התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לפתח שיטת LAMP פשוטה המשתמשת בריאגנטים ליאופיליים (lyophilized) לזיהוי של C.burnetii בדגימות של מטופלים. היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שאינו נדרש קירור לאחסון הריאגנטים. שיטה זו אידיאלית לשימוש בסביבות עם משאבים מוגבלים שבהן חום Q הוא אנדמי.

את הפרוצדורה תדגים טטיאנה, טכנאית מהמעבדה שלנו. החל מ-DNA עבור הגן המטרה IS1111a מ-C.burnetii RSA493, קבעו את ריכוז הפלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטר ב-260 ננומטר. המירו את ריכוז ה-DNA הפלסמי למספר עותקים באמצעות החישובים הבאים, כאשר 6330 שווה לאורך זוגות הבסיסים של הפלסמיד, ו-34.2 ננוגרם למיקרוליטר הוא ריכוז הפלסמיד, כפי שנקבע זה עתה באמצעות הספקטרופוטומטר.

לאחר מכן, הכינו דילולים סדרתיים של הפלסמיד ביחס של 8 עד 10, כדי להגיע למספר העותקים הבא למיקרוליטר. כדי להכין את תבנית ה-DNA לתגובת ה-LAMP, התחילו עם 200 מיקרוליטר של דגימות פלזמה אנושית, ובאמצעות ערכת DNA miniprep, בצעו את מיצוי ה-DNA בהתאם לפרוטוקול היצרן. דללו את הדגימה הסופית לנפח של 20 מיקרוליטר.

הכינו 1 mililiter של באפר תגובה 2x LAMP על ידי ערבוב הרכיבים הבאים. ערבבו באמצעות pulse-vortexing למשך 10 שניות. לביצוע תגובת LAMP סטנדרטית, ערבבו בתוך מבחורת PCR של 0.2 milliliter כמות של 12.5 microliters של באפר 2x LAMP, כ-1.2 microliters של תערובת פריימרים, 1 microliter של Bst DNA polymerase ו-5.3 microliters של מים.

בשלב הבא, הוסף 5 µL של DNA לתגובה בנפח 20 µL וערבב היטב, ולאחר מכן דגור בטמפרטורה של 60 °C במקלחית או בבלוק חימום למשך 60 דקות. לאחר הדגירה, הפסק את התגובה על ידי הוספה של 5 µL של 10x gel loading buffer לשפופרת. לאחר מכן, טען 5 µL מתוצרי התגובה על ג'ל agarose בריכוז 2% שנצבע בצבע למסוכים חומצות גרעיניות (intercalating nucleic acid stain).

הרץ את הג'ל ב-1x TBE במתח של 100 וולט למשך 35 דקות, ולאחר מכן השתמש באור UV כדי להדמיא את התוצאות. כדי לבצע את תגובת ה-LAMP עם ריאגנטים ששוחזרו, הכן 1 מיליליטר של תמיסת שחזור על ידי שילוב הריאגנטים הבאים. ערבב באמצעות pulse-vortexing למשך 10 שניות.

בשלב הבא, הוצאו את המבחנות שהכילו את הרכיבים הליופיליים (lyophilized reagents) מתוך שקיות רדיד האלומיניום האטומות. עבור שלב 4.2, חשוב מאוד לוודא ששקית רדיד האלומיניום אטומה כראוי לפני פתיחתה. אין להשתמש במבחנות אם שקית האלומיניום אינה אטומה או פגומה.

הוסיפו 20 µL של תמיסת reconstitution buffer לכל מבחנה של ריאגנטים וערבבו באמצעות פיפוט למעלה ולמטה חמש פעמים. ודאו שהריאגנטים הליופיליים הומסו באופן מלא. לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של תבנית DNA לריאגנטים המומסים וערבבו היטב.

דגרו בטמפרטורה של 60 °C באמבט מים או בבלוק חימום למשך 60 דקות. כדי להפסיק את התגובה לאחר הדגירה, הוסיפו 5 µL של gel loading buffer בריכוז 10x, ולאחר מכן טענו 5 µL מתוצרי התגובה על ג'ל agarose בריכוז 2% הצבוע בצבע למסמני חומצות גרעין (intercalating nucleic acid stain). הריצו את הג'ל בבופר 1x TBE במתח של 100 volts למשך 35 דקות, ולאחר מכן הדמינו את התוצאות באמצעות אור UV.

לביצוע תגובת LAMP עם hydroxynaphthol blue, או HNB, או צבע אינטרקלטיבי, הכין 1 milliliter של בופר reconstitution על ידי שילוב הרכיבים הבאים הכוללים HNB או צבע אינטרקלטיבי פלואורסצנטי. ערבב באמצעות pulse-vortexing למשך 10 שניות. בצע את תגובת ה-LAMP כפי שתואר לעיל והשתמש באור UV או בעין בלתי מזוינת כדי להדמיאן את התוצאות.

לביצוע תגובת ה-LAMP באמצעות סורק מבחנות, הוסף 5 µL של DNA לריאגנטים שהוחזרו למצבם הנוזלי ומכילים את צבע האינטרקלציה הפלואורסצנטי, ולאחר מכן הכנס את המבחנה הסגורה לסורק המבחנות. הגדר את טמפרטורת האינקובציה ל-60 °C ומדוד את הפלואורסצנציה באורך גל של 520 nm למשך 60 דקות. איור זה מציג את תוצאות תגובת ה-LAMP על ג'לים של אגרוז עם ריאגנטים שהוכנו באופן טרי ועם ריאגנטים ליופילים.

ניתן להבחין כי הריאגנט הליופיליזד שומר על פעילותו. תגובות LAMP שהוכנו באמצעות שני הריאגנטים זיהו 25 עותקים של תבנית DNA. באיור זה מוצגת זיהוי תוצרי התגובה באמצעות HNB או צבע פלואורסצנטי אינטרקלטיבי בתגובה.

הוספת HNB לתגובה גורמת לשינוי צבע ויזואלי, מסגול לכחול, בנוכחות של 25, 50 ו-100 עותקים של תבנית DNA בתגובות. בנוסף, הכללת צבע פלואורסצנטי אינטרקלטיבי (intercalating dye) בתגובה מראה אות פלואורסצנטי חזק תחת אור UV כאשר נוכחים מספרי עותקי DNA דומים. מוצגות כאן התוצאות משימוש בסורק מבחנות לניטור אותות הפלואורסצנציה בזמן אמת באמצעות צבע פלואורסצנטי אינטרקלטיבי.

האותות הפלואורסצנטיים נמצאים מעל קו הבסיס לאחר 14, 18, 21 ו-23 דקות, עם 10^6, 10^4, 10^3 ו-100 עותקים של תבנית DNA בתגובות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע הליך זה בתוך 90 דקות. לאחר פיתוחו, סלל בדיקה זה פתח את הדרך לאבחון מהיר של זיהום ב-Coxiella burnetii באזורים עם משאבים מוגבלים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של האופן שבו יש להחזיר למצב פעיל (reconstitute) ריאגנטים של LAMP המצויים בצורה של ליופיליזציה (lyophilized). אל תשכחו שדגימות חולה עלולות להיות מדבקות ויש לנקוט תמיד באמצעי בטיחות בעת ביצוע הליך זה.