Name: הפקה, התגבשות וקביעת מבנה C. difficile PPEP-1 באמצעות Microseeding ואבץ-SAD (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: למד כיצד לגדל גבישים איכותיים של rPPEP-1 מ-Clostridium difficile באמצעות שיטת microseeding. טכניקה זו מאפשרת קביעת מבנה חלבון ברזולוציה גבוהה לצורך גילוי תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לצוות בקו האלומה X06DA במקור האור השוויצרי, מכון פול-שרר, ויליג'ן, שווייץ על התמיכה במהלך איסוף נתוני הסינכרוטרון. אנו אסירי תודה למוניקה גומפרט על התמיכה הטכנית המצוינת. הפרויקט נתמך על ידי אוניברסיטת קלן ומענק INST 216/682-1 FUGG ממועצת המחקר הגרמנית. מלגת דוקטורט מבית הספר הבינלאומי לתארים מתקדמים בהתפתחות, בריאות ומחלות ל-C.P. מוכרת. המחקר שהוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מתוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7/2007-2013) במסגרת הסכם מענק מס' 283570 (BioStruct-X).

<ol><li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+Clostridium+difficile+infection%3A+understanding+the+healthcare+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).</li>
<li>O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection+caused+by+the+epidemic+BI%2FNAP1%2F027+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).</li>
<li>Mitchell, B. G., Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+Clostridium+difficile+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Resist+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Mortality and Clostridium difficile infection: a review.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+agent-induced+diarrhea--a+bacterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease.</a> J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).</li>
<li>George, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Clostridium+difficile+as+a+cause+of+pseudomembranous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis.</a> Br Med J. 1 (6114), 695(1978).</li>
<li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrative+review%3A+the+new+epidemic+of+Clostridium+difficile-associated+enteric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease.</a> Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).</li>
<li>Kelly, C. P., LaMont, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile--more+difficult+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile--more difficult than ever.</a> N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).</li>
<li>Ünal, C. M., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+Clostridium+difficile+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).</li>
<li>Kelly, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Monoclonal+Antibody%2C+Bezlotoxumab+Targeting+C.+difficile+Toxin+B+Shows+Efficacy+in+Preventing+Recurrent+C.+difficile+Infection+%28CDI%29+in+Patients+at+High+Risk+of+Recurrence+or+of+CDI-Related+Adverse+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes.</a> Gastroenterology. 150 (4), S122(2016).</li>
<li>Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+discovery+of+treatments+for+C.+difficile+infection%3A+A+clinical+and+medicinal+chemistry+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review.</a> Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+secreted+Pro-Pro+endopeptidase+PPEP-1+%28ZMP1%2FCD2830%29+modulates+adhesion+through+cleavage+of+the+collagen+binding+protein+CD2831%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831.</a> FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).</li>
<li>Cafardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+zinc+metalloprotease+through+a+global+analysis+of+Clostridium+difficile+extracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins.</a> PLoS One. 8 (11), e81306(2013).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+secreted+metalloprotease+%28CD2830%29+from+Clostridium+difficile+cleaves+specific+proline+sequences+in+LPXTG+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).</li>
<li>Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+Proline-Proline+Peptide+Bond+Specificity+of+the+Metalloprotease+Zmp1+Implicated+in+Motility+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile.</a> Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).</li>
<li>Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEROPS%3A+the+database+of+proteolytic+enzymes%2C+their+substrates+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeds+to+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeds to crystals.</a> J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li>
<li>Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jolly+SAD%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Jolly SAD.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+Molecular+Graphics+System%22">The PyMOL Molecular Graphics System</a>. , Schrödinger, LLC. (2002).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+phase+ambiguity+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography.</a> Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).</li>
<li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Zwart, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+structure+solution+with+the+PHENIX+suite%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated structure solution with the PHENIX suite.</a> Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).</li>
<li>Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).</li>
<li>Rubino, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+zinc-bound+Zmp1%2C+a+zinc-dependent+metalloprotease+secreted+by+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile.</a> J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).</li>
<li>Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((His-tag+impact+on+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">His-tag impact on structure.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+the+detection+of+soluble+fusion+constructs+expressed+in+E.+coli+using+a+modular+set+of+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors.</a> Microb Cell Fact. 4, 34(2005).</li>
<li>Stura, E. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+the+streak+seeding+technique+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crys+Growth%22%5BJournal%5D)">Applications of the streak seeding technique in protein crystallization.</a> J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

