הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

מטרת הליך זה היא להנדס העלאה של רקמות תלת מימדיות זהות המשובצות בג'ל קולגן לשימוש בהקשרים ניסיוניים רבים, כגון קביעת השפעת הלחץ המכני על מורפוגנזה מסועפת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במורפוגנזה של רקמות, כגון קביעת המנגנונים הבסיסיים של התנהגות תאים קולקטיבית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהגיאומטריה של הרקמות המהונדסות מבוקרת וניתנת לשחזור, ומאפשרת מניפולציה ומדידה מדויקת של גורמים פיזיקליים וביוכימיים.

לפיכך, גודל המדגם גדול מספיק כדי שניתן יהיה להסיק מסקנות בביטחון סטטיסטי גבוה. התחל בהכנת מאסטר סיליקון בדוגמת פוטו עם המערך הרצוי באמצעות טכניקות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות. התבנית המשמשת בסרטון זה מורכבת ממבנים מלבניים המרוחקים 200 מיקרון זה מזה.

לאחר מכן, מערבבים 50 גרם PDMS על ידי שילוב הפרה-פולימר וחומר ריפוי בכלי חד פעמי ביחס של 10:1. לאחר מכן, הניחו את התערובת בוואקום למשך 15 עד 30 דקות כדי להסיר בועות אוויר שהוכנסו במהלך תהליך הערבוב. הנח את הצד בעל מרקם מאסטר הסיליקון כלפי מעלה לתוך סירת שקילה מפלסטיק, ושפך את תמיסת ה-PDMS נטולת הגז על גבי התבנית.

לאחר מכן, הכניסו את התבשיל לתנור ורפאו את ה-PDMS בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. לאחר הריפוי, הסר את ה-PDMS והמאסטר ממיכל הפלסטיק. הפרד בזהירות את ה-PDMS מפרוסת הסיליקון.

לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח נקי כדי להסיר את כל ה-PDMS העודף סביב התכונות המוטבעות. כעת, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את ה-PDMS המעוצבים לחותמות מלבניות בודדות. אחסן את החותמות הללו עם הצד כלפי מעלה בצלחת פטרי נקייה בקוטר 100 מילימטר.

לאחר מכן, הכינו אצווה טרייה של תמיסת PDMS נטולת גז תוך שימוש באותו יחס של 10:1 בין פרה-פולימר לחומר ריפוי. יש לצפות שניים עד שלושה גרם של תמיסה זו על צלחת פטרי בקוטר 100 מילימטר, ולאחר מכן לרפא את ה-PDMS למשך 12 שעות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את השכבה הדקה של PDMS למלבנים שישמשו כתומכים לחותמות.

יש צורך בשני תומכים לכל חותמת. לאחר חיתוך כל התומכים, עקר את חותמות ה-PDMS והתומכים על ידי טבילתם באתנול 70% וייבושם באמצעות שואב בארון בטיחות ביולוגית. בארון בטיחות ביולוגית, הוסף 50 מיקרוליטר של 1% BSA ב-PBS לחלק העליון של כל בול.

הנח את החותמות המכוסות טיפות בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות כדי להבטיח שה-BSA נספג לפני השטח של החותמת. לאחר מכן, החזירו את החותמות לארון הבטיחות הביולוגית ושאבו את תמיסת ה-BSA מחותמות ה-PDMS. לאחר מכן, שטפו את משטחי החותמות פעמיים עם 50 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים.

שאפו את המדיום לאחר כל שטיפה. הניחו צלחת תרבית רקמה אחת בקוטר 35 מילימטר לכל חותמת PDMS. בכל צלחת, הניחו שני תומכי PDMS המופרדים במרחק מעט קטן מאורך חותמות ה-PDMS.

לאחר מכן, השתמש בזוג פינצטה כדי לאסוף פתקי כיסוי זכוכית בקוטר 15 מילימטר ולעקר אותם באמצעות 70% אתנול. שאפו את עודפי הנוזלים מהחלקות הכיסוי תוך כדי החזקתם בפינצטה ולאחר מכן אחסנו אותם בצלחת פטרי נפרדת. לאחר מכן, חלקו 50 מיקרוליטר של תערובת קולגן של ארבעה מיליגרם למיליליטר ישירות על כל חותמת כדי לצפות באופן שווה את פני השטח של חותמות ה-PDMS.

