ב הכלאה באתרו עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להמחיש דפוסי ביטוי של mRNA ברמה התאית ברגישות ובסגוליות גבוהות. זאת מושג תחילה על ידי העברת חתכי רקמה מקובעים בפורמלין ומוטמעים בפראפין דרך סדרה של תמיסות כדי להסיר את השעווה, להחדיר חומרים לרקמות ולחסום קבוצות מינוס טעונות חיובי במרקמות שעלולות להניב אות רקע. לאחר מכן, גשמי RNA המסומנים ב-DIG וספציפיים לגן לבחירה מחלחלים לתוך חתכי הרקמה, והשקופיות עוברות היברידיזציה במהלך הלילה.

בשלב הבא, השקופיות מטופלות ב-RNAs. A כדי להסיר פרוב שנקשר באופן לא ספציפי מהחתכים, ולאחר מכן מדגירות עם נוגדן anti DIG. פעולה זו מאפשרת ויזואליזציה של הפרוב ההיברידי באמצעות תגובה כימית קולורימטרית.

התוצאות מראות אות כחול כהה הניתן לזיהוי במיקרוסקופיה של אור, באופן ספציפי באותם תאים ברקמה שבהים מובע הגן הנחקר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות לניתוח ביטוי, כגון R-T-P-C-R, מערכי מיקרו (microarray) או גישות של Next Generation Sequencing, הוא שפרוטוקול ה-In Situ Hybridization המוצג כאן חושף את דפוס הביטוי של הגן הנחקר בתוך ההקשר הרקמתי שלו. שיטות אלו כוללות שלבים רבים שמוטב ללמדם באמצעות הדגמות ויזואליות.

אנו נראה כיצד לבצע חיתוך והטמעה של רקמות, וכן שלבים מרכזיים בפרוטוקול ההיברידיזציה של AI שקשה לשלוט בהם באופן עצמאי. שיטת ההטמעה של רקמות שקובעו בפאראלדהיד תשתנה בהתאם לסוג הרקמה המיועדת לניתוח. הנקודה החשובה ביותר כאן היא להבטיח שהדגימות מונחות בכיוון הנכון לצורך החיתוך בהמשך.

שיטה אחת להטמעה היא שימוש בתבניות ובטבעות פלסטיק. כדי להתחיל בהליך זה, חממו את התבניות על פלטת חימום בטמפרטורה של 60 °C ולאחר מכן צקו פראפין מותך לתוך התבניות. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה מחוממת כדי להעביר דגימת רקמה לתוך כל תבנית וכוון אותה למצב הרצוי.

העבירו בזהירות את התבנית מהפלטה למשטח העבודה והניחו את הטבעת הלבנה על התבנית. הוסיפו עוד שמאץ ושעווה. הניחו לשעווה להתקרר ולהתקשות בהדרגה לפני החיתוך.

חממו את הבלוקים לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן גזרו כל בלוק לצורת טרפז, תוך השארת כ-1 מילימטר של שעווה מסביב לדגימה. מקמו את הבלוק הגזור על המיקרוטום כך שהפאה הארוכה יותר מבין שתי הפאות המקבילות תהיה למטה. קרבו בזהירות את הבלוק אל הלהב וודאו שפני השטח של הבלוק מקבילים לחתך הלהב.

בעובי של 8 עד 10 מיקרונים. יישרו את סרטי השעווה על משטח שאינו נדבק, כגון נייר אלומיניום, ובחרו את החתכים המעניינים תחת מיקרוסקופ דיסקציה. לאחר מכן, סמנו את שקופיות ה-prob bon plus בעזרת עיפרון.

אין להשתמש בעטים על המסמנים כיוון שהם יימחקו במהלך פרוטוקול ההיברידיזציה הכפול של INI. פזרו מיליליטר אחד של מי milli Q נקיים על כל זכוכית. צפו בזהירות את החתכים הרלוונטיים על פני המים בטמפרטורת החדר.

ודאו שהצד המבריק פונה כלפי המים. העבירו את הזכוכית בזהירות למחמם שקופיות. כוון את הטמפרטורה ל-35 עד 37 °C.

טווח טמפרטורה זה, בניגוד ל-42 מעלות צלזיוס הנפוצות בשימוש, מונע היווצרות של בועות תחת השטחים. לאחר חמש דקות, שפכו את המים בזהירות אך בתנועה אחת חלקה, כך שהסרט יירד אל על גבי השקף. הניחו לשקפים להתייבש למשך מספר שעות לפחות או למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, כדי שהרקמה תידבק להכנת חתכי רקמה.

