Name: הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם באתרו הכלאה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: למד טכניקת הר הכנה שטוחה לעוברי דג זברה צבועים ב-WISH להסרת חלבון הביצה ושיפור הדמיית מבנים אמבריוניים. שיטה זו מאפשרת תצפית ממבט גבי וחקר אורגנוגנזה ב-Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מימון לRAW מכל אחד מאלה: מענקי NIH K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; במרץ של הפרס להעניק # הפרוטות בזיל אוקונור Starter Scholar 5-FY12-75; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעי ביולוגיה. היינו במיוחד רוצים להודות לאליזבת ומייקל גלאגר, יחד עם כל משפחת גלאגר, שהנחילה מתנה נדיבה לאוניברסיטת הנוטר דאם לטפח מחקר בתאי גזע. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד. אנו מודים לצוותות של המחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטרה דאם על המסירות יוצאת דופן שלהם בטיפול וברווחה של המושבה דג הזברה שלנו. לבסוף, אנו מודים לחברים של מעבדת המחקר שלנו להערות, הדיונים ותובנות על עבודה זו שלהם, כמוגם ציפורן חתול (Maripooka) וZinnia Wingert למתן באופן טבעי לשפוך שפם של חתולים כדי להפוך את כלי ריסים מעולים ביותר למחקר שלנו.

<ol><li>Laale, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+use+of+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio+in+fisheries+research.+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review.</a> J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Goldsmith, J. R., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Think+small%3A+zebrafish+as+a+model+system+of+human+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Think small: zebrafish as a model system of human pathology.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li>
<li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).</li>
<li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet+3%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet 3. , (1922).</li>
<li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+form+retinoic+acid+and+irx3b%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+screening+in+zebrafish%3A+swimming+in+potential+drug+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies.</a> WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+3rd+ed%22">The Zebrafish Book. 3rd ed</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+probe+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5036%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5037%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+mounting%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5038%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).</li>
<li>Machluf, Y., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mRNA+expression+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+whole+mount+high-resolution+double+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. 25 (25), (2009).</li>
<li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).</li>
<li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).</li>
<li>Lagendijk, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+details%3A+whole+mount+microRNA+in+situ+hybridization+protocol+for+zebrafish+embryos+and+adult+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues.</a> Biol Open. 1, 566-569 (2012).</li>
<li>Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+genetics+in+a+small+vertebrate%2C+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).</li>
<li>Galloway, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Gata1+but+not+Gata2+converts+erythropoiesis+to+myelopoiesis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos.</a> Dev Cell. 8, 109-116 (2005).</li>
<li>Barrallo-Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+survival+and+differentiation+in+zebrafish+depends+on+mont+blanc%2Ftfap2a+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function.</a> Development. 131, 1463-1477 (2003).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

