הקלטת פעילות עצבית הנגרמת טמפרטורה באמצעות ניטור שינויי סידן נורה חוש הריח של Laevis Xenopus

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתעד שינויים בסידן בנוירונים של נורת הריח בתגובה לירידות טמפרטורה הנגרמות באפיתל האף. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרגשות, כגון כיצד פקעת הריח משתלבת ומעבדת מידע טמפרטורה הנרכש באף. הנוירונים מסדר ראשון ושני של נורת הריח מוכתמים באופן דיפרנציאלי והשפעות תנודות הטמפרטורה באפיתל האף נמדדות על ידי הדמיית סידן.

ההדגמה החזותית של אלקטרופורציה של תאים, העמסת בולוס והדמיית מתאם פעילות תקל על יישום טכניקות אלה ברשתות מוח אחרות מלבד פקעת הריח. כדי להתחיל בהליך זה, הניחו ראשן על כרית ג'ל. תקן אותו על ידי הנחת מחטים מסביב והיזהר לא לתקוע את המחטים דרך עורו.

לאחר מכן, הניחו את החיה מתחת למיקרוסקופ הסטריאו והתמקדו בנחיריים. לאחר מכן, הניחו גביש צבע באחד מחללי האף והמתינו עד שהוא יתמוסס לחלוטין, מה שאמור לקחת פחות מדקה. אם הגבישים קטנים יותר, הוסיפו שניים או שלושה לכל חלל עד שהם מייצרים תמיסה לא שקופה ומרוכזת גבוהה.

לאחר מכן, הניחו את הקתודה על עור הראשן והאנודה לתוך אחד הנחיריים. הפעל שישה פולסים של 20 וולט ו-20 אלפיות השנייה עם כ-0.5 שניות של מרווח גירוי. עבור צבעים בעלי קוטביות שונה, ניתן לשפר את תוצאות הצביעה על ידי הכנסת הקתודה לנחיריים.

אם אינך בטוח לגבי הקוטביות של הצבע, ניתן למקם את שתי האלקטרודות בו זמנית בנחיריים ולהחליף את הקוטביות בין פולסי מתח בודדים. לאחר הקרבת החיה, השתמש באזמל כדי לנתח גוש רקמה המכיל את חללי האף, עצבי הריח ופקעות הריח. בצע את החתך הראשון קרוב לנחיר השמאלי והזיז את הלהב קדימה, חותך לצד עצב הריח השמאלי והנורה עד לגבול הטלנצפאלי-דו-מוחי

חזור על כך גם בצד ימין. לאחר מכן, בודד את התכשיר משאר מערכת העצבים על ידי ביצוע חתך סופי אחורי לטלנצפלון. הצמד שוב את גוש הרקמה על ידי החדרת שתי מחטים בין עצבי הריח.

לאחר מכן, הניחו טיפה של תמיסת Frog Ringer על הטישו. רחיצת התכשיר בתמיסת רינגר תמנע מרקמות המוח לקרוס בעת הדיסקציה. לאחר מכן, הסר את קרומי המוח המכסים את אזור מיון האקסון ואת נורות הריח על ידי ביצוע שלושה חתכים.

החל מהקצה האחורי של גוש הרקמות, חתוך בזנב מקרוב לאורך נורת הריח השמאלית עד לנקודת הכניסה של עצבי הריח לנורות. חזור על הליך זה עבור ההמיספרה הימנית. לאחר מכן, הרם את קרומי המוח בעזרת מלקחיים ובצע את החיתוך השלישי בניצב לקודמים באזור מיון האקסונים.

לאחר מכן, העבירו את הדגימה לתא הקלטה מלא בצלצול צפרדע להמשך עיבוד והדמיה. ודא שהצד הגחוני פונה כלפי מעלה ואבטח את הדגימה עם רשת של סיבי ניילון המשתרעת על מסגרת פלטינה קטנה. למריחה קלה יותר של גירויים, הניחו את חללי האף על גבי אחד מסיבי הניילון.

בהליך זה, מלאו את המיקרופיפטה ב -10 מיקרוליטר מהתמיסה והסירו את בועות האוויר על ידי הקשה על המיקרופיפטה. לאחר מכן, הרכיב את המיקרופיפטה במחזיק פיפטה. ודא שניתן להפעיל לחץ באופן ידני באמצעות מזרק או מכשיר פליטת תרופות פנאומטי ופקח על הלחץ המופעל באמצעות מד.

לאחר מכן, הורד את הפיפטה על פני נורת הריח כשהקצה מצביע לכיוון הרוסטרלי של התכשיר. הפעל לחץ חיובי קטן וקבוע על המיקרופיפטה כדי למנוע סתימת הפיפטה. הכנס בעדינות את המיקרופיפטה לרקמה והפעל לחץ חיובי.

אשר את הזרימה מהפיפטה על ידי צפייה בתנועות רקמה קלות הנראות תחת אור בהיר בעת הפעלת הלחץ. לאחר 10 דקות של טעינה, הפחיתו את הלחץ המופעל לאפס ובדקו את הכתמים. גודל האזור המוכתם משתנה באופן משמעותי ותלוי במספר פרמטרים, כמו כמות הצבע המוזרק ומיקום אתר הפליטה.

צביעה טובה מכסה שטח של כ -100 מיקרומטר על 100 מיקרומטר. עקוב אחר העמסת הצבע המתקדמת של סומטה של תאים מיטרליים לאורך זמן במהלך העמסת הבולוס. אם עוצמת הצביעה או מספר התאים המיטרליים המוכתמים אינם גדלים, בדוק אם יש סתימה של הפיפטה והחלף אותה במידת הצורך.

