התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של Burnetii Coxiella

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לפתח שיטת LAMP פשוטה המשתמשת בריאגנטים ליופיליים לזיהוי C.burnetii בדגימות חולים. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שאין צורך באימון לאחסון הריאגנטים. שיטה זו אידיאלית לשימוש במסגרות מוגבלות במשאבים שבהן קדחת Q אנדמית.

תדגים את ההליך טטיאנה, טכנאית מהמעבדה שלנו. החל מ-DNA עבור גן המטרה IS1111a מ-C.burnetii RSA493, קבע את ריכוז הפלסמיד עם ספקטרופוטומטר ב-260 ננומטר. המר את ריכוז ה-DNA של הפלסמיד למספר עותק באמצעות החישובים הבאים, כאשר 6330 שווה לאורך ולזוגות הבסיס של הפלסמיד, ו-34.2 ננוגרם למיקרוליטר הוא ריכוז הפלסמיד, כפי שנקבע זה עתה באמצעות הספקטרופוטומטר.

לאחר מכן הכינו דילולים סדרתיים פי 8 עד 10 של הפלסמיד כדי להגיע למספר העותקים הבא למיקרוליטר. כדי להכין את תבנית ה-DNA לתגובת LAMP, התחל עם 200 מיקרוליטר של דגימות פלזמה אנושיות, ועם ערכת ה-DNA miniprep חלץ את ה-DNA לפי פרוטוקול היצרן. מדללים את הדגימה הסופית לנפח של 20 מיקרוליטר.

הכן 1 מיליליטר של 2x LAMP מאגר תגובה על ידי שילוב הריאגנטים הבאים. מערבבים על ידי מערבולת דופק במשך 10 שניות. כדי לבצע את תגובת ה-LAMP הסטנדרטית, בצינור PCR של 0.2 מיליליטר, מערבבים 12.5 מיקרוליטר של מאגר LAMP 2x, 1.2 מיקרוליטר תערובת פריימר, 1 מיקרוליטר פולימראז DNA Bst ו-5.3 מיקרוליטר מים.

לאחר מכן, הוסיפו 5 מיקרוליטר DNA לתגובה של 20 מיקרוליטר וערבבו היטב, ואז דגרו בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס באמבט מים או בלוק חימום למשך 60 דקות. לאחר הדגירה, סיים את התגובה על ידי הוספת 5 מיקרוליטר של מאגר טעינת ג'ל פי 10 לצינור. לאחר מכן טען 5 מיקרוליטר מתוצרי התגובה על ג'ל אגרוז 2% מוכתם בכתם חומצת גרעין אינטרקלציה.

הפעל את הג'ל ב-1x TBE ב-100 וולט למשך 35 דקות, ולאחר מכן השתמש באור UV כדי לדמיין את התוצאות. כדי לבצע את תגובת ה-LAMP עם ריאגנטים משוחזרים, הכינו 1 מיליליטר של מאגר בנייה מחדש על ידי שילוב הריאגנטים הבאים. מערבבים על ידי מערבולת דופק במשך 10 שניות.

לאחר מכן, הסר את הצינורות שהכילו את הריאגנטים הליופיליים משקית נייר האלומיניום האטומה. עבור שלב 4.2, חשוב מאוד לוודא ששקית נייר האלומיניום אטומה כהלכה לפני פתיחתה. אל תשתמש בצינורות אם שקית האלומיניום אינה אטומה או פגומה.

הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר בנייה מחדש לכל צינור של ריאגנטים וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש פעמים. ודא שהריאגנטים הליופיליים מושעים מחדש לחלוטין. לאחר מכן, הוסף 5 מיקרוליטר של תבנית DNA לריאגנטים המשוחזרים וערבב היטב.

דגירה בחום של 60 מעלות צלזיוס באמבט מים או בלוק חימום למשך 60 דקות. כדי לסיים את התגובה לאחר הדגירה, הוסף 5 מיקרוליטר של מאגר העמסת ג'ל פי 10, ולאחר מכן הוסף 5 מיקרוליטר מתוצרי התגובה על ג'ל אגרוז 2% מוכתם בכתם חומצת גרעין אינטרקלציה. הפעל את הג'ל במאגר TBE 1x ב-100 וולט למשך 35 דקות, ולאחר מכן דמיין את התוצאות על ידי אור UV.

כדי לבצע את תגובת ה-LAMP עם הידרוקסינפתול כחול, או HNB, או צבע אינטרקלינג, הכינו 1 מיליליטר של מאגר בנייה מחדש על ידי שילוב הריאגנטים הבאים הכוללים HNB או צבע אינטרקלטור פלואורסצנטי. מערבבים על ידי מערבולת דופק במשך 10 שניות. בצע את תגובת ה-LAMP כפי שתואר זה עתה והשתמש באור UV או בעין בלתי כדי לדמיין את התוצאות.

כדי לבצע את תגובת ה-LAMP עם סורק צינורות, הוסף 5 מיקרוליטר של DNA לריאגנטים המשוחזרים המכילים את הצבע המשולב הפלואורסצנטי, ולאחר מכן הכנס את הצינור הסגור לסורק הצינורות. הגדר את טמפרטורת הדגירה ל-60 מעלות צלזיוס ומדוד את הקרינה ב-520 ננומטר למשך 60 דקות. איור זה מציג את תוצאות תגובת ה-LAMP על ג'ל אגרוז עם ריאגנטים טריים וריאגנטים ליופיליים.

שימו לב שהמגיב הליופילי שומר על פעילותו. תגובות LAMP שהוכנו על ידי שני הריאגנטים זיהו 25 עותקים של תבנית DNA. באיור זה מוצג זיהוי תוצרי התגובה עם HNB או צבע אינטרקלטור פלואורסצנטי בתגובה.

הוספת HNB לתגובה מייצרת שינוי צבע חזותי, מסגול לכחול, עם 25, 50 ו-100 עותקים של תבנית DNA נוכחים בתגובות. בנוסף, הכללת צבע פלואורסצנטי בתגובה מראה אות פלואורסצנטי חזק עם אור UV כאשר קיימים מספרי עותקי DNA דומים. מוצגות כאן התוצאות משימוש בסורק השפופרות לניטור האותות הפלואורסצנטיים בזמן אמת עם צבע אינטרקלציה פלואורסצנטי.

האותות הפלואורסצנטיים נמצאים מעל קו הבסיס לאחר 14, 18, 21 ו-23 דקות, עם 10^6, 10^4, 10^3 ו-100 עותקים של תבנית DNA בתגובות. לאחר שליטה, ניתן לבצע הליך זה תוך 90 דקות. לאחר פיתוחה, בדיקה זו סללה את הדרך לאבחון מהיר של זיהום Coxiella burnetii באזורים מוגבלים במשאבים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב מחדש ריאגנטים של LAMP ליופיליזציה. אל תשכח שדגימות מטופלים עלולות להיות זיהומיות ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה.