הפקה, התגבשות וקביעת מבנה C. difficile PPEP-1 באמצעות Microseeding ואבץ-SAD

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגדל ביעילות גבישים באיכות עקיפה של סריג יחיד של חלבון פרולין פרולין אנדופפטידאז-1, או rPPEP-1. ללא שיטה זו, rPPEP-1 מייצר באופן מיידי גבישים מגודלים מאוד שאינם מתאימים לניתוח עקיפה של קרני רנטגן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לייצר מספר גבוה של גבישים מסודרים היטב ועקיפה היטב לקביעה מבנית של rPPEP-1 בפרק זמן קצר ועם קלט חומר מוגבל.

הליך זה עושה שימוש בשיטת המיקרו-עיר וניתן להתאים אותו לכל מצב התגבשות ראשוני מוצלח של rPPEP-1 כמו גם למתחמי הפפטידים של המצע שלו. ניתן להתאים את השיטה הזו לייצור גבישים מסודרים היטב של כמעט כל חלבון שמניב גבישים שגדלו זה בזה. זה יכול לשמש גם בניסויי זריעה צולבת, שונות חלבון, או בניסויי התגבשות עם מולקולות קטנות.

הדגמה חזותית של הטיפול בשיטות התגבשות היא קריטית, מכיוון שאפילו לשינויים קטנים יכולה להיות השפעה משמעותית על איכות העקיפה של הגבישים. בצע ניסויי התגבשות בפורמט טיפת ישיבה באמצעות מסכים סטנדרטיים זמינים מסחרית ורובוט התגבשות. ראשית, רכזו את החלבון המטוהר ל-12 מיליגרם למיליליטר באמצעות מכשיר אולטרה-סינון צנטריפוגלי במרווחים של חמש דקות ב-4000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס.

מערבבים את החלבון לאחר כל מרווח כדי למנוע משקעים והחמרה. קבע את ריכוז החלבון ב-280 ננומטר על ידי שימוש במקדם ההכחדה של 25, 900 לסנטימטר טוחן. לאחר איזון החלבון ל -20 מעלות צלזיוס, יש לנקות את כל החלקיקים והאבק על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 16000 פעמים גרם ו -20 מעלות צלזיוס.

לביצוע מסכי קריסטל, השתמש בלוחות התגבשות מלאים מראש אטומים ומאוחסנים בארבע מעלות צלזיוס. בעת הגדרת ניסויים, עבוד במהירות, מכיוון שהנפחים הקטנים מתייבשים במהירות. השתמש גם בתא לחות סביב המזח של הרובוט במידת האפשר.

לאחר איזון כל לוחות ההתגבשות ל-20 מעלות צלזיוס, הגדר את המסך על ידי פיפטינג של מאגר חלבון לבארות משנה שתיים עד ארבע. השתמש בנפח טיפה של 300 ננו-ליטר. השתמש ביחסי חלבון למאגר של 200:100 עבור תת-באר שתיים, 150:150 עבור תת-באר שלוש ו-100:200 עבור תת-באר ארבע.

אוטמים מיד את הצלחת ומניחים אותה בתא בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. בדוק את המגשים לאחר ההתקנה כל יום במהלך השבוע הראשון ולאחר מכן המשך בבדיקה שבועית. לצורך התגבשות משותפת של קומפלקסי rPPEP-1 של פפטיד המצע, מערבבים rPPEP-1 ב-24 מיליגרם למיליליטר ביחס של 1:1 עם עודף מולרי פי שבעה של תמיסת פפטיד להניח אבקה ליופילית מסיסה בתמיסת מלח חוצצת טריס.

לאחר דגירה של 30 דקות בחום של 20 מעלות צלזיוס, יש לנקות את כל החלקיקים והאבק על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 16000 פעמים גרם ו -20 מעלות צלזיוס. המשך בהתגבשות באמצעות אותו הליך מיקרו-זריעה כמו עבור חלבון rPPEP-1 הלא קשור. גבישים מגודלים מאוד של rPPEP-1 הופיעו לאחר יומיים במצב המכיל 2.4 אמוניום פוספט דו-בסיסי מולרי ו-0.1 pH טריספסיל מולרי 8.5.

כדי לייעל את המצב ההתחלתי, השתמש בתוכנה כדי לחשב את הנפחים ואת ערכת הפיפטינג כדי להשיג שני מיליליטר מכל תנאי המאפשר 10 מסכי אופטימיזציה. התנאים כוללים 1.8 עד 2.55 אמוניום פוספט דו-בסיסי מולרי בשלבים של 0.15 מולארי וכן 0.1 pH טריספסיל מולארי 7.5 עד 9.0 בשלבים של 0.5 יחידות pH. הכן מסך רשת המורכב מ-24 תנאים מפתרונות מלאי.