קריסטלוגרפיית קרני X היא עדיין השיטה המהירה והמדויקת ביותר לקביעת מבנים תלת-ממדיים ברזולוציה קרובה לרמה האטומית של חלבונים28. עם זאת, היא דורשת גידול של גבישים בודדים בעלי סדר מבני גבוה. לעיתים קרובות קשה להשיג גבישים אלו, והמצב הגבישי הוא מלאכותי. למרות זאת, השוואה בין מבני חלבונים שנקבעו באמצעות קריסטלוגרפיית קרני X לאלו שנקבעו בשיטות אחרות, ובמיוחד NMR, מראה בדרך כלל התאמה טובה מאוד. במקרה של PPEP-1, מבנה NMR שפורסם לאחרונה29 מראה התאמה מצוינת למבנה הגבישי שקבענו14, כולל הניידות של ה-S...

Difficile Clostridium הוא אחד הגורמים העיקריים של זיהומי שלשולים אנטיביוטיים הקשורים nosocomial 1. גראם חיובי זה חיידק אנאירובי מועבר באמצעות טופס הנבג שלה באמצעות מחזור הצואה-פה. בעשור האחרון, החדשה &#39;&#39; המגפה &#39;&#39; או &#39;&#39; hypervirulent &#39;&#39; זנים (למשל BI / NAP1 / 027) גרמו לעלייה דרסטית זיהומים חדשים ושיעורי תמותה בצפון אמריקה ובאירופה 2. C. difficile מחל -associated (CDAD) הנה דלקת מעי גסת סכנת חיים עם שיעורי תמותה גבוהים 3. הסימפטומים נעו בין שלשול 4 קוליטיס pseudomembranous 5 ואת megacolon הרעיל לעתים קרובות הקטלן 6. טיפול CDAD קשה כמו הזנים האלימים הם multidrug עמיד ושיעור ההישנות גבוה 7. באותו טיפול רגע כולל את metronidazole אנטיביוטיקה, fidaxomicin או ונקומיצין, או repetitiבמקרי vely חוזרים השתלת חיידקים בצואה. אסטרטגיות טיפוליות חדשות נדרשות 8 בדחיפות. התקדמות מסוימת זו נרשמת Bezlotoxumab נוגדנים חד שבטיים טיפולית, מיקוד הרעלן difficile ג B 9, עברה בהצלחה לאחרונה שלב III של הניסויים הקליניים ואת הוגש לאישורו עם ה- FDA ו- EMA. בנוסף, אנטיביוטיקות חדשות נבדקות כרגע בשלבים שונים של ניסויים קליניים 10. כדי לפתח טיפול יעיל מטרות טיפוליות חדשות חייבות להיות מזוהות. שהתגלו לאחרונה C. difficile פרוטאז פרולין-פרולין endopeptidase-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) הוא יעד כזה מבטיח, כמו חוסר PPEP-1 זן נוק-אאוט פוחתת ארסיות של C . difficile in vivo 11. PPEP-1 הוא metalloprotease מופרש 12,13 ביקוע השני adhesins C. difficile ב C- הסופית שלהם 13 ובכך משחרר את bacter החסידIA מן האפיתל במעי האדם. לכן, הוא עוסק בשמירה על האיזון בין פנוטיפ הנייח ו ניע של difficile ג. כדי לפתח מעכבי סלקטיבית נגד PPEP-1 ו להבין איך היא מכירה מצעים שלה ידע אינטימי של מבנה תלת-ממדי שלו היא הכרחית. פתרנו את המבנה הגבישי הראשון של PPEP-1 לבד בקומפלקס עם פפטיד מצע 14. PPEP-1 הוא פרוטאז הראשון הידוע כי אג&quot;ח המסלקת פפטיד סלקטיבי בין שתי שאריות פרולין 15. הוא נקשר המצע באופן פעמי מפותל ומייצב אותו דרך רשת אליפטיות-ארומטיים מורחבת של שאריות הממוקמות S-הלולאה המכסה את האתר הפעיל פרוטאז 14. מצב המצע מחייב זו הנו ייחודי PPEP-1 ולא נמצא פרוטאזות אדם עד כה. זה עושה את זה יעד תרופה הבטיח, ואת מחוץ יעד השפעות של מעכבים מאוד לא סבירים. כדי לפתח מסך סלקטיבית Inh PPEP-1ibitors בעתיד כמות גדולה של חלבון טהור monodisperse PPEP-1 הוא זקוק. יתר על כן, על מנת לקבוע את המצב של עקדת המעכבים הראשונים, מבני שיתוף קריסטל עם PPEP-1 יצטרך להיקבע. בידיים שלנו PPEP-1 מייצר גבישים intergrown כל הזמן. לכן פתחנו הליך אופטימיזציה לייצר גבישים עקיפים באיכות יחידה של PPEP-1. בפרוטוקול זה אנו מתארים בפרוטרוט את הייצור, טיהור, פתרון התגבשות ומבנה PPEP-1 14. אנו משתמשים בביטוי תאי coli Escherichia של גרסה PPEP-1 חסרת רצף אות הפרשה, כרומטוגרפיה זיקת כרומטוגרפיה הדרת גודל עם הסרת תג הטיהור, ואחריו microseeding 16 אל תוך מרקע אופטימיזציה קביעת מבנה באמצעות פיזור יחיד גל אבץ האנומלי (אבץ-SAD) 17. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לקביעת ייצור ומבנה של חלבונים אחרים (למשל &lt;/ Em&gt; metalloproteases) ובמיוחד עבור חלבונים לייצר גבישים intergrown. על פי בקשה, פלסמיד דנ&quot;א של המבנה (pET28a-Nhis-rPPEP-1) ונתונים עקיפים יכולים להינתן למטרות חינוכיות.

