ב הכלאה באתרו עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדמיין דפוסי ביטוי mRNA ברמה התאית עם רגישות וסגוליות גבוהות. זה מושג על ידי לקיחת קטעי רקמה פורמליים וקבועים ופרפין משובצים דרך סדרה של פתרונות להסרת השעווה, לחלחל לרקמות ולחסום קבוצות קטנות טעונות חיובית ברקמות שיכולות להניב אות רקע. לאחר מכן, בדיקות RNA המסומנות על ידי DIG ספציפיות לגן המעניין חודרות לתוך חלקי הרקמה והשקופיות עוברות הכלאה בן לילה.

לאחר מכן, השקופיות מטופלות ב- RNA. A כדי להסיר בדיקה שאינה קשורה במיוחד מהחלקים ולאחר מכן מודגרת עם נוגדן נגד DIG. זה מאפשר הדמיה של הגשושית ההיברידית על ידי תגובה כימית מטרית צבעונית.

התוצאות מראות אות כחול כהה הניתן לזיהוי על ידי מיקרוסקופ אור במיוחד באותם תאים בתוך הרקמה שבה מתבטא הגן המבוקש. היתרון העיקרי של טכניקה זו של ניתוח הביטוי האחר שלנו, כגון R-T-P-C-R, מיקרו-ריי או גישות ריצוף הדור הבא הוא שפרוטוקול I Hybridization המוצג כאן חושף את דפוס הביטוי של גן מעניין בהקשר הרקמה שלו. שיטות אלו כוללות שלבים רבים הנלמדים בצורה הטובה ביותר על ידי הדגמות חזותיות.

אנו נראה כיצד לחתוך ולהטמיע רקמות כמו גם שלבים מרכזיים בפרוטוקול Al Hybridization pro שקשה לשלוט בהם בעצמך. שיטת הטמעת רקמות קבועות של פרלדהיד תשתנה בהתאם לסוג הרקמה שיש לנתח. הנקודה החשובה ביותר כאן היא לוודא שהדגימות מכוונות נכון לחיתוך מאוחר יותר.

אחת משיטות ההטבעה היא שימוש בתבניות וטבעות פלסטיק. כדי להתחיל בהליך זה, יש לחמם את התבניות על צלחת חימום של 60 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשפוך פרפין מותך לתבניות. לאחר מכן, השתמש במלקחיים מחוממים כדי להעביר דגימת רקמה לכל תבנית ולכוון אותה למיקום הרצוי.

העבירו בזהירות את התבנית מהצלחת לספסל והניחו את הטבעת הלבנה על התבנית. הוסף עוד מול ושעווה. הניחו לשעווה להתקרר ולהתקשות בהדרגה לפני החיתוך.

מחממים את הבלוקים לטמפרטורת החדר, ואז חותכים כל בלוק לצורת טרפז, ומשאירים כמילימטר אחד של שעווה סביב הדגימה. הנח את הבלוק הקצוץ על המיקרוטום כך שהארוך מבין שני הפנים המקבילים נמצא בתחתית. הביאו בזהירות את הבלוק קדימה אל הלהב וודאו שמשטח הבלוק מקביל לחלק הלהב.

בעובי של שמונה עד 10 מיקרון. יישר את סרטי השעווה על משטח נון-סטיק, כגון נייר אלומיניום ובחר קטעים מעניינים תחת טווח חיתוך. לאחר מכן, סמן בעיפרון.

אל תשתמש בעטים על טושים מכיוון שהם יימחקו במהלך פרוטוקול ההכלאה של INI 2. פזרו מיליליטר אחד של מים נקיים על כל שקופית. צפו בזהירות קטעי עניין על פני המים בטמפרטורת החדר.

ודא שהצד המבריק פונה למים. העבירו את השקופית לאט למחמם שקופיות. מוגדר בטמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס.

טווח טמפרטורות זה, בניגוד ל-42 מעלות צלזיוס הנפוצות, מונע היווצרות בועות מתחת לחתכים. לאחר חמש דקות, שפכו את המים בזהירות אך בתנועה חלקה אחת כך שהסרט יורד למטה אל המגלשה. הניחו לשקופיות להתייבש לפחות מספר שעות או למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כך שהרקמה תידבק להכנת קטעי רקמות.