דג הזברה הוכיחו להיות אורגניזם מודל יקר מאוד בכל רחבי קהילת המחקר בשנים האחרונות. דג הזברה להפגין מידה ניכרת של שימור גנטי עם זה של בעלי חוליות גבוהות יותר, ויתרונות הנוגעים לאנטומיה, הרבייה, ומחזור החיים שלהם להפוך את המין הזה מאוד נוח לניתוח ניסיוני. יתר על כן, הקידום של טכניקות מולקולריות החלים על דג הזברה קידם עוד יותר את השימוש באורגניזם מודל זה במחקר מדעי. לדוגמא, מגוון רחב של קווי דג הזברה מהונדסים כבר נוצר כדי ללמוד את התקדמות מחלה וכדי לענות על שאלות מהותיות רבות העומדות בבסיס המנגנונים המרכזיים של פיתוח כולל organogenesis. בהתאם לכך, המבוסס על השימוש הדינמי של דג הזברה בשתי מחלות ומחקר התפתחותי, מתודולוגיות תיוג תא וכימות אות הם היבט חיוני של נתונים ניתוח. בעוד שיטות שמעסיקות ניאוןtibodies יכול לשמש כדי לזהות ביטוי חלבון בדג זברה מהונדס, חוקרים בדרך כלל מסתמכים על נהלים סטנדרטיים כמו מאחל 12-16 לבחון את לוקליזציה spatiotemporal של תעתיקי גנים במדגם דג הזברה, שאינו מהונדס קבוע. למעשה, רצון הוא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר בביולוגיה 16, והוא כלי חיוני המשמש כדי לאפיין את הפנוטיפ של מוטציות גנטיות והפרעות גנטיות כימיות. יחד עם זאת, משאלה קשורה במספר מלכודות ואתגרים פוטנציאליים. כדי לאשר את הספציפיות של ribroprobe antisense, יכולה לשמש riboprobes התחושה כביקורת על מנת להעריך את הספציפיות של דפוסי מכתים riboprobe antisense. בעוד סעיפי 4 ו 5 מוצגים לפי הסדר של תיוג וזיהוי של חללית שכותרת digoxygenin ואחרי בדיקה שכותרתו והעמסת, יכול להיות הפוך צו זה. בדרך כלל, אותות חלשים (גנים עם רמות ביטוי נמוכות יותר) מזוהים ביותר עם בדיקות שכותרת digoxygenin והכתם הזהפותח לראשונה עם מצע סגול, ואחרי זיהוי וצביעת האות החזק (גן הביע יותר בשפע) באמצעות המצע האדום. עם זאת, אם תגובות בשני צבעים הולכים להתבצע, מומלץ ששילובים שונים של תוויות ומצעים נבדקים כדי למצוא את ההליך כי הוא מתאים ביותר לאיסוף נתונים ולניתוח. בנוסף, הפעמים הניתנות לחסימה, דגירה נוגדן ושטיפה אמורה בסעיפים 4-5 מותאמים לעוברים צעירים מ24 שעות שלאחר הפריה; מרווחים ארוכים של אותם שלבים עם עוברים מבוגרים יכולים לגרום להצטברות מלח על המדגם. טיפים נרחבים לפתרון בעיות מאחלות עובר דג הזברה סטנדרטית כבר תועדו בספרות 12-16. ניתן לטעון את הדילמה הנפוצה ביותר היא רקע גבוה. אנו ממליצים להגדיל את מספר שטיפות MABT ב4.7 ל15-20 שוטף שלב במידת צורך, אם כי, בניסיון שלנו התוספת של &#39;סופר השטיפה&#39; MABT הלילהנותן תוצאות יוצאות דופן הפועלת בשיתוף עם 10 או יותר שטיפות MABT קצרות לפני שתמשיך לשלב 4.8. דילמת דוגמא נוספת היא חדירת בדיקה עניות, אשר יכול להתרחש עם riboprobes הארוכה. גז riboprobe הבא שלב 3.6 באמצעות הידרוליזה בסיסית יכול לנטרל את זה. מניסיוננו עם דגימות צעירות, לא נדרש גז בדיקה בדרך כלל. עם זאת, יש לזכור כי פרמטרים כמו זה יכול להיות גורמים תורמים בתוצאה של ניסוי משאלה, ואנו מציעים בחינה של ההוראות לפתרון בעיות שימושיות הללו כבר זמינים לציבור בקהילה לפי צורך כדי לשפר את הפרמטרים הניסיוניים למאחלים בעצמך מחקר 12. בנוסף לטכניקות מאחלים מסורתיות 12-16, חלה צמיחה מתמדת של התקדמות במתודולוגיות רוצים ופרוטוקולים חלופיים שגובשו. אלה כוללים דרכים חדשות לזיהוי אות, כגון באמצעות השימוש בנורותcence 17-19, לשיטות המאפשרות הלוקליזציה של מיקרו RNA 20. אף על פי כן, למרות שיפורים הרבים שנעשו לשיטות תיוג התא הנוכחיות, את האפקטיביות של נהלים אלה שללו אם הכתם (ים) לא ניתן דמיינו בקלות בתוך המדגם של עניין בנקודת זמן רצוי. מגבלה זו היא בעייתית עבור חוקרים במיוחד כאשר הוא נוגע לשלבים העובריים המוקדמים של ontogeny דג הזברה, אשר עלול להוביל לפערים בהבנה של תהליכים התפתחותיים שונים המתעוררים בזמנים אלה שלנו. במהלך פיתוח דג הזברה רגיל, שק החלמון יהיה בהדרגה הירידה בגודל כמו גילאי עובר 11. לכן, בשלבי התפתחותיים המאוחרים יותר אלה (&gt; 24 שעות שלאחר הפריה), מכתים מאחל הוא פשוט למדי כדי לנתח כי העובר הוא גדול יותר בהשוואה לצק החלמון הצמוד שלה. עם זאת, זה לא המקרה מהשלב ניצן הזנב לsomitogenesis מוקדם (כאשר העוברימסה ממוקמת סביב החלמון) שבו שק החלמון האטום לפעמים יכול לטשטש את ההדמיה של הכתם. כתוצאה מכך, השיטה של הרכבה שטוחה תוכננה כדי לעזור להקל על בעיות ההדמיה וניתוח נתונים הקשורים לאפיון של דגימות מוקדם דג הזברה עובר (schematized באיור 1 ואיור 2), וכבר בשימוש רחב מאז phenotyping השיטתי של מוטציות גנטיות מבודדות מהמסכים בקנה מידה הגדולה הראשונים הגנטיים 21. מאז כניסתו של טכניקת ההרכבה שטוחה, הניתוח של שלבי התפתחות מוקדמים שופר באופן משמעותי. ברגע שהחלמון הוא להסיר את העובר, ניתן להניח שטוח העובר בשקופית זכוכית בכיוון הרצוי להדמיה. עמדה דו ממדים זה מאפשרת צפייה של כל העובר בבת אחת, מה שמבטל את הצורך לסובב את המדגם. רקמות רבות נמצאות בתחומים רחבים של העובר, כגוןסימנים מקדימים היוצרים את הדם והכליות. יתר על כן, אפשר צריך להשוות את מספר רקמות מתפתחות שונות בכל פעם. הרכבה שטוחה מאפשרת לחוקר בו זמנית כדי להציג את התחום כולו של קבוצות תאים כאלה, ולכן יכול מאוד לסייע quantifications כגון מדידת שטח לרקמות או ספירת תאים. טכניקה זו סופו של דבר סייעה להוביל לתגליות רבות הנוגעות למגוון רחב של מנגנוני התפתחות חשובים שבבסיס hematopoiesis, נוירוגנזה, וorganogenesis. לפיכך, שולטים פעם, הבקשות לטכניקה פשוטה זו עבור חוקרים הן משמעותיות למדי. לדוגמא, במחקר שבחן בחירת שושלת במהלך hematopoiesis, שטוח הר הכנות של עוברי דג הזברה בשלבי 14 ו18 somite (SS) שימש כדי להמחיש את השינויים שחלו בדפוס הביטוי של גורם שעתוק אצבע אבץ pu.1 בין morpholino wild-type ו gata1 הזריק עוברים 22.שיטה זו אפשרה את זיהוי של תחום pu.1 התרחב ב18 ss, המציין כי gata1 סביר להניח שמסדיר את הביטוי של pu.1 במסת תאי ביניים (ICM) סביב נקודה זו בזמן. עוברי דירה נוסף רכובים מוכתמים עבור גנים erythroid שונים כולל gtpbp1 וepsin הוכיחו הפסד בביטוי של גנים אלה במוטנטים VLT שהיו gata1 - / -. ניתוחים נוספים הראו שום שינוי בביטוי של גנים erythoid כמו biklf וtesthymin שהיו ידועים להיות עצמאי של פעילות gata. לכן, בשיתוף עם תוצאות הניסוי האחרות שלהם, נחשף כי gata1 חיוני בויסות ההתמיינות של תאים בתוך שושלת myelo-erythroid. במחקר של פיתוח רכס עצבי, תושבות שטוחות שימשו כדי לבחון ביטוי crestin במון בלאן מוטציות (M610 אספסוף) במחקרבוחן את התפקידים של מון בלאן ותפקוד גן tfap2a 23. ב10 ו20 ss, ביטוי crestin היה מבוטל לחלוטין בראשו וירד באזור תא המטען של מוטציות M610 אספסוף בהשוואה לביטוי הנורמלי wild-type, סופו של דבר מסייע לקבוצה זו להגיע למסקנה על החשיבות של מון בלאן וtfap2a רגולציה במהלך היווצרות רכס עצבית. בנוסף, במונחים של organogenesis, תושבות שטוחות אפשרו גילוי נוכחותם של תחומים שונים בתחום אב הכליות מוקדם במהלך ההתפתחות של הכליה העוברית דג הזברה, המכונה הכליה ראשית. עובר דג הזברה מספק מערכת שימור ובכל זאת מבחינה אנטומית פשוטה ללמוד כיצד אבות כליות להצמיח יחידות תפקודיות נפרון המרכיבות את הכליה ראשית, תהליך המכונה nephrogenesis 6,7 (איור 4). ניתוח הר שטוח כבר שימושי לתחומים מסמך מחדשאבות nal ולנתח את התוצאה של שינויים באיתות RA במהלך הכליה ראשית דפוסי 6,7 (איור 5), שהיה ידוע קודם לכן. יחדיו, דוגמאות אלו מצביעות על כך שיש אכן הרבה יישומים רחבים לכך שטוח הר פרוטוקול במחקר של תהליכים מגוונים המתרחשים במהלך התפתחות נורמלית ומדינות חולות. מבחינה מושגית, הליך ההר השטוח הזה הוא פשוט למדי כולל. עם זאת, המניפולציות ומידת העידון הנדרשת כדי לשלוט בשיטה זו יכולות להיות מאתגרות למדי לאדון בהעדר ההפגנה חזותית. לכן, פרוטוקול זה נערך כדי לאפשר לחוקרים, במיוחד אלה חדשים מודל דג הזברה, עם ההזדמנות להבין טוב יותר כיצד לבצע את הטכניקה הזו ולשתף את העצה שלנו על חומרים כימיים שיכול לייעל את הטיפול ברקמות. אנו מקווים כי פרוטוקול זה יהיה סופו של דבר לאפשר לאחרים בקהילה כדי לחדד את תנאי מדגם האידיאלי ביותר להיות uSED הדמיה פרמיה, ניתוח נתונים, ותקשורת של התוצאות שלהם בפרסומים. סופו של דבר, זה אמור לאפשר לחוקרים להתגבר על המכשולים האנטומי של דג הזברה בעובר מוקדם, אשר יכול לטשטש את המצגת של תוצאות ניסוי, ולפתור אותן באמצעות השימוש בטכניקה פשוטה אך משמעותית זו.