<table><tbody><tr><td><חזק>גנים / וקטורים / זני תאים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a וקטור</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>תרומבין ניתנת לניתוק N-terminal His-tag</td></tr><tr><td>E. coli זן BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td>RNase H</td></tr><tr><td>גן מותאם לקודון חסר (עבור E. coli) של PPEP-1 (CD630_28300)</td><td>חומצות</td> אמינו <td>מותאמות אישית</td> של Geneart (Thermo Fisher Scientific) <td>27-220</td></tr><tr><td>שם</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי קצף B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>תחליב סיליקון מימי</td></tr><tr><td>Agar</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>דרגת חיץ</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>כל</td><td></td><td>מאגר</td></tr><tr><td>דרגת DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>בדרגת חיץ</td></tr><tr><td>תרומבין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול 100%</td> <td>כל</td><td></td> סוכרוז סיגמא-אולדריץ' 84097 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוזל בדרגה הטהורה ביותר חנקן</td><td>כל</td><td></td><td>לאחסון וקירור בהקפאה של גבישים</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק</td><td>><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>ציוד (כללי)</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>רועד</td><td>כל</td><td></td><td>טמפרטורות מספקת של 20 &deg; C - 37 ו-deg; C</td></tr><tr><td>כלי זכוכית</td><td>כל</td><td></td><td>צלוחיות Erlenmeyer מבולבלות (50 מ"ל - 2.8 ליטר)</td></tr> <tr><td>צנטריפוגה לנפחי תרבית גדולים</td><td>כל</td><td></td><td>צנטריפוגה לנפחי עיבוד עד 12 ליטר</td></tr><tr><td>סוניקטור Vibra-Cell VCX500</td><td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>או כל סוניקטור / משבש תאים אחר</td></tr><tr><td>אולטרה צנטריפוגה</td><td>כל</td><td>צנטריפוגה המספקת מהירויות של עד 150,000 x g</td><td></td></tr><tr><td>שרף NiNTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית ריקה Econo-Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>או כל עמודת זכוכית או פלסטיק ריקה אחרת</td></tr><tr><td>גודל אי הכללה עמודת כרומטוגרפיה HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>מערכת כרומטוגרפיה &Auml; kta Purifier</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>או כל מערכת כרומטוגרפיה אחרת</td></tr><tr><td>צינורות דיאליזה Spectra/Por 3</td><td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>סגירת צינורות דיאליזה Spectrum</td><td>Labs</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>יחידות אולטרה-סינון (רכזים) 10,000 NWCO</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td></td><td></td><td></td> UV-Vis</tr><tr><td>< חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק</td><td>><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>ציוד (קריסטלוגרפיה)</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נמוך, פיפטה בנפח 0.1-10 ומיקרו; l</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטה תזוזה חיובית Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>רובוט התגבשות</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לוחות התגבשות 96 בארות TTP IQ עם שלוש בארות חלבון</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>או כל צלחת התגבשות אחרת של 96 בארות&nbsp;</td></tr><tr><td>24 בארות CombiClover Junior Plate</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>סרט איטום קריסטל ברור</td><td>המפטון מחקר</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות כיסוי זכוכית סיליקון Hampton</td><td>Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>מסכי התגבשות מסחריים: SaltRx, אינדקס, PEG/Ion, קריסטל</td><td>המפטון מחקר</td> מסכי התגבשות מסחריים <td>מגוונים</td><td></td></tr><tr><td>: אשף, PACT++, JCSG++Jena</td> <td>Bioscience</td><td>מגוון</td><td></td></tr><tr><td>JBS חרוזים לזרעים</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (לולאות ניילון)</td> <td>Hampton Research</td> גדלי לולאות <td>מגוונים</td><td>0.025 מ"מ - 0.5 מ"מ</td></tr><tr><td>בקבוקון CrystalCap</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>קצף קריוגני Dewar 800 מ"ל</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>קצף קריוגני Dewar 2 L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>מהדק בקבוקון, ישר</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>CrystalWand מגנטי, Straight</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 מחזיק בקבוקון</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane קודן צבע - White</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מלקחיים ישרים</td><td>כל</td><td></td><td>למניפולציה של סרט איטום. etc.</td></tr><tr><td>מחט דיקור סיני</td><td>any</td><td></td><td>e. מבית מרקחת</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>כל</td><td></td><td>לבדיקת לוחות התגבשות והרכבה גבישית, הגדלה עד פי 160</td></tr></tbody></table>