עבור הכלאה באתר, הם קודם כל דפה ומתייבשים לסיום הדפה. דגרו את השקופיות בשני שינויים של פתרון ברור למשך 10 דקות כל אחד. כדי להחזיר לחות לקטעי הרקמה, העבירו את השקופיות דרך סדרה של ריכוזים יורדים של אתנול למשך 30 שניות כל אחת.

במהלך הטיפול בפרוטאז, שאינו מוצג בסרטון זה, הכינו צלחת זכוכית עם תמיסת אמין טריאתלון מולרית 0.1 והניחו אותה על צלחת ערבוב במכסה אדים. מיד לפני הכנסת מתלה השקופיות המתכתי לתמיסה, הוסף 1.25 מיליליטר אנהידריד אצטי לתוך האמין הטריאתלון, המאגר וחדר המדרגות. בנוסף, הגדר את clampמערכת ומעמד להחזקת מתלה השקופיות.

הפחת את מהירות הסטאר clamp את מתלה ההחלקות על המעמד והורד את המתלה לתמיסה, תוך שמירה על אותו מוגבה מעל מוט הערבוב. המשיכו לערבב לאט במשך 10 דקות לאחר שטיפה ב-PBS והתייבשות שוב באמצעות סדרת אתנול. קטעי הרקמות מוכנים להכלאה.

הניחו את השקופיות על משטח נקי ותנו לאוויר להתייבש לחלוטין למשך חמש עד 10 דקות. הכן את תערובת מאגר ההכלאה של הגשושית על ידי הוספת הגשושית המפורקת ל-80 מיקרוליטר של מאגר הכלאה. עבור כל שקופית, מערבבים היטב על ידי פיפטינג פלוס, הימנעו מהכנת בועות.

פיפטה את מאגר ההכלאה של הגשושית. ערבב בקצה השמאלי של השקופית. הורד בהדרגה את החלקת הכיסוי על המגלשה, וודא שתמיסת ההכלאה מכסה את כל החלקים ללא בועות.

הקש קלות על חיתוך הכיסוי עם האצבע במקום שבו נוצרות בועות כדי לעקור אותן מכל חלקי הרקמה. אל תמשוך את חיתוך הכיסוי מכיוון שהדבר יפגע בחלקים. הנח את השקופיות בתא לחות המכיל נייר ווטמן שהורטב במי UE ומכוסה ברובו בפרם.

אטמו את הקופסה בחוזקה ודגרו את המגלשות בטמפרטורת ההכלאה הרצויה, בדרך כלל 50 עד 55 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 20 שעות. בסיום פרוטוקול ההכלאה, הסר בזהירות את החלקות הכיסוי מהשקופיות. החלקת הכיסוי עלולה פשוט ליפול כאשר המגלשה מונחת זקופה, אך אם לא, אל תמשוך את החלקת הכיסוי מכיוון שהדבר יפגע בחלקים.

במקום זאת, טבלו את המגלשה בחום 0.2 פעמים SSC למשך דקה או שתיים כדי לשטוף את החלקת הכיסוי לאחר הסרת החלקות הכיסוי, הנח את השקופיות במתלה ושטוף מספר פעמים ב-0.2 פעמים SSC ב-55 מעלות צלזיוס. לאחר טיפול RNA מעבירים את השקופיות מהמתלה לתחתית קופסת פלסטיק שטוחה ומכסים בנפח מינימלי של תמיסת חסימה. חסום את השקופיות למשך 45 דקות של טמפרטורת החדר על פלטפורמה רועדת לאט.

לאחר מכן, יש למרוח נפח מינימלי של תמיסת נוגדנים ישירות על כל שקופית. דגרו את המגלשות בחושך במשך שעתיים-שלוש בטמפרטורת החדר. בסיום הדגירה, העבירו את השקופיות לקופסה שטוחה ונקייה ושטפו את המגלשות ארבע פעמים בנפח מינימלי של מאגר כביסה על משטח טלטול בטמפרטורת החדר.

שטפו את השקופיות פעם אחת ב-TBS ופעמיים במאגר TN הציעו למרוח תמיסת מכתים טרייה שהוכנה על השקופיות. ראשית, שפכו את תמיסת הצביעה לכלי שקילה קטן מפלסטיק. לאחר מכן כריך שתי שקופיות יחד כשהחלקים פונים זה לזה.