השתמש בערכת הפיפטינג כדי לחבר את התנאים האישיים. פיפטה 200 מיקרוליטר מכל תמיסת רשת לתוך הבארות של צלחת 24 בארות ואיזון הצלחת ב-20 מעלות צלזיוס. הגדר ידנית את לוחית ההתגבשות.

השתמש בנפח טיפה של שלושה מיקרוליטר ויחס חלבון למאגר של 2:1, 1.5:1:5 ו-1:2. כאן, השתמש בפיפטה תזוזה חיובית כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. אטום מיד את הצלחת.

לאחר מכן הניחו את הצלחת בתא בחום של 20 מעלות צלזיוס. לאחר יום עד ארבעה ימים, גבישים מגודלים מאוד של rPPEP-1 מופיעים בארבעת המצבים המכילים 2.55 אמוניום פוספט דו-בסיסי מולרי ו-0.1 pH טריספליל מולארי 7.5 עד 9.0, בעוד שלא נוצרים גבישים ב-20 התנאים הנותרים. בצע את הליך המיקרו-זריעה כדי להשיג גבישים בודדים של rPPEP-1 בתנאים אלה.

להכנת מלאי מיקרו-זרעים, בחר תחילה גביש יחיד שגדל בין אחד התנאים המוצלחים. לאחר מכן, העבירו 50 מיקרוליטר של משקה האם המתאים לצינור של 1.5 מיליליטר המכיל חרוז זכוכית קטן ומלוטש מאוד ומיקרוליטר אחד של משקה האם לשקופית כיסוי הזכוכית. בעזרת סיכת ניילון מותקנת, דגו את הקריסטל והעבירו אותו לטיפה על מגלשת כיסוי הזכוכית.

לאחר מכן העבירו את הנוזל המכיל את הגביש לתוך הצינור והמערבולת במהירות גבוהה למשך 30 שניות, וודאו שחרוז הזכוכית מסתחרר. בצע דילול של 1:1000 של מלאי הזרעים לתוך שפופרת חדשה של 1.5 מיליליטר המכילה את אותו מצב שהוכן טרי ומערבולת ביסודיות למשך חמש שניות. לאחר מכן, הסר את חותם הצלחת המכסה את 20 התנאים בטיפות שקופות.

פיפטה 0.5 מיקרוליטר ממלאי הזרעים לבארות. אוטמים את הצלחת ומכניסים אותה לתא בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר יישום טכניקת מיקרו-זריעה זו, גבישים בודדים באיכות עקיפה גבוהה מופיעים מספר שעות עד מספר ימים לאחר ההתקנה בתנאים שונים, המכילים 1.8 עד 2.4 אמוניום פוספט מולרי ו-0.1 טריס מולרי pH 7.5 עד תשע.

גבישים גדלים לגודל של 100 עד 200 מיקרון בממד הגדול ביותר. בחר את הגודל האופטימלי של לולאת ניילון עבור האורך המקסימלי של הגבישים שנבחרו על ידי הנחת הלולאה על סרט האיטום ממש מעל הגביש והתמקדות למעלה ולמטה. הגישה הארוכה ביותר האופיינית לגבישי rPPEP-1 היא כ-100 עד 200 מיקרון.

הכן גם את המצב הקפוא המתאים. מלאו את הקצף בחנקן נוזלי. לאחר מכן טען את מהדק הבקבוקון בבקבוקון וקירר אותו מראש בחנקן נוזלי מלא 800 מיליליטר קצף.

הנח מחזיק קריוקן המסומן במזהה מתאים ושרוול קריו-שרוול בחנקן נוזלי מלא בשני ליטר קצף. לאחר מכן טען את השרביט המגנטי עם לולאת הניילון המותקנת בגודל הנכון. לאחר מכן, חותכים את סרט האיטום על צלחת ההתגבשות בעזרת אזמל חד ומסירים אותו בעזרת מלקחיים.

פיפטה מיקרוליטר אחד של ה-cryocondition על שקופית הכיסוי. חשוב במיוחד לעבוד מהר בשלב זה, שכן ייבוש הגביש או הנפח הזעיר של קריו-תמיסת בלולאה עלולים להוביל לתנודות באיכות הגביש או אפילו לאובדן מוחלט של עקיפה. יש לבצע את כל שלבי המניפולציה של הגביש תחת מיקרוסקופ הסטריאו.