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה<em&gt; c. difficile</em&gt; ppep-1 באמצעות microseeding ואבץ-sad

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

יש צורך בטיפולים חדשים לטיפול בזיהומי קלוסטרידיום דיפיצילה המהווים איום משמעותי על בריאות האדם. C. difficile metalloprotease PPEP-1 הוא יעד לפיתוח עתידי של מעכבים להפחתת האלימות של הפתוגן. כדי לבצע אפיון ביופיזי ומבני כמו גם בדיקת מעכבים, יהיה צורך בכמויות גדולות של חלבון טהור ופעיל. פיתחנו פרוטוקול לייצור וטיהור יעיל של PPEP-1 על ידי שימוש ב-E. coli כמארח הביטוי המניב כמויות וטוהר מספיקים של חלבון להתגבשות וקביעת מבנה. בנוסף, באמצעות מיקרו-זריעה, ניתן לגדל גבישים משולבים מאוד של PPEP-1 לגבישים מסודרים היטב המתאימים לניתוח עקיפה של קרני רנטגן. השיטות יכולות לשמש גם לייצור חלבונים רקומביננטיים אחרים ולחקר המבנים של חלבונים אחרים המייצרים גבישים שגדלו זה בזה.

rPPEP-1 מתבטא יתר על המידה בכמה זני E. coli, עם התשואה הגבוהה ביותר ב-E. coli BL21 (DE3) Star (איור 1C). לאחר שלב הכרומטוגרפיה הראשון של זיקה של NiNTA ניתן לנתק בהצלחה את תג 6xHis, מרוב החלבון, ובשלב השני של NiNTA ניתן להפריד לחלוטין חלבון לא מעוכל מחלבון מעוכל תרומבין (איור 1D). בעמודה S200 16/600, rPPEP-1 לא מתויג נודד כמונומר עם חזית מזדמנת המתאימה ככל הנראה למין הדימרי (איור 2A). החלבון טהור (איור 2B...