דג הזברה, Danio rerio, הפכה לאורגניזם בשימוש נרחב בחקר הביולוגיה התפתחותית. דג הזברה הם טרופי מיני חוליות של מים מתוקים, השייכת למשפחה Cyprinidae. דג הזברה שימשו במקור למחקר סביבתי כדי להשיג מידע על הסיכונים של מזהמי מים פוטנציאליים, כפי שהיו השגה בקלות, זולים, וקל לתחזוקת 1. בשלושים השנים האחרונות, דג הזברה הפכה מוכרת כמערכת מודל חוליות גנטית צייתנית עבור שורה של סיבות. דג הזברה מראה רמה גבוהה של שימור אנטומיים ופיזיולוגי עם חוליות גבוהות כולל יונקי 2,3. ביאור רצף הגנום לאחרונה גילה כי כ -70% מהגנים באדם יש מקבילה דג הזברה אחד לפחות 4. לדוגמא, רבים גנים orthologous כי לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות כליות זוהו בין המינים אלה 5-7. חדר כל זהתואר Matic של שימור בכל הקשור לביולוגיה תאית ומולקולרית אפשר לחוקרים ליצור מודלים עבור מגוון רחב של מחלות בבני אדם בדג הזברה 8, ודג זברה הפכו כלי רב ערך כדי לזהות טיפולים תרופתיים פוטנציאליים באמצעות מסכי גנטיים כימיים 9. יתר על כן, מודל דג הזברה הוא לא רק מסוגל לשחזר מגוון רחב של תהליכים התפתחותיים מורכבים ומדינות מחלה כי הם ראו בבני אדם, אבל כמה תכונות נוספות גם להגביר את האטרקטיביות שלו כאורגניזם מודל למחקרים עובריים. דג הזברה הוא מטיל ביצים ומתרבה באמצעות השרצה שידור, המספקת לחוקרים עם גישה קלה לעוברים מהתחלתה של הפריה 10. יתרונות נוספים כוללים גודל עובר, שקיפות, והתפתחות מהירה, חיצונית 10. בנוסף, מבוגרים דג הזברה יש פוריות גבוהה ובדרך כלל לייצר בגדלים מצמד גדולים יחסית שיכול לנוע בין 200-500בשבוע, סופו של דבר מאפשר לחוקרים לבצע ניסויי תפוקה גבוהים, כגון מסכי כימיים פנוטיפ מבוסס, בקלות 9. אף על פי כן, למרות שפע של יתרונות שמוצגים על ידי מודל דג הזברה, ישנם אתגרים הנוגעים לניתוח והתקשורת של תוצאות הניסוי המתקבלות משלבי התפתחות מוקדמים. במקרים מסוימים, את האנטומיה הפנימית של עובר דג הזברה יכולה לטשטש ויזואליזציה של נתונים של אחד. לאחר הפריה, התא הראשוני עובר אירועי מחשוף מרובים כפיתוח מתקדם 11. בעקבות gastrulation, הציר העוברי מתגלה בשלב tailbud (10 hpf), כך שהוא עוטף את החלמון 11. כפיתוח הבא מתקדם דרך תקופת הפילוח, תא המטען יגדל במסה וגם להאריך ידי התארכות צירית כך שזנב יחד עם חלק מצק החלמון עצמו להאריך מ המוני החלמון המרכזי11. בין tailbud ו20 שלב somite (19 hpf), מנסה להתבונן בתכונות התפתחותיים ספציפיות לאחר הניצול של פרוטוקולי צביעה שונים, כגון רוצה, יכול להיות מאתגר גם כדי לחזות ולצלם בשל הגיאומטריה של העובר ואטימות של שק החלמון. דרך אחת לחסל את האתגרים הללו היא להסיר את החלמון ולאחר מכן לשטח את העובר למדגם דו ממדים שניתן לנתח באופן ישיר יותר. משאבי הפרוטוקול והסרטון הבאים מספקים מדריך לאיך deyolk בהצלחה ושטוח הר עובר הבא קיבוע וצביעה, תוך שימוש בדוגמא של אחד או הכתמה מאחלת בשני צבעים. רצון הוא טכניקה בשימוש נרחב, המאפשרת זיהוי של חומצות גרעין ספציפיות בדגימות נשמרו ובכך מאפשרת לאתר (ים) של ביטוי גנים כדי להתגלות בתוך רקמות. טכניקות מאחלות כבר תוארו בהרחבה, וניתן לבצעו עם מצעים בצבע שונים, כמו גם שפעתמערכות גילוי orescent 12-20. כאן אנו מספקים פרוטוקול המאחלים שונה שלנו המשמש לעוברי דג הזברה בין שלבי tailbud ופילוח של פיתוח. פרוטוקולים מאחלים אלטרנטיביים, לעומת זאת, עולים בקנה אחד עם הליך ההר השטוח שתואר כאן, כפי שציינו בתחילת דבריו של הפרוטוקול בהמשך. בנוסף, הרכבה שטוחה יכולה להיות מנוצל בשיתוף עם מספר כלשהו של טכניקות הדמיה קיימות, כגון אימונוהיסטוכימיה ההר שלמה, או תוויות מעקב שושלת תא, שאינם מתוארות בפרוטוקול זה. בסך הכל, בטכניקה של הרכבה שטוחה יכולה יותר לאפשר ניתוח והצגה מעולים של נתונים המתקבלים מניסויים בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות עוברית בדג הזברה.