אם הגביש נדבק למשטח הפלסטיק, נתק אותו מהקרקע על ידי עיוות הפלסטיק שמסביב בעזרת מחט דיקור. הסר את הקריסטל מהטיפה על ידי דיג אותו החוצה עם לולאת הניילון המותקנת. העבירו במהירות את הגביש לטיפה של מצב קריו ותנו לו להתייצב לשנייה אחת.

לאחר מכן דג את הקריסטל מהטיפה עם לולאת הניילון המותקנת במהירות האפשרית. צלול מיד להקפיא את הגביש שאוחזר בחנקן נוזלי. כאשר החנקן הנוזלי סביב הלולאה המותקנת מפסיק לרתוח, הנח את הלולאה בבקבוקון.

הנח את הבקבוקון על מחזיק הקריוקן. לאחר שהמחזיק נטען בשישה בקבוקונים, הנח שרוול קריו סביב המחזיק. אחסן את הגבישים במיכל מלא בחנקן נוזלי עד לשימוש.

כדי לבצע איסוף נתונים, אחזר בזהירות את הגביש המותקן מהקריוקן באמצעות מהדק ואחסן אותו בטל קצף להובלה. הזז את מעצור האלומה ואת הגלאי למצב חניה והזיז את הזרבובית הקפואה למעלה בכמה מילימטרים. הרכיבו את בסיס הקריוקאפ על ראש הגוניומטר על ידי שמירה על הבסיס באצבעות תוך הסרה מהירה של הבקבוקון.

לאחר מכן הזיזו את הזרבובית ואת עצירת הקורה בחזרה למקומם ומרכז את הגביש. בכל עת, היזהר לא לגעת במעצור הקרן או בגלאי. המשך לאסוף את מערך הנתונים של 180 מעלות עם זווית תנודה של 0.1 מעלות, כפי שמוצג כאן.

מוצגים כאן גבישי rPPEP-1 מגודלים מאוד המתקבלים מסינון ראשוני באמצעות מסכי התגבשות מסחריים ב-1.4 נתרן ציטראט טרי-בייסי דיהידרט, 0.1 נתרן HEPES מולרי, pH 7.5. מוצגים כאן גבישים המתקבלים מהקרנה ראשונית עם 60% נפח לנפח טקסימט, pH 7.0, 0.1 פרופאן BIS-TRIS מולרי, pH 7.0. גבישים הופיעו גם ב-2.4 אמוניום פוספט דו-בסיסי מולרי, 0.1 טריס מולארי, pH 8.5.

לאחר יישום הליך אופטימיזציית המיקרו-זריעה, גבישים בודדים נכללו במספר תנאים, כולל 2.1 אמוניום פוספט דו-בסיסי מולרי, 0.1 טריס מולרי, pH 8 ו-2.25 אמוניום פוספט דו-בסיסי מולרי, 0.1 טריס מולארי, pH 8. הגבישים המותקנים בלולאות ניילון הם בגודל של 100 עד 200 מיקרון ונראה שיש להם סריג יחיד מבדיקה מיקרוסקופית. ניתוח עקיפה של קרני רנטגן מראה כי גבישים אלה אכן מציגים סריג יחיד וקרני רנטגן עקיפות לרזולוציה כמעט אטומית.

פתרון המבנה הגבישי של קומפלקס פפטיד המצע הרקומביננטי PPEP-1 נותן תובנה לגבי מצב קשירת המצע של PPEP-1. פפטיד הסובסטרט יכול להתפזר לקבוצת קשירת הסובסטרט של PPEP-1 באישור הפתוח שלו. לאחר מכן, כאשר תתרחש סגירת הלולאה, המצע מקיים אינטראקציה עם PPEP-1 באמצעות קשרי מימן ורשת שרשרת הצד האליפטית-ארומטית הייחודית הממוקמת על לולאת S.

המצע נקשר בקונפורמציה כפולה ייחודית עם קיפולים בקשר הפפטיד הרוחש והקשר הפפטידי הראשוני P2 ל-P3. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר גבישים עקיפה היטב של סריג יחיד של PPEP-1 רקומביננטי למחקרים מבניים. ניתן להשתמש בגישות דומות עם חלבונים אחרים, מה שמניב גבישים שגדלו זה בזה וטמפרטורת דגירה מגוונת עוד יותר ודילול מלאי C.

בשל הרבגוניות והשימוש הפשוט שלה, יש לנסות את הטכניקה הפשוטה הזו בכל תהליך אופטימיזציה של גבישים.