פרולין-פרולין אנדופפטידאז-1 (PPEP-1) הוא מטאלופרוטיאז מופרש ויעד תרופה מבטיח מהפתוגן האנושי קלוסטרידיום דיפיצילה. כאן אנו מתארים את כל השיטות הדרושות לייצור וקביעת המבנה של חלבון זה.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 באמצעות Microseeding ואבץ-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגדל ביעילות גבישים באיכות עקיפה של סריג יחיד של חלבון פרולין פרולין אנדופפטידאז-1, או rPPEP-1. ללא שיטה זו, rPPEP-1 מייצר באופן מיידי גבישים מגודלים מאוד שאינם מתאימים לניתוח עקיפה של קרני רנטגן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לייצר מספר גבוה של גבישים מסודרים היטב ועקיפה היטב לקביעה מבנית של rPPEP-1 בפרק זמן קצר ועם קלט חומר מוגבל.הליך זה עושה שימוש בשיטת המיקרו-עיר וניתן להתאים אותו לכל מצב התגבשות ראשוני מוצלח של rPPEP-1 כמו גם למתחמי הפפטידים של המצע שלו. ניתן להתאים את השיטה הזו לייצור גבישים מסודרים היטב של כמעט כל חלבון שמניב גבישים שגדלו זה בזה. זה יכול לשמש גם בניסויי זריעה צולבת, שונות חלבון, או בניסויי התגבשות עם מולקולות קטנות.הדגמה חזותית של הטיפול בשיטות התגבשות היא קריטית, מכיוון שאפילו לשינויים קטנים יכולה להיות השפעה משמעותית על איכות העקיפה של הגבישים. בצע ניסויי התגבשות בפורמט טיפת ישיבה באמצעות מסכים סטנדרטיים זמינים מסחרית ורובוט התגבשות. ראשית, רכזו את החלבון המטוהר ל-12 מיליגרם למיליליטר באמצעות מכשיר אולטרה-סינון צנטריפוגלי במרווחים של חמש דקות ב-4000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס.מערבבים את החלבון לאחר כל מרווח כדי למנוע משקעים והחמרה. קבע את ריכוז החלבון ב-280 ננומטר על ידי שימוש במקדם ההכחדה של 25, 900 לסנטימטר טוחן. לאחר

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בזאת הוא תיאר את ההליך מיושם קבוצת מבניים ותפקודיים ביולוגיה קאפרי ממברנה להגדיר באופן ידני ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה ב mesophases lipidic.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

תכנון תרופות המבוסס על מבנה ממלא תפקיד חשוב בפיתוח תרופה. רודף מטרות מרובות במקביל מגדיל מאוד את הסיכוי להצלחה לגילוי עופרת. המאמר הבא מדגיש עד כמה מרכז ג'נומיקס המבני סיאטל למחל זיהומיות מנצל גישה רב יעד לקביעת גן למבנה של שפעת PB2 מקטע.

גישת עיבוד מקביל רב היעד לקביעת גנטי למבנה של פולימראז שפעת PB2 מקטע

מקור: Figueroa, D. M., et.al. ייצור והדמיה של ספרופלסטים ופרוטופלסטים חיידקיים לאפיון לוקליזציה של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את הייצור של ספרופלסטים Escherichia coli על ידי עיכוב חלוקת התאים כדי לגרום לנימה, ולאחר מכן עיכול אנזימטי של דופן התא. התהליך כולל הוספה מבוקרת של חומר כלאט, DNase ומייצב אוסמוטי כדי להבטיח היווצרות ויציבות תקינה של ספרופלסט לתצפית מיקרוסקופית.