<table><tbody><tr><td>50 X E3</td><td></td><td></td><td>250 מ"מ NaCl, 8.5 מ"מ KCl, 16.5 מ"מ CaCl<תת>2, 16.5 מ"מ MgSO4 במים מזוקקים. תוסף תזונה עם מתילן כחול (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) כדי לעכב זיהום.</td></tr><tr><td>1 X E3</td><td></td><td></td><td>יש לדלל 50 X E3 במים מזוקקים.</td></tr><tr><td>מסננת תה רשת</td><td>חנות תה אנגלית</td><td>מק"ט #ASTR_KEN, MPN#1705</td><td></td></tr><tr><td>צלחת דגירה של עוברים</td><td>פלקון</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה העברה</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה תחתון שטוח</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון זכוכית</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>חומר ניקוי 0.1% Tween-20 ב-1x PBS, המיוצר על ידי דילול 10x PBS במים מזוקקים.</td></tr><tr><td>מלאי Tween-20 American</td><td>Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>ממיסים 4% PFA (w/v) ב-1x PBS, מביאים לרתיחה על פלטה חמה במכסה אדים. מצננים ומקפיאים לאחסון בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>יחידת עיקור מסנן</td><td>Corning</td><td>430516</td><td>מערכת סינון 1 ליטר, 0.45 &mu; m CA</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03-115-879-001</td><td>ממיסים במים מזוקקים כדי ליצור ציר פרוטאינאז K (10 מ"ג/מ"ל) ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>50% פורממיד, 5x SSC, 0.1% טווין-20, 5 מ"ג/מ"ל שמרים טורולה RNA, 50 &mu; g/&mu; l הפרין</td></tr><tr><td>DIG/FLU שכותרתו ריבופרוב in vitro ריאגנטים לתגובת שעתוק</td><td>Roche</td><td>11175025910; 11685619910</td><td>עיין בהוראות היצרן.</td></tr><tr><td>SP6 RNA פולימראז</td><td>Roche</td><td>11487671001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז</td><td>Roche</td><td>10881775001</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA פולימראז</td><td>Roche</td><td>11031171001</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase 1</td> מעכב <td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1, 10x DNase 1 buffer</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>רוש</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>אתנול (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>מכיל 50 מ"ל של 100% EtOH ו-70% EtOH (מדולל במים בדרגה מולקולרית) ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>מים מזוקקים בדרגה מולקולרית</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>תרמו</td><td>51221073</td><td>דגם 2831</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American</td><td>Bioanalytical</td><td>AB00600 Store בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td></td></tr><tr><td>פורמולת MAB</td><td></td><td></td><td>2 ליטר: לתוך 1.5 ליטר מים מזוקקים, מערבבים 23.2 גרם חומצה מאלית, 17.5 גרם NaCl, 55.0 גרם בסיס Trisma, ואז מוסיפים 8 מ"ל של 1M Tris-HCl pH 9.5, ולאחר מכן ממלאים ל-2 L. חיטוי.</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>MAB + 0.1% (v/v) פתרון</td></tr><tr><td></td><td></td><td>בלוק</td> Tween-20 <td>אנו מייצרים 50 מ"ל טריים: 10 מ"ל BSA (מ-10% מלאי מעבדה), 5 מ"ל FCS (מהמלאי) ו-35 מ"ל MABT. שמור בלוק שאינו בשימוש ב-4 מעלות; C לשימוש לתמיסת נוגדנים. הערה: הפשירו את מניות ה-BSA וה-FCS ב-37 מעלות; C&ndash; אם מפשירים בטמפרטורה גבוהה יותר הם הופכים לג'ל סמיך (אין להשתמש).</td></tr><tr><td>מלאי FCS (סרום עגל עוברי)</td><td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>Aliquot במנות של 5 או 10 מ"ל ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>מלאי BSA (אלבומין בסרום בקר)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00448</td><td>הכינו מלאי של 10% מדולל ב-MAB על ידי המסת פתיתי ה-BSA בטמפרטורת החדר תוך ערבוב מהיר, ולאחר מכן אחסן 10 מ"ל ב-20 מעלות</td></tr> צלזיוס.<tr><td>נוגדן נגד דיגוקסיגנין</td><td>Roche</td><td>11-093-274-910</td><td>חנות ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>נוגדן נגד פלואורסצאין</td><td>Roche</td><td>11-426-338-910</td><td>חנות ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>צלחת צביעה 12 בארות</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> צביעה מראש <td>100 מ"מ Tris pH 9.5, 50 מ"מ MgCl2, 100 מ"מ NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. הכינו תמיד טרי: זה ישקע במהלך מספר ימים.</td></tr><tr><td>תמיסת צביעה-סגול</td><td></td><td></td><td>על כל 10 מ"ל נדרש: הוסף 45 &#956; l של NBT ו-35 &#956; l של BCIP למאגר טרי לפני צביעה (לא משמש בדגימות עובר).</td></tr><tr><td>תמיסת צביעה-אדום</td><td></td><td></td><td>על כל 10 מ"ל הדרושים: הוסף 31.5 &#956; l של INT ו-35 &#956; l של BCIP למאגר טרי לפני צביעה (לא משמש בדגימות עובר).</td></tr><tr><td>מלאי NBT</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>מאוחסן ב-20 &deg; C; אבקה מדוללת 50 מ"ג/מ"ל ב-70% DMF, 30% מים.</td></tr><tr><td>מלאי INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; C; אבקה מדוללת 55 מ"ג/מ"ל ב-70% DMF, 35% מים.</td></tr><tr><td>מלאי BCIP</td><td>Sigma</td><td>B8503</td><td>מאוחסן ב-20 &deg; C; אבקה מדוללת 50 מ"ג/מ"ל ב-100% DMF.</td></tr><tr><td>DMF (דימתילפורמלדהיד)</td><td>AB00450</td><td></td> <td>ביואנליטי אמריקאי</td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא</td><td>G8898</td><td>0.1 M גליצין, pH 2.2</td></tr><tr><td>צלחת פטרי פלסטיק קטנה</td><td>קורנינג</td><td>430589, 430588</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont פינצטה דפוס #55</td></tr><tr><td>כלי</td><td></td> ריסים<td></td><td>נבנה על ידי הדבקת ריס מתאים לקצה פיפטה (ניתן להשתמש בגדלים הנעים בין P10-P1000) באמצעות דבק-על. אנו משתמשים בריסים אנושיים שנשפכו באופן טבעי, בשפם של בעלי חיים שנשרו באופן טבעי או בשיער פרווה מחויט, או בריסים טבעיים או סינתטיים שנרכשו ממחלקת היופי בחנות תרופות או קמעונאית (ריסים ארוכים במיוחד מתאימים להרכבה יציבה על קצה הפיפטה). קצה הפיפטה מודבק על מוט ישר (באורך 8-10 ס"מ) כגון מחזיק מחט (למשל , Fisher 08-965-A) לטיפול קל. ראו <חזק>איור 3</חזק> לתמונות של הכלים הביתיים האלה.</td></tr><tr><td>מגלשת זכוכית</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 מ"מ</td></tr><tr><td>חימר דוגמנות</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>ניתן להחליף מוצרי חימר דוגמנות מלאכה אחרים.</td></tr><tr><td>מחזיק שקופיות</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587-10</td><td>מגש קרטון לאחסון שקופיות שטוחות.</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ645, מיקרוסקופ מורכב SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ניקון</td><td>80i, 90i</td><td></td></tr></tbody></table>