בעזרת הפינצטה, הרימו כל אחת מחותמות ה-PDMS המצופות בקולגן והפכו אותן בעדינות. הורד את חותמות הקולגן ההפוכות כלפי מטה על גבי תומכי ה-PDMS בכלי תרבית הרקמות. לאחר מכן, דגרו את הכלים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר מכן, הוציאו 50 מיקרוליטר מתערובת הקולגן הנותרת על כל אחת מהחלקות העגולות של הכיסוי ודגרו עליהן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בשלב זה, קצור את סוג העניין של התא שלך. כאן, יש לנו תאי אפיתל של עכברים EpH4 שהשעינו בריכוז של בין 1 ל-10 מיליון תאים למיליליטר.

כעת, הסר את דגימות הקולגן הג'ל מהחממה. בעזרת הפינצטה, הרם בעדינות את חותמות ה-PDMS ישר כלפי מעלה כדי לנתק אותן מהקולגן המעוצב ולהשליך אותן. חשוב להרים את החותמת ישר כלפי מעלה כדי לא לעוות את התכונות בג'ל הקולגן.

יש להוציא 30 מיקרוליטר מתרחיף התאים המרוכז על פני כל ג'ל קולגן המכיל חללים יצוקים בגיאומטריה הרצויה. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר תוך ניעור עדין של הכלים מצד לצד כדי לקדם את שקיעת התאים בתוך החללים. יש למלא את החללים תוך חמש דקות.

כדי להסיר תאים עודפים מסביב לחללים, הטה כל צלחת תרבית רקמה על צדה והוציא בעדינות 400 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים על פני ג'ל הקולגן. חשוב לשטוף בעדינות על ידי הוצאה איטית של מדיום תרבית על הג'ל תוך הטיית הכלי כך שכל התאים העודפים על פני הג'ל יוסרו והתאים בחללי הג'ל לא ייעקרו. שואבים את הנוזל וחוזרים על הכביסה פעמיים נוספות.

בדוק את ג'ל הקולגן מתחת למיקרוסקופ בין כל שטיפה על מנת לראות מתי התאים העודפים נשטפו. לאחר פינוי התאים העודפים סביב החללים המלאים בתאים, הכניסו את צלחות תרבית הרקמה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, הפוך בעדינות את החלקות הזכוכית המצופות בקולגן והניח אותן על גבי תבניות הקולגן המלאות בתאים, כך שהקולגן מהחלקה תיצור מכסה על החללים המלאים בתאים.

דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר שמכסי הקולגן נדבקו לתבניות הקולגן המלאות בתאים, הוציאו לאט לאט 2 1/2 מיליליטר של תרבית תאים על גבי מכסה הזכוכית ותרבו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום עד שלושה ימים. תמונות אלה הן מתצוגות הגדלה נמוכות וגבוהות של המערכים שעוצבו לג'ל קולגן מסוג I לפני זריעת התאים.

צורת הבארות נקבעת על פי צורת התכונות במאסטר הסיליקון. כאן, הבארות המלבניות התמלאו בתאי אפיתל של חלב. בדוגמה זו, כל באר מלבנית בגודל 200 על 50 מיקרון מכילה כ-80 עד 100 תאים.

24 שעות לאחר זריעת התאים, נצפו תאים נצמדים זה לזה בתוך הבארות ליצירת רקמה. 24 שעות לאחר הוספת גורם גדילה HGF למדיום התרבית, הרקמות נראות עוברות מורפוגנזה מסועפת. אחד החלבונים המעורבים בנדידת תאים הוא קינאז הידבקות מוקדית, שכפי שניתן לראות מהתמונה המורכבת הזו, גדל בקצות הבארות שבהן מתרחשת הסתעפות בדרך כלל.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופ כוח מתיחה, RT-PCR בזמן אמת ו-Western Blotting, על מנת לקבוע את הכוחות המופעלים על ידי תאים בזמן נדידתם ושינויים ברמות התעתיק והחלבון של גנים מעניינים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר את מודל תרבית התאים התלת מימדי הזה שבו רקמות בעלות גיאומטריה ראשונית מוגדרת מוטמעות בתוך ג'ל קולגן.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.