עבור היברידיזציה in situ, הם עוברים תחילה דפראזציה ורי-הידרטציה לצורך סיום תהליך הדפראזציה. יש להדגיר את השקופיות בשני סבבים של תמיסת histic clear למשך 10 דקות כל אחד. כדי לבצע רי-הידרטציה לחתכי הרקמה, העבירו את השקופיות דרך סדרה של ריכוזי אתנול יורדים למשך 30 שניות כל אחד.

במהלך הטיפול בפרוטאז, שאינו מוצג בסרטון זה, הכינו צלחית זכוכית עם תמיסת triathlon amine בריכוז 0.1 molar והניחו אותה על בוחן מגנטי בתוך מ 빠르게 (fume hood). מיד לפני הנחת מתקן השקופיות המתכתי לתוך התמיסה, הוסיפו 1.25 milliliters של acetic anhydride לתוך ה-triathlon amine, הבאפר והערבוב. בנוסף, הכינו את מערכת הת clamp והמעמד להחזקת מתקן השקופיות.

הפחיתו את מהירות הסטירר (Starr), הדקו את מתקן השקופיות למעמד והורידו את המתקן לתוך התמיסה, תוך שמירה על גובהו מעל למגנט השקיעה (stir bar). המשיכו לערבב לאט במשך 10 דקות, לאחר שטיפה ב-PBS והתייבשות חוזרת באמצעות סדרת אתנול. חתכי הרקמה מוכנים כעת להיברידיזציה.

הניחו את העגילות על משטח נקי והניחו להן להתייבש באוויר באופן מלא למשך חמש עד 10 דקות. הכינו את תערובת בופר ההיברידיזציה של הגשש על ידי הוספת הגשש הדנטורי ל-80 microliters של בופר היברידיזציה. עבור כל עגילה, ערבבו היטב באמצעות פיפטינג, והימנעו מיצירת בועות.

העבירו בפיפט את תמיסת ההיברידיזציה של הגששים. ערבבו את התמיסה בקצה הימני של השקופית. הניחו בעדינות כיסוי זכוכית על השקופית, תוך וידוא שתמיסת ההיברידיזציה מכסה את כל החתכים ללא בועות.

הקישו קלות עם האצבע על כיסוי המבחנה במקומות שבהם נוצרו בועות כדי להוציאן מכל נתוחי הרקמה. אין להסיר את הכיסוי, שכן הדבר יגרום לנזק לנתחים. הניחו את השקופיות בתא לחות המכיל נייר Watman שהורטב ב-UE water ומכוסה ברובו ב-param.

אטמו את הקופסה היטב והדגירו את השקופיות בטמפרטורת ההיברידיזציה הרצויה, בדרך כלל 50 עד 55 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 20 שעות. עם השלמת פרוטוקול ההיברידיזציה, הסירו בזהירות את לביבות הכיסוי מהשקופיות. לביבות הכיסוי עשויות פשוט ליפול כאשר השקופית מונחת במצב אנכי, אך אם לא, אל תמשכו את לביבות הכיסוי שכן הדבר יגרום לנזק לחתכים.

במקום זאת, טבל את השקופית ב-0.2 times SSC חם למשך דקה או שתיים כדי לשטוף את מכסית הזכוכית; לאחר הסרת מכסיות הזכוכית, הנח את השקופיות במגש ושטוף מספר פעמים ב-0.2 times SSC בטמפרטורה של 55 °C. לאחר הטיפול ב-RNAs, העבר את השקופיות מהמגש לתחתית של קופסת פלסטיק שטוחה וכסה בנפח מינימלי של תמיסת חסימה. חסום את השקופיות למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר על פלטפורמה המנערת באיטיות.

בשלב הבא, מרחו נפח מינימלי של תמיסת נוגדנים ישירות על כל שקופית. דגרו את השקופיות בחשיכה למשך שעתיים עד שלוש שעות בטמפרטורת החדר. עם סיום הדגירה, העבירו את השקופיות לקופסה שטוחה ונקיים, ושטפו את השקופיות ארבע פעמים עם נפח מינימלי של בופר שטיפה על פלטפורמת ניעור בטמפרטורת החדר.