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

עובר דג הזברה הוא כעת בשימוש נפוץ למחקר בסיסי ויו לחקור את הבקרה הגנטית של תהליכים התפתחותיים ולמודל מומים מולדים. במהלך היום הראשון לחייהם, עובר דג הזברה מתקדם דרך שלבי התפתחות רבים כולל הפריה, מחשוף, gastrulation, פילוח, וorganogenesis של מבנים כגון מערכת עצבים מרכזית בכליות, לב, ו. האנטומיה של עובר דג הזברה צעיר מציגה כמה אתגרים להדמיה והניתוח של הרקמות מעורבות ברבים מהאירועים האלה כי העובר מתפתח בשיתוף עם מסת חלמון עגולה. לפיכך, לניתוח והדמיה של פנוטיפים ניסיוניים בדגימות עובריים קבועות בין tailbud ו20 שלב somite (10 ו19 שעות שלאחר הפריה (hpf), בהתאמה), כמו אלה מוכתמים באמצעות מדויקים הר שלם הכלאה באתרו (לוואי), זה הוא לעתים קרובות רצוי כדי להסיר את העובר מן החלמון בכל וכדי למקם אותו שטוח בשקופית זכוכית. עם זאת, ביצוע הליך הר שטוח יכול להיות מייגע. לכן, מוצלח ויעיל שטוח הר ההכנה היא הקל מאוד דרך ההפגנה החזותית של הטכניקה לנתיחה, וגם עזרו באמצעות חומרים כימיים המסייעים בטיפול ברקמות אופטימליות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול הרצון שלנו לגילוי אחד או בשני צבעים של ביטוי גנים בעובר דג הזברה, ולהדגים כיצד הליך ההרכבה השטוח יכול להתבצע על דוגמא זו של מוכתמת דגימה קבועה. פרוטוקול הרכבה שטוח זה החלים רחב לחקר מבנים רבים עובריים העולות במהלך פיתוח דג הזברה מוקדם, ויכול להיות מיושם בשיתוף עם שיטות צביעה אחרות שבוצעו על דגימות עובר קבועות.

