הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם באתרו הכלאה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין טוב יותר עוברי דגי זברה קבועים מוכתמים בנקודות זמן התפתחותיות מוקדמות. זה מושג על ידי צביעה ראשונה של עובר דג הזברה באמצעות תושבת בית בהכלאה C שתיים. לאחר מכן, עובר נבחר להרכבה שטוחה ומבצעים חתך מרכזי בחלמון בעזרת זוג מלקחיים עדינים, ואז משתמשים בכלי הריסים כדי לגרד בעדינות ולהסיר את גרגירי החלמון הנותרים.

לבסוף, העובר מותקן בגליצרול על שקופית כדי לאפשר הדמיה מתאימה של הדגימה. בסופו של דבר, הרכבה שטוחה מאפשרת הדמיה טובה יותר של עוברים מוכתמים ממבט גבי על ידי הסרת החלמון ומיקום העובר בתכשיר דו מימדי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הדמיית עוברים שלמים בשלבי התפתחות צעירים יותר הוא שהרכבה שטוחה מסירה את שק החלמון ומאפשרת לראות את העובר כולו.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתפתחותי, כגון אפיון תחום השדה הקדם-מגדר הכלייתי בעובר. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו מתקשים מכיוון שטכניקה זו דורשת טיפול עדין בעובר, וגם מכיוון שלימוד כמות הלחץ המתאימה הדרושה להסרת שק החלמון יכול לקחת זמן. נדגים את ההליך הזה אני, זואי ואמנדה, שהן סטודנטיות לתארים מתקדמים במעבדת הכנף.

לאחר איסוף, קיבוע וצביעה של עוברים, על פי פרוטוקול הטקסט, בחר עובר להרכבה שטוחה עם X-P-B-S-T אחד. העבירו את העובר לצלחת פטרי מפלסטיק או זכוכית. לאחר מכן, עם המנה מתחת למיקרוסקופ סטריאו, השתמש במלקחיים עדינים כדי לגלגל את העובר כך שתתקבל תצוגה רוחבית עם קצוות הראש והזנב גלויים.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים עדינים כדי להחזיק את העובר יציב ובסט שני כדי לבצע חתך בחלמון במיקום מרכזי בין הראש לזנב העובר. ואז בעזרת מלקחיים עדינים, הוציאו את החלמון מחלל תא האלון. השתמש ב-X-P-B-S-T אחד כדי לשטוף חלמון תועה מהעובר באמצעות טיפה אחת או שתיים של XPBS אחד.

העבירו את העובר למגלשת זכוכית שטוחה. גרור את העובר לקצה המאגר כך שיישאר במצב שטוח כנגד מגלשת הזכוכית. בזמן עיגון העובר, השתמש בכלי ריסים כדי לגרד בעדינות את פני הגחון כדי להסיר גרגירי חלמון.

אם תמיסת ה-PBST נעשית עמוסה בעודפי חלמון או מתחילה להתאדות, הוסיפו טיפה אחת עד שתיים טריות וגררו את העובר למאגר הטרי הזה. לאחר הסרת החלמון בצורה משביעת רצון, העבירו בעדינות את העובר בחזרה לצלחת פטרי של PBST לשטיפה אחרונה. לאחר מכן העבירו את העובר לצלחת פטרי המכילה 100% גליצרול ודגרו למשך חמש דקות.

כדי להרכיב את העובר על מגלשת זכוכית, העבירו אותו לכוס נקייה. החלק פנימה טיפה אחת עד שתיים של 100% גליצרול ומקם אותה כשצד החלמון הגחוני פונה לשקופית הזכוכית. בעזרת כלי ריסים, גרור את העובר לקצה טיפת הגליצרול כך שיישאר במצב שטוח כנגד המגלשה.

אם הציר העוברי מעוקל, השתמש במלקחיים העדינים כדי לבצע בעדינות חתכים קטנים בחלמון הנותר כדי להקל על המתח כך שניתן יהיה למקם אותו שטוח. בשקופית. הניחו שקעים קטנים של חימר דוגמנות על ארבע הפינות של תלוש כיסוי זכוכית בגודל 18 על 18.

הנח לאט את החלקת הכיסוי על העובר, בזווית של החלקת הכיסוי על מנת למזער בועות אוויר בגליצרול. לבסוף, הוסף טיפה נוספת של 100% גליצרול לצד החלקת הכיסוי כדי למלא את החלל בין הזכוכית וכדי למנוע סחיפה, השתמש במיקרוסקופ סטריאו או מורכב לתמונה המוצגת כאן. נעשה שימוש בשילוב של בדיקות יחד עם שני צבעים שרוצים לסמן אבות כליה מתפתחים המולידים את הכליה והעוברים הורכבו שטוחים בתחילת הדרך.

אז שלבי קרדית, אבות הכליה מסומנים בתבנית בצורת U על ידי ביטוים של תעתיקי PAX שני A המקיפים את המזודרם הפריאלי המבטא במקביל את דלתא C המוצגת באדום. כאשר דלתא C סומנה במשותף עם C crox 20, התגלה תת-תחום רוסטרלי של אבות הכליה המבטא את דלתא C בניתוח ביטוי של PAX 2 a, SLC 4 A 4, SLC 12 A 3 ו-S-M-Y-H-C אחד ב-14. אז שלב הקרדית מאפשר מיפוי של כל תחום האב הכלייתי עם PAX שני A, וגילה כי תת-קבוצה של תאים בתת-התחום הרוסטרלי מבטאת SLC ארבע A ארבע.

זה לא חפף לתת-תחום ה-coddle של אבות הכליה שביטא SLC 12 A שלוש. באיור זה עוברים עם מוטציות ברטין רטינלדהיד דהידרוגנאז שני גנים הנדרשים לביוסינתזה של חומצה רטינואית או עוברים שטופלו במעכב DEAB ו-ALD H שפותחו עם ביטוי מופחת או מבוטל בהתאמה של WT אחד A, מה שמדגים כי שני צבעים עם תכשיר ההרכבה השטוחה הוא בעל ערך לחקר תחומים תאיים במהלך אורגנוגנזה. בדגי זברה עם מוטציות גנטיות או כאשר נחשפים כימית למולקולות קטנות לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להימשך 10 עד 15 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיה כדי לענות על שאלות נוספות כמו היכן נמצאים גבולות מקטעי הכליה. לאחר צפייה בסרטון, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב עובר דג זברה מוכתם על מנת לדמיין טוב יותר את המבנים הרצויים על ידי הסרת החלמון.