תצפית כימות הטלומרים ו רצפים חוזרים קרינה באמצעות באתרו הכלאה (דגים) עם PNA בדיקות ב Elegans Caenorhabditis

המטרה הכוללת של טכניקת הכלאה פלואורסצנטית זו באתרה היא לנתח בתמציתיות את מספר ואורך הטלומרים ב-C.Elegans. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי התחדשות הגידול, הארכה חלופית של טלומרים והזדקנות תאית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שההליכים תמציתיים וניתן לדמיין ולכמת את הטלומרים תוך פחות מ-24 שעות.

אוספים את התולעים הבוגרות עם מעט מדיה נוזלית ללא פסולת בצינור של 15 מיליליטר. כעת שטפו את התולעים שלוש פעמים כדלקמן. הוסף מאגר M9 לנפח כולל של 15 מיליליטר.

לאחר מכן סובב את הצינור ב -300 גרם למשך שלוש דקות, והשליך את התמיסה מעל גלולת התולעים. ואז חזור על התהליך. אם לאחר הצנטריפוגה התולעים צפות, אז הקל את הבלם על הצנטריפוגה.

לאחר הכביסה השלישית, השאירו את התולעים עם 5 מיליליטר M9. לאחר מכן מוסיפים 6.5 מיליליטר מים מזוקקים, שני מיליליטר היפרכלוריט ומיליליטר אחד של חמש אשלגן-הידרוקסיד מולארי. תנו לתולעים לדגור בתמיסת ההלבנה הזו במשך שלוש דקות עם תסיסה של 50 סל"ד. לאחר מכן מערבל את התולעים כדי לגזור אותן ולשחרר את הביצים שלהן.

תחת מיקרוסקופ דיסקציה, חפש את הביצים המשוחררות. אם הם עדיין לא משתחררים, המשיכו בדגירה או עד שמונה דקות. אם התולעים מומסות ברובן והביצים חופשיות, מלאו את הצינור עד 15 מיליליטר ב-M9 ושטפו את הביצים שלוש פעמים בדיוק כפי שהתולעים נשטפו בעבר.

לביצים השטופות, כשרוב ה- M9 הוסר, מלאו את הנפח ל -500 מיקרוליטר ב- PBST, ולאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של 4% PFA. כעת טען 40 מיקרוליטר של ביצים ב-2% PFA לבארות של מגלשות מצופות פוליליזין. לאחר מכן העבירו את השקופיות לתא לח ותנו להן לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

עבור פרוטוקול זה, יש לאחסן גוש אלומיניום על קרח יבש בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. כמו כן, יש לאחסן מתנול ואצטון בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר השלמת שלב הקיבוע, הסר את רוב תמיסת ה- PFA מהשקופיות, והשאיר כחמישה מיקרוליטר.

לאחר מכן הניחו שקופיות מצופות פוליליזין שניות מעל כל שקופית דגימה כך ששני המשטחים המצופים יידבקו זה לזה, ולוכדים את הרקמות בבאר. אם יש קיבוע מוגזם, נגב אותו עם טישו. כעת הקפיאו את השקופיות על ידי הנחתן על גוש האלומיניום הקר למשך 15 דקות לפחות.

בינתיים, הכינו אמבטיות מתנול ואצטון על קרח למגלשות. לאחר שהשקופיות קפואות, סובב אחת כדי להקפיא את הדגימה. השליכו את השקופית העליונה והשרו את השקף התחתון במתנול קר כקרח למשך חמש דקות.

עשה זאת עבור כל הדגימות. פיצוח הקפאה מאפשר חדירת בדיקות ונוגדנים דרך קליפת הביצה הקשה. אם הביצים נסדקות בהקפאה בהצלחה, אתה יכול לראות את הביצים בשתי המגלשות.

לאחר לפחות חמש דקות במתנול, העבירו את השקופיות לאצטון קר למשך חמש דקות. תוך חמש דקות נוספות, יש להשרות את הדגימות ב-PBST שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל אמבטיה. לאחר שטיפת ה-PBST, ניתן לאחסן את השקופיות ב-100% אתנול בארבע מעלות צלזיוס למשך מספר ימים.

כדי להמשיך, הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת RNase לבארות הדגימה ודגר אותם בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן שטפו את השקופיות ב-2x SSCT פעמיים למשך 15 דקות לכל כביסה. לאחר שתי השטיפות, הוסיפו 20 מיקרוליטר של תמיסת הכלאה לדגימות ודגרו אותן בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה בתא לח.

בינתיים, הכינו את הגשושית לבדיקת DNA דו-גדילית. יש למזג אותו בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ולאחר מכן לצנן אותו על קרח לזמן קצר. לאחר שעה, שאפו את תמיסת ההכלאה והוסיפו את תמיסת הבדיקה.

משלב זה ואילך, הגן על הדגימה מפני האור. לאחר הוספת הבדיקה, מכסים את הדגימות בהחלקות כיסוי זכוכית. לאחר מכן הכינו תא לח על גוש חום של 80 מעלות צלזיוס.

כאשר גוש החום התייצב בחזרה ל-80 מעלות צלזיוס, הנח את שקופיות הדגימה בתא המחומם ותן להן להתפרק למשך שלוש דקות. לאחר מכן דגרו את כל המגלשות המעובדות בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הדגירה של הלילה יש לשטוף את הדגימות ב- PBST בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

בהכנה יש לחמם את תמיסת ההכלאה ל -37 מעלות צלזיוס שעה לפני הכביסה. לאחר מכן טען את השקופיות לצנצנת של תמיסת שטיפת הכלאה ודגר אותן בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כדי להסיר את תמיסת ההכלאה, יש לשטוף את הדגימות עם PBST בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

עשה זאת שלוש פעמים. לאחר שאיבת שטיפת ה-PBST האחרונה, הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לכל דגימה ודגר אותם בתאים לחים בטמפרטורת החדר למשך שעה בחושך. לאחר מכן שאפו את תמיסת החסימה והחליפו אותה בתמיסת נוגדנים מצומדים נגד דיגוקסיגנין FITC באחד עד 200.

מכסים את השקופיות ומדגרים אותן בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות בחושך. לאחר כתם הנוגדנים, שטפו את הדגימות פעמיים עם PBST למשך 15 דקות לכל שטיפה בחושך. לאחר מכן, שאפו את ה-PBST והחליפו אותו ב-10 מיקרוליטר של תמיסת הרכבה המכילה DAPI.

מרחו כיסוי וספגו כל תמיסה עודפת. לבסוף, אטמו את שולי זכוכית הכיסוי עם לק והמשיכו בהתבוננות בדגימות תחת מיקרוסקופ פלורסנט. באמצעות בדיקת ה-PNA, נצפו הטלומרים של בעלי חיים ששרדו מוטציה מספקת בטלומר.

בבלוטות המין, מספר הטלומרים לגרעין ניתן לכימות. אות הטלומרים התמקם יחד עם אות TALT1, ותומך ברעיון ש-TALT1 אחראי להישרדות ללא טלומרים. עוצמת אות הטלומרים הושוותה באמצעות תוכנה.

האות היה חזק יותר בשורדי ALT מאשר בזני ההורים ששימשו ליצירת מוטציות חסרות טלומרים. אל תשכח שעבודה עם פרפורמלדהיד ופורממיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות, בעת ביצוע הליך זה.