הליך פרוטוקול הרכבה שטוחה כרוך הפיכתו של עובר דג הזברה מהאנטומיה שלה נורמלית, שבה ציר הגוף עטוף סביב חלמון כדור במיקום מרכזי, ל( איור 1 א) הכנה דו ממדים. הדמיה הר שלמה של עובר דג הזברה הצעיר מוגבלת על ידי הטבע של איך הציר העוברי כרוך סביב החלמון. כתוצאה מכך, צפיות לרוחב או גב של הר שלם דגימות עובר מוכתמות יכולות רק לתפוס נתח של הציר או רקמות מסוימות מעורפלות (איור 1). לשם השוואה, deyolking והשטחה של העובר מאפשרים הציר העוברי כולו להיות דמיינו בזמן זה (איור 1). מגבלות אלה הפגינו על ידי בחינת עובר מאחל מוכתם שכותרתו עם riboprobes antisense לזהות irx3b (סגול), אשר מסמן קבוצת משנה של אבות הכליות ממוקמים בסמוך לsomites 7 עד 13, וmyod1 (אדום) אשר תוויותsomites (איור 1). השדה של אבות irx3b + כליות מוסתר בהר השלם תצוגה לרוחב, כי תמלילי irx3b נמצאים בשפע במערכת העצבים המרכזית, מה שהופך את שדה הכליות כמעט בלתי אפשרי לדמיין את זווית מצלמה לרוחב; נוסף, בתחום irx3b + אבות כליות גלוי רק בחלקו, כאשר העובר הוא הסתובב לתצוגת מצלמה הגבי כי השדה כרוך סביב החלמון (איור 1). עם זאת, נוף גב של אותו העובר הבא הרכבה שטוחה מאפשר את כל השדה של irx3b + אבות כליות להיות מנותח באופן ישיר ביחס לsomites לאורך תא המטען ומבנים אחרים עובריים (איור 1). כך, תחומים מרחבית משוכללים יכולים להיות מתועדים באופן אידיאלי בשיטה זו. כמה שלבים עיקריים מעורבים בביצוע המוצלח של הליך ההר השטוח. כדי לבצע techniqu זהדואר, חלמון הכדור חייב להיות מנותק ראשון מהעובר התקין (איור 2 א), שניתן לעשות עם מכשירים עדינים כגון זוג מלקחיים בסדר בזמן שהעובר הוא דמיינו באמצעות סטראו. לאחר ההסרה הגסה של חלמון הכדור, כלי ריסים עדין מנוצל לגרד ממנו גרגרי חלמון שנותרו מחובר לעובר (איור 2). הסרת גרגרי חלמון שנותרו עוזרת להקל להדמיה של הרקמות העובריים. לבסוף, את עובר deyolked הוא מניפולציה כדי למקם אותו ביציבות בשקופית זכוכית (איור 2 ג), המאפשרת תיעוד תצפית ועזרים של המדגם באמצעות תוכנת הדמיה ומצלמה מחוברת למיקרוסקופ. הכלים הריסים הם מכשירים מתוצרת בית שניתן לבנות על ידי הדבקת ריסים מתאימים לקצה פיפטה באמצעות דבק מגע, שיכול להיות מותקן על גבי ידית אם תרצה בכך (איור 3 א, שולחן חומרים). יכולות להיות רכש דגימות ריסים שונים כדי לייצרלהשתלח כלים בעלי מאפיינים שונים במקצת במונחים של אורך ולהתחדד (איור 3 ב), כל משתמש יכול להיות שנטיות שונות לרגע שהם מתחילים להתנסות בהליך ההר השטוח. דוגמאות של דגימות ריסים כוללות באופן טבעי לשפוך ריסים אנושיים, לשפוך שיער מקורזל בעלי חיים או שפם באופן טבעי, ולבסוף זנים סינטטיים של ריסים זמינים מסחרי שנמצאו במחלקות קוסמטיקה הקמעונאי. התקשורת המקומית שמסביב ומכילה את הדוגמא (ו) ממוקמת על (איור 4 א) שקופיות זכוכית ניתן הדמיה לניתוח ברזולוציה גבוהה. שילוב של בדיקות שימשו לתווית אבות הכליות מתפתחים כי להצמיח הכליות בעובר הסוג בר בשלבי התפתחות מוקדמים עם רצון בשני צבעים, ולאחר מכן שטוח הר הכנות בוצעו כדי להציג את הדגימות (איור 4B, 4C ). בשלבים המוקדמים somite, אבות כליות מסומנים בדפוס בצורת U על ידי הביטוי EIR של תמלילי pax2a (סגולים) המקיפים את המזודרם הפרקסיאלית כי במקביל מבטא C דלתא (DLC) (אדום) (בעמודה שמאלית, איור 4) 6,7. לשם השוואה, כאשר תמלילי dlc התגלו עם מצע סגול, ותויגו בשילוב עם krox20 המוח האחורי הסמן (אדום), משנה מקורי של אבות הכליות היה דמיינו שמבטא dlc (עמודה ימנית, איור 4), כפי שצוין בעבר 6,7. ניתן להשתמש בם הכנות הר שטוחים דומה ללמוד שלבי somitogenesis מאוחר יותר. בשלב somite 14, נתחנו את הביטוי של סמני pax2a כליות, slc4a4, וslc12a3 (סגול) יחד עם smyhc1 (אדום), אשר מסמן את somites (איור 4C). שילובים אלה מאפשרים המיפוי של תחום אב כליות השלם עם pax2a, בעוד שחשף כי תת קבוצה של תאים בexpr משנה מקוריessed slc4a4a והצטיינו בתחום משנה הזנב שאינו חופף של אבות כליות שהביעו slc12a3. מאחלי שני צבעים והכנת הר השטוח הם גם בעלי ערך ללימוד של תחומים סלולריים במהלך organogenesis בדג זברה עם מוטציות גנטיות או הפרעות אחרות מהחשיפה הסביבתית למולקולות קטנות 6,7 (איור 5). NLS דג הזברה ומוטציות lib נמל מוטציות בדהידרוגנז אלדהיד 1A2 (aldh1a2, המוכר בשם raldh2), אשר מקודד אנזים דרוש לביוסינתזה של חומצה רטינואית (RA). דלקת מפרקים שגרונית הוא חיונית להתפתחות התקינה של סוגים רבים של תאי כליה כוללים היווצרות של תאי podocyte שתורמים להפוך את מסנן הדם של הכליה העוברית, המכונה glomerulus 6,7. מאחלים בוצעו לתייג את אבות podocyte עם wt1a זמנית עם תיחום של tהוא מתפתח somites עם smyhc1 ומוח אחורי עם krox20 בעוברי wildtype, NLS עוברי מוטציה, עוברים מוטציה lib, ועוברים שטופלו במעכב אנזים aldh כימי, DEAB (איור 5). עוברים עם ביטוי aldh1a2 לקוי הראה ביטוי wt1a מופחת בהשוואה לעוברי סוג בר, ואילו עוברים שטופלו DEAB הראו ביטול של תמלילי wt1a (איור 5, עמודה ימנית). יחדיו, תוצאות נציג אלה מדגימים כיצד טכניקת ההר השטוח ניתן להשתמש בם כדי לנתח ולתעד את הבדלים אנטומיים בדייקנות בעובר המוקדם, ובכך ייושם למחקרים התפתחותיים רבי ערך. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> איור 1. סקירה של תכשירי הר שטוחיםמזון לעוברי דג הזברה. א) ההליך של הרכבה שטוחה מאפשר התצוגה בו זמנית של רקמות לאורך הציר העוברי בגלל מסת החלמון המרכזית מוסרת והעובר ממוקם ביציבות על משטח שטוח. תמונות ב) להר שלם מאחלים עובר מוכתם בתצוגות לרוחב ועל גב, ואז אחרי הכנת הר שטוחה נערכה. העובר היה מוכתם עם בדיקות antisense לזהות תעתיקי גני קידוד irx3b (סגול) וmyod1 (אדום). <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> איור 2. סכמטי של הליך ההר השטוח לעוברי דג הזברה. א) העובר deyolked הראשון גס כדי להסיר את רוב מסת החלמון, ולאחר מכן (ב &#39;) את פני השטח הגחון הוא deyolked דק כדי להסיר גרגרי חלמון שנותרו, ולאחר שטיפת העובר (C) רכוב צד גב בשקופית זכוכית לניתוח חזותי ו / או הדמיה צילום. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> איור 3. תצלומים של כלים ריסים דוגמא בהשוואה למלקחיים בסדר. א) כלים לאש תוצרת בית היו הדמיה לצד זוג סטנדרטי של מלקחיים בסדר, ממוקמים בסמוך לשליט מטרי לספק התייחסות. תצוגה מוגדלת של כלים ריסים לצד המלקחיים בסדר ב &#39;), עם התייחסות המילימטר סיפקה לאורך החלק העליון של התצוגה . שני כלים ריסים שונים מוצגים, עם הכוכבית (*) משמשת כדי לסמן את הריסים מתקבלים באופן טבעי לשפוך עפעף אנושי, וכוכבית כפולה (**) משמשת לסימון ריסים שהושגו משפם של חתולים באופן טבעי לשפוך וגזוז ל להפוך את קצה קהה במקצת. בכל אחד case, הריסים היה מושחל דרך קצה פיפטה ומודבק עם כמה שכבות של דבק מגע ליצור חותם חזק כדי לייצב / לעגן את הריסים לפיפטה המצורפות למכשיר טיפול בהדרגה. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> איור 4. אפיון של השינויים התפתחותיים בתחום אב הכליות בעובר דג הזברה הסוג בר. א) החלק סכמטי המציין את האזור צילם לניתוח בעוברים (B, C). B) סוג פראי ב1, 3, ו -5 שלב somite הוכתמו על ידי מאחלי שני צבעים על מנת להעריך את הקומפוזיציה של שדה אב הכליות שנותן לעלות לכליות העוברית, או כליה ראשית. תמלילים (בעמודה שמאלית) קידוד pax2a שעתוק הגורם (מוכתם בסגול) לסמן מספר אוכלוסיות בעובר, כוללים p הכליותשדה rogenitor שעולה מן המזודרם ביניים. תמלילי קידוד dlc יגנד Notch לסמן somites היוצרים מהמזודרם הפרקסיאלית (המוכתם באדום). (עמודה ימנית) כאשר הביטוי של תעתיקי dlc (המוכתמים בסגול) והמוח האחורי rhombomere סמן krox20 (מוכתם באדום) נבחנים באותו עוברים, ביטוי dlc יכול להיות שנצפה בתחום משנה מקורי של אבות הכליות ממוקמים בסמוך לsomites 1-5, שהיה מוסתר בשיתוף ההכתמה של dlc עם עוברי סוג בר pax2a. C) בשלב 14 somite היו כפול או משולש מוכתמים עם שילוב של סמן כליות (סגול), smyhc1 הסמן somite (אדום) , והמוח האחורי rhombomere סמן krox20 (גם אדום). (פנל העליון) בשלב זה, תעתיקי pax2a ימשיכו לסמן את אבות הכליות. (התיכון, פנלים תחתון) בתוך שטח מוליד הכליות, משנה מקורי מסומןעל ידי slc4a4 ותמלילים המקודדים slc12a3 לסמן משנה הזנב. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> איור 5. השימוש בהכנות רכובים שטוחות לאפיין פנוטיפים נגרמים על ידי מוטציות גנטיות או הפרעות גנטיות כימיות לווסת יוסינתזה חומצה הרטינואית. הדפוס המאחל הביטוי בשלב 15 somite של wt1a (הסגול) וsmyhc1/krox20 (אדום) הושוו בין סוגי הבר ועוברים עם ליקויים בייצור חומצה רטינואית (RA) בשל פגמים בדהידרוגנז אלדהיד 1A2 (NLS ומוטציות lib) או עיכוב כימי של פעילות dehydrogenase retinaldehyde עם diethylaminobenzaldehyde (DEAB). ההפחתה של ייצור RA בlib היא מעט יותר חמורה מאשר NLS, כגוןשעוברי lib להביע מכתים מעט מופחת של תמלילי wt1a מאשר מבוים באופן דומה NLS עוברי מוטציה, ואילו טיפול DEAB של סוגים פרא קשור לביטול של ביטוי wt1a מלא.