הכנת ספרופלסט E. coli

מחקרי Biophysical והביוכימי של אינטראקציות בין חלבוני קרום תחומים מוטבעים-להתמודד עם אתגרים טכניים רבים, הראשונה שבן היא קבלת חומר הלימוד מתאים. מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקה וטיהור מתחמי פפטיד הטרנסממברני דיסולפיד-התייצב המתאימים לניתוח מבנים על ידי תהודה מגנטית גרעינית פתרון (NMR) ויישומים אנליטיים אחרים.

מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים

β חלבוני ממברנה חיצונית (OMPs) משרתים פונקציות רבות בתוך הממברנות החיצוניות של חיידקים גראם-שליליים, מיטוכונדריה וכלורופלסטים. כאן, אנו מקווים להקל על צוואר בקבוק ידוע במחקרים מבניים על ידי הצגת פרוטוקולים לייצור OMPs של β חביות בכמויות מספיקות לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או ספקטרוסקופיה NMR.

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

פרוטוקול יעילה לביצוע הביוכימי ומבניים נרחב של איפיון פרוטאין מחייב המצע פחמימות של סטרפטוקוקוס pneumoniae מוצג.

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצר גראם שליליים Escherichia coli (e. coli) spheroplasts, גראם חיוביים Bacillus megaterium (נולד ב- megaterium) protoplasts כדי להמחיש באופן ברור ולאפיין במהירות אינטראקציות פפטיד-חיידקים. זה מספק שיטה שיטתית כדי להגדיר ממברנה ההתאמה לשפות אחרות, translocating פפטידים.

ייצור והדמיה של חיידקי Spheroplasts ו- Protoplasts כדי לאפיין פפטיד מיקרוביאלית לוקליזציה

אנו מתארים פרוטוקולים עבור קביעת המבנה של התחום המחייב של IKK של נמו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. השיטות כוללות ביטוי חלבונים, טיהור ואפיון, כמו גם אסטרטגיות למיטוב מוצלח של גביש וקביעת מבנה של החלבון בצורתו הלא מאוגדת.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו

פרוטוקול זה פותח כדי ללמוד את המעבר dimer-dodecamer של TmPep1050, M42 aminopeptidase, ברמה המבנית. זהו צינור פשוט החל מטיהור חלבונים לעיבוד נתוני רנטגן. Crystallogenesis, אינדקס סט נתונים, והחלפה מולקולרית הודגמו באמצעות מקרה של מחקר, TmPep1050H60A H307A משתנה.

קריסטלוגרפיה רנטגן כדי ללמוד את המעבר המדינה אוליגומרית של Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

מתואר מכשיר מיקרופלואידי רב-תכליתי המאפשר התגבשות של אנזים בשיטת דיפוזיה נגדית, הכנסת מצע בגבישים על ידי השרייה, וקביעת המבנה בתלת-ממד של האנזים: קומפלקס מצע על ידי ניתוח סדרתי של גבישים בתוך השבב בטמפרטורת החדר.

התגבשות וקביעת מבנה של אנזים:קומפלקס מצע על ידי התגבשות סדרתית בשבב מיקרופלואידי רב-תכליתי

קביעת מבנה של מתחמים מקרומולקולריים באמצעות cryoEM הפכה לשגרה עבור סוגים מסוימים של חלבונים ומתחמים. כאן, צינור זה מסוכם (הכנה לדוגמה, סינון, רכישת נתונים ועיבוד) והקוראים מופנים למשאבים ומשתנים מפורטים נוספים שעשויים להשתנות במקרה של דגימות מאתגרות יותר.

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

למד כיצד לגדל גבישים איכותיים של rPPEP-1 מ-Clostridium difficile באמצעות שיטת microseeding. טכניקה זו מאפשרת קביעת מבנה חלבון ברזולוציה גבוהה לצורך גילוי תרופות.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה

גלה סרטונים נוספים