטרקלטיבי.האותות הפלואורסצנטיים נמצאים מעל קו הבסיס לאחר 14, 18, 21 ו-23 דקות, עם 10^6, 10^4, 10^3 ו-100 עותקים של תבנית DNA בתגובות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע הליך זה בתוך 90 דקות. לאחר פיתוחו, סלל בדיקה זה פתח את הדרך לאבחון מהיר של זיהום ב-Coxiella burnetii באזורים עם משאבים מוגבלים.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של האופן שבו יש להחזיר למצב פעיל (reconstitute) ריאגנטים של LAMP המצויים בצורה של ליופיליזציה (lyophilized). אל תשכחו שדגימות חולה עלולות להיות מדבקות ויש לנקוט תמיד באמצעי בטיחות בעת ביצוע הליך זה.

the-development-lyophilized-loop-mediated-isothermal-amplification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: דומסל, ק. ג'. ואחרים. הגברה איזותרמית מתווכת לולאה לסינון סלמונלה במזון לבעלי חיים ואישור סלמונלה מבידוד תרבית.  J. Vis. Exp. (2020).סרטון זה מדגים את טכניקת ההגברה האיזותרמית המתווכת בלולאה (LAMP) לזיהוי גן חיידקי מטרה על ידי הגברת DNA בטמפרטורה קבועה. תערובת התגובה מוכנה על ידי הוספת תערובת מאסטר איזותרמית, פריימרים ספציפיים לגן היעד, ודגימות המכילות תבניות DNA. ההגברה מתחילה במכשיר LAMP ומפוטרת פלואורסצנציה בזמן אמת כדי לאשר את נוכחות הגן היעד.

הגברה איזותרמית בתיווך לולאה לזיהוי גנים חיידקיים

סרטון זה מדגים שיטה להערכת הצמיחה התוך-תאית של מוטציות Coxiella המתויגות ב-GFP בתוך תאי אפיתל בתרבית. הפנוטיפ המוטנטי הוא דמיינו באמצעות immunostaining ומיקרוסקופ epifluorescence, המאפשר לחקור את ההשפעה של המוטציה על הצמיחה התאית.

הערכת גדילה תוך-תאית של מוטנטים של קוקסיאלה בתוך תאים אאוקריוטים

האבחנה של זיהום איימריה בתרנגולות נותרה תובענית. גישות המובלות על ידי מורפולוגיה של טפילים ופתולוגיה של מארח אינן חד משמעיות בדרך כלל, בעוד שגישות מולקולריות המבוססות על PCR הוכיחו את עצמן כתובעניות מבחינת עלות ומומחיות. מטרת פרוטוקול זה היא לבסס הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP) כאבחון מולקולרי פשוט לזיהום איימרי.

Isothermal הגברה מבחני בתיווך לולאה (LAMP) לאיתור המינים ספציפי של<em&gt; Eimeria</em&gt; כי להדביק תרנגולות

מסופק הוא פרוטוקול לפיתוח בדיקת הגברת פולימראז רקומבינאז בזמן אמת כדי לכמת את הריכוז הראשוני של דגימות DNA באמצעות מחזורי תרמי או מיקרוסקופ ומחמם במה. כמו כן מתואר פיתוח של בקרה חיובית פנימית. סקריפטים מסופקים לעיבוד נתוני פלואורסצנטיות גולמיים בזמן אמת.

פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית

burnetii Coxiella הוא חיידק גראם שלילי תאיים לחייב אחראי לקדחת Q המחלה zoonotic. כאן אנו מתארים שיטות לדור של מוטציות transposon ניאון Coxiella כמו גם זיהוי האוטומטי וניתוח של פנוטיפים הפנמה, שכפול ורעיל לתאים וכתוצאה מכך.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח ואימות של שיטת PCR כמותית המשמשת לזיהוי וכימות של DNA EHV-2 בנוזלי נשימה של סוסים. פרוטוקול האימות EHV-2 qRT-PCR כולל הליך בן שלושה חלקים: פיתוח, אפיון בדיקת qRT-PCR בלבד ואפיון השיטה האנליטית כולה.

פיתוח ותיקוף של שיטת ה- PCR כמותי עבור Equid ההרפס-2 אבחון בנוזלי הנשימה

חוקר את יחסי הגומלין בין חיידקים פתוגנים מארחיהם הוא אזור חשוב של מחקר ביולוגי. כאן אנו מתארים טכניקות צורך למדוד טרנסלוקציה מפעיל ידי burnetii Coxiella במהלך להשתקת גנים siRNA שימוש המצע כלאם.

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; במהלך siRNA השתקה

פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של קלטת קטן, מוכן לשימוש, שניתן להחיל לצורך זיהוי חזותי של מספר חומצות גרעין בבדיקה אחת, קלה לתפעול. בגישה זו, מערך נימי שימש לצורך זיהוי מולטיפלקס ויעיל מאוד של GMO מטרות.

זיהוי ויזואלי של מספר חומצות גרעין ב מערך נימי

הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP) היא מבחן הגברה של חומצת גרעין (iNAAT) אשר משך עניין נרחב בתחום זיהוי הפתוגן. כאן, אנו מציגים פרוטוקולסלמונלה LAMP מרובה מעבדות כשיטה מהירה, אמינה וחזקה להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ולאימות סלמונלה חזקה מבידוד תרבותי.

הגברה איזותרמית בתיווך לולאה להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ואישור סלמונלה מבידוד תרבות

העבודה הנוכחית מתארת את השלבים לייצור qPCR מוכן לשימוש עבור זיהוי DNA T. cruzi שניתן לטעון מראש על כלי התגובה ולאחסן במקרר במשך מספר חודשים.

qPCR מוכן לשימוש לזיהוי דנ"א מטריפנוזומה קרוזי או אורגניזמים פתוגניים אחרים

פתוגנים חיידקיים שונים עלולים לגרום לזיהומים בדרכי הנשימה ולהוביל לבעיות בריאותיות חמורות אם לא מזהים אותם במדויק ומטפלים בהם מיד. זיהוי מהיר ומדויק של פתוגנים אלה באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה מספק ניהול ובקרה יעילים של זיהומים בדרכי הנשימה בסביבות קליניות.

זיהוי מהיר של פתוגנים חיידקיים הגורמים לזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה בתיווך שבב מיקרופלואידי

למד שיטת LAMP מבוססת ריאגנטים מיובשים לזיהוי C. burnetii בדגימות חולים. שיטה זו מפשטת אבחון Q fever בהגדרות משאבים מוגבלים ומאפשרת אחסון ללא קירור.

התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של

גלה סרטונים נוספים