טובלים את הכריך בתמיסה, ומאפשרים לפעולה נימית למשוך את התמיסה. מסננים את השקופיות על מגבון קים. מלאו את השקופיות בתמיסת מכתים.

שוב, ייתכן שיהיה צורך להקיש על השקופיות כשהתמיסה זורמת פנימה כדי למנוע בועות, להניח את השקופיות בקופסת פלסטיק ולאחסן את טמפרטורת החדר בחושך. תוצאות מייצגות שהושגו עם בדיקות שונות ורקמות ארבידופסיס מוצגות כאן. האות הסגול מספק הדמיה ישירה ברזולוציה התאית של דפוס הביטוי של הגן המעניין.

פאנל A מציג את הלוקליזציה של תעתיקי יורה מלי אחד בקודקוד היורה הצמחי. שימו לב לנוכחות של אות כחול סגול בחוסר ההגדרה של המריסטם והיעדר אות בעלים שמסביב. לוחות B 2D הם קטעים של עוברים בשלב טורפדו ארבידופסיס שבהם B מראה ביטוי של קובטה שלוש בתאי גזע עובריים מעטים.

C מראה ביטוי אחד של T ML בשכבת האפידרמיס, ו-D מראה את היעדר האות בקטעים שנבדקו עם RNA בקרה שלילית אקראית. התמונות הבאות הראו תוצאות שהתקבלו עם בדיקות שונות על רקמות מבוך. פאנל E מציג את הלוקליזציה של ה-STM Humalog הקשור בעובר המבוך המתפתח.

שימו לב לאות החזק במיוחד בגזע העוברי ובקטעי האורך של השורש דרך קודקוד המצנח הצומח מראים ש-ARF שלוש A מתבטא על פני העלה התחתון הצירי בפאנל F וה-AT ML הומולוג אחד OCL ארבע מתבטא במיוחד באפידרמיס. בפאנל G.As צפוי, לא נצפה אות הכלאה עבור בדיקת הבקרה השלילית בפאנל H.התוצאות הצפויות של המחסומים השונים במהלך שעתוק בדיקות במבחנה מוצגות כאן. בדיקות ההכלאה באתרן נבדקות על ג'ל ARAZ סטנדרטי לאחר שעתוק במבחנה לאחר טיפול ב-DNA וטיהור לאחר מכן של תגובת השעתוק במבחנה לאחר הידרוליזה קרבונטית וכאשר היא מוכנה לשימוש עבור בדיקות באורך של מעל 250 זוגות בסיסים כגון בדיקה אחת, ההידרוליזה הקרבונטית תניב מגוון של שברי בדיקה קטנים יותר.

איור זה מציג את תוצאות ההסמכה הצבעונית והמטרית של בדיקות על ידי דילול ניתוח כתמי נקודות הנעים בין 10 למינוס 1 עד 10 למינוס 5 של בדיקת בקרה של 100 ננוגרם למיקרוליטר ומתוך שלושה, בדיקות חדשות עם תווית DIG נצפו על קרום העברה מודגר עם נוגדן ובדיקה נגד DIG. הניתוח מציע ריכוז משוער של 100 ננוגרם למיקרוליטר עבור בדיקה שתיים, 10 ננוגרם למיקרוליטר עבור בדיקה שלוש וננוגרם אחד למיקרוליטר עבור בדיקה 4, מה שמצביע על כך שבדיקה 4 לא צפויה להניב אות טוב להכלאה. לבסוף, קטעי אורך אלה דרך קודקוד המצנח הצמחי מ-Mace מספקים השוואה בין אות רקע לא ספציפי לבין לוח בדיקה שעובד היטב.

A מציג אות רקע לא ספציפי ואילו פאנל B מציג אות הכלאה ספציפי באתרו של שני כלאיים עבור בדיקת OC 5 בשכבת התא החיצונית. לאחר הצפייה בזה, אתה אמור להיות בעל תחושה טובה כיצד לבצע רבים מהשלבים המסובכים בפרוטוקולי ההכלאה של ההתחלה, כך שתוכל לקבוע את דפוסי הביטוי הזמניים המדויקים של בני הנוער האהובים עליך.