בשלב זה, עקוב אחר הטמפרטורה של הרינגר המקורר על ידי הכנסת בדיקת המדחום הנקייה לתוך הצינור. המתן עד שהטמפרטורה תרד מתחת למעלה אחת צלזיוס לפני שתתחיל בניסוי. לאחר מכן, השתמש במוליך משפך המאפשר העברת גירוי במקביל לרינגר המפריע, כך שזרימת המים בתא תישאר קבועה וללא הפרעה במהלך שחרור תמיסת הגירוי.

לאחר מכן, מקם את המשפך בצורה כזו שהיציאה הדיסטלית תהיה במרחק של פחות ממילימטר אחד מאפיתל הריח. לאחר מכן, הנח חיישן טמפרטורת ניכרום המחובר למדחום דיגיטלי קרוב לאפיתל ולשקע מוליך המשפך. חוט את יציאת הפלט של המדחום למחשב כדי להקליט ולהציג חזותית כרךtagשינויי מתח המשקפים תנודות טמפרטורה קטנות.

לאחר מכן, התחל את רכישת התמונה והחל ברצף 200 עד 400 מיקרוליטר של רינגר קר, L-היסטידין וצלצול בטמפרטורת החדר באמצעות פיפטה אלקטרונית עם מרווח אינטרגירוי של 20 עד 30 שניות. לשליטה טובה יותר ביישום הגירוי, שחרר את הגירוי עם אות טריגר שנשלח על ידי מערך ההדמיה שנבחר לפיפטה במידת האפשר. בהליך זה, טען את הנתונים הגולמיים שנרכשו כמשתנה לסביבת העבודה של משתמש MATLAB, המאורגנים כמטריצת x, y, z, t, כאשר x ו-y מתייחסים לממדים הרוחביים, z, הכיוון הצירי ו-t, מהלך הזמן.

לאחר מכן, התקשר ל-ACI משורת הפקודה MATLAB. בממשק המשתמש, בחר הכן נתונים ולאחר מכן בחר את המשתנה המכיל את הנתונים וספריה שבה יישמרו התוצאות. גלול בין שכבות ה-z הנמדדות על ידי הזזת המחוון המתאים בממשק המשתמש כדי לקבל סקירה כללית של מפת השונות המוצגת.

לאחר מכן, הזן את גודל ההחזר על ההשקעה בממשק המשתמש. עבור סומה של תאים מיטרליים, התאם את ההחזר על ההשקעה כך שיתפרש על פני כ-10 מיקרומטר לרוחב וחמישה מיקרומטר בכיוון הצירי. עבור גלומרולוס, הערכים המעט גבוהים יותר של 20 מיקרומטר לרוחב ו -10 מיקרומטר צירי מתאימים. לאחר מכן, בחר החזר ROI המכיל את הגמא גלומרולוס ואזורים נוספים עבור כל סומה גלויה של התאים המיטרליים שמסביב על ידי לחיצה עם כפתור העכבר האמצעי על מרכז התא או הגלומרולוס.

לאחר מכן, סגור את ממשק המשתמש הראשי, המפעיל את חישוב מפות המתאם עבור כל עקבות הייחוס. התוצאה נשמרת ומוצגת אוטומטית. תמונה זו מראה כי האקסונים של ORNs המסתיימים בצביר הקטן נצבעו על ידי אלקטרופורציה בצבע שאינו רגיש לסידן, Alexa 647 Dextran.

הקו המקווקו מתאר את הגמא גלומרולוס. מוצגת כאן תמונה של אותו אזור בערוץ המדידה השני לאחר העמסת בולוס בצבע רגיש לסידן, Fluo-8 AM. כמה סומטה של תאים מיטרליים נראו אך הניגודיות הייתה מוגבלת. שני עקבות תגובה תווו להדמיית מתאם פעילות, פסים כחולים, אדומים ושחורים מתחת לעקבות מתארים את תחילת היישום של רינגר קר, היסטידין ב-10 מיקרומולר ורינגר בטמפרטורת החדר כבקרה שלילית, בהתאמה.

תוצאת ה-ACI של העקבות באזורים המודגשים המגיבים בעיקר לרינגר קר מוצגת כאן. והנה תוצאת ה-ACI של העקבות באזורים המודגשים המגיבים בעיקר להיסטידין. תמונה זו מציגה את שכבת-העל של שתי מפות ה-ACI.

תאים מיטרליים המגיבים להיסטידין ולגלומרולוס העצבני היו ניתנים להבחנה בקלות באמצעות תאים מיטרליים רגישים לחום בגמא גלומרולוס. ניתן לבצע הליך זה כדי לחקור אם רגישות לחום ורגישות לכימותרפיה נמצאות ברשתות עצביות סמויות וחופפות של נורת הריח. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להקליט עיבוד טמפרטורה בנורת הריח באמצעות אלקטרופורציה של תאים בבעלי חיים חיים, העמסת בולוס והדמיית מתאם פעילות, הנקראת גם ACI.

העמסת בולוס ו-ACI הם כלים רבי עוצמה להתבוננות והשוואה של הפעילות והקישוריות של עשרות נוירונים בתלת-ממד, מה שהופך אותם לישימים בקלות לאזורי מוח שונים ולרשתות עצביות.