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לשפר את הוויזואליזציה של עוברי דג זברה מקובעים וצבועים בנקודות זמן מוקדמות של ההתפתחות. הדבר מושג תחילה על ידי צביעת עובר דג הזברה באמצעות home mount ב-C two hybridization. לאחר מכן, נבחר עובר להרכבה שטוחה (flat mount) ובוצעו חתך מרכזי לתוך החלמון באמצעות פינצטה עדינה, ולאחר מכן נעשה שימוש בכלי גירוד כדי לגרד ולהסיר בעדינות את גרגירי החלמון שנותרו.לבסוף, העובר מורכב בגליצרול על עלית כדי לאפשר הדמיה מתאימה של הדגימה. באופן סופי, קיבוע שטוח (flat mounting) מאפשר ויזואליזציה טובה יותר של עוברים צבועים ממבט גביהי, על ידי הסרת החלמון ומיקום העובר בהכנה דו-ממדית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הדמיה של עוברים שלמים בשלבי התפתחות מוקדמים יותר, הוא שהקיבוע השטוח מסיר את שק החלמון ומאפשר לצפות בעובר כולו.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ההתפתחותי, כגון אפיון התחום של השדה הקדמי הכליתי (renal pre gender field) בעובר. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה מתקשים בהתחלה מכיוון שטכניקה זו דורשת טיפול עדין בעובר, וכן מכיוון שפיסע זמן עד ללמידה של מידת הלחץ המתאימה הנדרשת להסרת שקיק החלמון. את הפרוצדורה יעמידו אני, זואי ואמנדה, סטודנטיות לתואר שני במעבדת וונגר (winger laboratory).לאחר איסוף, קיבוע וצביעה של העובריים, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בחרו עוברי למסך שטוח (flat mounting) עם X-P-B-S-T אחד. העבירו את העובר לצלוחית פטרי מפלסטיק או מזכוכית. לאחר מכן, כאשר הצלוחית נמצאת תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמשו בפינצטה עדינה כדי לגלגל את העובר כך שיתקבל מבט צדי שבו קצות הראש והזנב גלויים.בשלב הבא, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להחזיק את העובר בצורה יציבה ובסט שני של פינצטות כדי לבצע חתך בחלמון במיקום מרכזי בין הראש לזנב של העובר. לאחר מכן, בעזרת פינצטה עדינה, גרדו את החלמון מחלל תא האלון. השתמשו ב-X-P-B-S-T כדי לשטוף שאריות חלמון מהעובר בעזרת טיפה אחת עד שתיים של XPBS.העבירו את העובר לעלה זכוכית שטוחה. גררו את העובר לקצה התמיכה (buffer) כך שיישאר במצב שטוח כנגד עלה הזכוכית. בעודכם מקבעים את העובר, השתמשו בכלי גרירה (lash tool) כדי לגרד בעדינות את הפני השטח הוונטרליים במטרה להסיר גרגירי חלמון.אם תמיסת ה-PBST הופכת עמוסה בחלמון עודף או מתחילה להתאדות, הוסיפו טיפה אחת עד שתיים של תמיסה רעננה וגררו את העובר אל תוך בופר זה. לאחר שהחלמון הוסר באופן משביע רצון, העבירו בעדינות את העובר בחזרה לפטרי dish עם PBST לשטיפה סופית. לאחר מכן, העבירו את העובר לפטרי dish המכיל 100% glycerol והדגירו למשך חמש דקות.כדי להרכיב את העובר על גבי זכוכית, העבירו אותו לזכוכית נקייה. טפטפו אחת עד שתיים טיפות של 100% glycerol ומקמו את העובר כך שצד חלמון העובר (ventral yolk side) יפנה כלפי הזכוכית. בעזרת כלי ריסים (lash tool), גררו את העובר לקצה טיפת ה-glycerol כך שיישאר במצב שטוח כנגד הזכוכית.אם הציר העוברי מעוקם, השתמשו בפינצטה עדינה כדי לבצע בעדינות חתכים קטנים בחלקי החלמון שנותרו כדי להפחית את המתח, כך שניתן יהיה להניח אותו בצורה שטוחה על הזריקה. הניחו גושי חימר קטנים בארבע הפינות של לוחית זכוכית בגודל 18 על 18.הנח לאט את לוחית הכיסוי על העובר, תוך הטיית לוחית הכיסוי כדי לצמצם את הופעת בועות אוויר בגליצרין. לבסוף, הוסף טיפה נוספת של 100% glycerol לצדו של לוחית הכיסוי כדי למלא את הרווח בין הזכוכית ולמנוע סחיפה; השתמש במיקרוסקופ סטריאוסקופי או מיקרוסקופ אור כך כפי שמוצג כאן. נעשה שימוש בשילוב של גשים (probes) יחד עם שני צבעים כדי לסמן תאי פרוגניטורים רנליים מתפתחים המולידים את הכליה, והעוברים הועמדו במישור (flat mounted) בשלב מוקדם.בשלב ה-14 של ה-somite, פרוגניטורים כלייתיים מסומנים בתבנית בצורת U על ידי ביטוי של תמלילי PAX2a המקיפים את המזודרמה הפריאלית, המבטאת בו-זמנית deltaC המוצג באדום. כאשר deltaC סומן יחד עם Ccrox20, נחשף תת-מישור רוסטרלי של הפרוגניטורים הכלייתיים המבטא deltaC. ניתוח של ביטוי PAX2a, SLC4A4, SLC12A3 ו-SMYHC1 בשלב ה-14 של ה-somite מאפשר מיפוי של כל תחום הפרוגניטורים הכלייתיים באמצעות PAX2a, וחשף כי תת-קבוצה של תאים בתת-המישור הרוסטרלי ביטאו SLC4A4.זה לא חפף עם תת-המישור של פרוגניטורים כלייתיים שהביעו SLC 12 A 3. באיור זה, עובריים עם מוטציות בגן Retinaldehyde dehydrogenase 2 הדרוש לביוסינתזה של רטינואיק אסיד, או עובריים שטופלו ב-DEAB, מעכב ALD H, פיתחו ביטוי מופחת או מבוטל בהתאמה של WT 1 A, מה שמראה כי צביעה דו-צבעית עם הכנה של פריסה שטוחה (flat mount) היא בעלת ערך למחקר של מישורים תאיים במהלך אורגנוגנזה. בדגי זהב עם מוטציות גנטיות או כאשר הם נחשפו כימית למולקולות קטנות. ברגע שהטכניקה נשלטת, היא עשויה להימשך 10 עד 15 דקות אם היא מבוצעת כראוי.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון דימות כדי לענות על שאלות נוספות, למשל היכן ממוקמים הגבולות של מקטעי הכליה. לאחר צפייה בסרטון, תרכיבו הבנה טובה של אופן ביצוע הרכבה שטוחה (flat mount) של עובר דג זברא צבוע, במטרה לוויזואליזציה טובה יותר של המבנים המבוקשים באמצעות הסרת החלון.