שטפו את השקופיות פעם אחת ב-TBS ופעמיים בבופר TN לפני יישום תמיסת צבע שהוכנה טריה על השקופיות. ראשית, שפכו את תמיסת הצבע לתוך כלי שקילה פלסטיק קטן. לאחר מכן, הצמידו שתי שקופיות זו לזו כאשר החתכים פונים זה לצד זה.

טבול את ה"סנדוויץ'" לתוך התמיסה, ואפשר לפעולת הנימיות למשוך את התמיסה למעלה. נקז את השקופיות על נייר קימ-וואייפ (kim wipe). מלא את השקופיות בתמיסת צביעה.

שוב, ייתכן שיהיה צורך להקיש על הנסכים בעוד התמיסה זורמת פנימה כדי למנוע בועות; יש להניח את הנסכים בקופסת פלסטיק ולאחסנם בטמפרטורת החדר בחושך. תוצאות מייצגות שהושגו עם גששים שונים ורקמות arabidopsis מוצגות כאן. האות הסגול מספק ויזואליזציה ישירה ברזולוציה תאית של דפוס הביטוי של הגן הנחקר.

פאנל A מראה את הלוקליזציה של תמלילי shoot Meli one ב apex של הנבט הצמחי. שימו לב לנוכחות של אות בצבע סגול-כחול באזור ה-indeterminate של המריסטמה ולהיעדר אות בעלים הסובבים אותה. פאנלים B-D הם חתכים של עוברים של arabidopsis בשלב ה-torpedo, כאשר פאנל B מראה ביטוי של covata three במספר קטן של תאי גזע עובריים.

תמונה C מראה ביטוי של T ML one בשכבת האפידרמיס, ותמונה D מראה היעדר אות בחתכים שנבדקו עם RNA של בקרת שלילה אקראית. התמונות הבאות מציגות תוצאות שהושגו באמצעות גשים שונים ברקמות תירס. פאנל E מראה את הלוקליזציה של STM Humalog knotted one בעובר תירס מתפתח.

שימו לב לאות החזקה במיוחד בחתכים לונגיטודנליים של הגבעול העוברי והשורש בנבט הצמיחה הווגטטיבי, המראים כי ARF3A מתבטא על פני השטח האקסיאלי התחתון של העלה בלוח F, וכי ההומולוג של ATML1, הנקרא OCL4, מתבטא באופן ספציפי באפידרמיס בלוח G. כצפוי, לא נצפתה אות היברידיזציה עבור הגשש של ביקרת השלילה בלוח H. התוצאות הצפויות של נקודות הבקרה השונות במהלך התעתוק in vitro של הגששים מוצגות כאן. גששי ההיברידיזציה in situ נבדקים על ג'ל ARAZ סטנדרטי לאחר תעתוק in vitro, לאחר טיפול ב-DNA וניקוי עוקב של תגובת התעתוק in vitro. לאחר הידרוליזת פחמתית, ובמידה והגששים מוכנים לשימוש ואורכם מעל 250 זוגות בסיסים, כגון גשש 1, הידרוליזת הפחמתיות תניב טווח של מקטעי גשש קטנים יותר.

איור זה מציג את תוצאות האיכות הצבעית והמטרית של גששים באמצעות ניתוח dot blot. דילולים הנעים בין 10⁻¹ ל-10⁻⁵ של גשש ביקורת בריכוז של 100 ng/µL ושלושה גששים חדשים המסומנים ב-DIG ננקדו על קרום העברה שעבר אינקובציה עם נוגדן anti-DIG ובדיקה. הניתוח מצביע על ריכוז מוערך של 100 ng/µL עבור גשש 2, 10 ng/µL עבור גשש 3 ו-1 ng/µL עבור גשש 4, מה שמעיד כי גשש 4 אינו צפוי להניב אות היברידיזציה טוב. לבסוף, חתכים אורך אלה דרך קודקוד הנביטה הצמחי (vegetative chute apex) מתירס מספקים השוואה בין אות רקע לא ספציפי לבין פאנל גששים הפועל היטב.

תמונה A מראה אות רקע לא ספציפי, בעוד שפאנל B מראה אות היברידיזציה in situ כפולה ספציפי כדיגש על הגשוש OC five בשכבת התאים החיצונית. לאחר צפייה בסרטון, אמורה להיות לכם הבנה טובה כיצד לבצע רבים מהשלבים המורכבים בפרוטוקולי ההיברידיזציה הראשונית, כך שתוכלו לקבוע את דפוסי הביטוי הזמנית המדויקים של הגנים המועדפים עליכם.