flat-mount-preparation-for-observation-analysis-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

מאמר זה מתאר שיטה להרכיב עוברים חיים של דגי זברה לצורך הדמיה ארוכת טווח. שיטה זו חסכונית וקלה לביצוע באמצעות צלחות רגילות של מיקרוסקופ תחתית זכוכית לצורך הדמיה במיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מתבצעת בשכבות אגרוז בריכוזים שונים.

הרכבה שכבתית של אגר: הכנת עוברים חיים של דגי זברה להדמיה ארוכת טווח במיקרוסקופ הפוך

סרטון זה מתאר הוראות שלב אחר שלב להרכבת עוברים חיים של דגי זברה על 6 פלטות באר באמצעות אגרוז נמס נמוך. הוא גם מספק את התהליך כדי לרכוש תמונות של עוברים חיים ולנתח אותו באמצעות תוכנה.

אגר הרכבה: שיטה בסיסית להרכבת עוברים חיים של דגי זברה להדמיה ארוכת טווח

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על...

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

תהליכים התפתחותיים כגון התפשטות, דפוסים, בידול, והדרכה האקסון יכולים להיות מודל בקלות בחוט השדרה דג הזברה. במאמר זה, אנו מתארים הליך הרכבה לעוברי דג הזברה, אשר מייעל את ההדמיה של אירועים אלה.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

ההתפתחות של דג הזברה יכולה להיות אחרי על פני ימים עם מיקרוסקופיה גיליון אור כאשר עוברים מוטבעות בצינורות פולימר ברורים אופטי עם agarose ריכוז נמוך.

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

כאן, אנו מציגים שיטת הרכבה רב-תכליתית המאפשרת הדמיה ארוכת טווח של התפתחות הגוף האחורי של עוברי דג זברה חיים מבלי להפריע להתפתחות תקינה.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

מאמר זה מתאר שיטה לטעינת עוברי שברירי הדגים עבור מיקרוסקופ הזמן המורחבת הקפיצה הדקה. שיטה בעלות נמוכה זו קלה לביצוע באמצעות מנות מיקרוסקופית תחתית רגילות של זכוכית להדמיה בכל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מבוצעת בשכבות של הצמח בריכוזים שונים.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

מתוארת אסטרטגיית הכנת דגימה להדמיית עוברים מוקדמים של דגי זברה בתוך כוריון שלם באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור. הוא מנתח את הכיוונים השונים שהעוברים רוכשים בתוך הכוריון בשלבי 70% אפיבולי וניצן ומפרט אסטרטגיות הדמיה להשגת רזולוציה בקנה מידה תאי בכל העובר באמצעות מערכת יריעות האור.

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

למד טכניקת הר הכנה שטוחה לעוברי דג זברה צבועים ב-WISH להסרת חלבון הביצה ושיפור הדמיית מבנים אמבריוניים. שיטה זו מאפשרת תצפית ממבט גבי וחקר אורגנוגנזה ב-Danio rerio.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם

גלה סרטונים נוספים