שיטה פשוטה עבור בידוד של סויה Protoplasts, ליישום ניתוחים ביטוי גנים ארעית

פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הכנת כמויות גדולות של סויה protoplasts ללמוד מנגנוני איתות ולניהולו מורכבים בתאים חיים.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשיג תאי פרוטופלסט באיכות גבוהה מפולי סויה כדי לבחון מנגנוני ויסות ואיתות בתאי סויה חיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח ברשתות רגולטוריות כגון מהו גן המטרה המיידי שלהם, גורם עירוי פתוח, ומהו השותף האינטראקטיבי שלהם, פתיחת חלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא אמנות.

הוא מייצר כמויות גדולות של תאי פרוטופלסט אחידים של פולי סויה, וזה פשוט וקל. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שקשה מאוד להשיג פרוטופלסטים נחמדים מעלי סויה אלא אם כן אתה מחד-עלים בשלב מסוים. בחירת העלים בשלב התפתחותי מתאים היא המפתח להכנה מוצלחת של פרוטופלסט פולי סויה.

חותכים עלים חד-עלים שהורחבו לאחרונה משתילי סויה בני 10 ימים. כדי לוודא שכאשר דגימה נותנת תשואה גבוהה של פרוטופלסט, אסוף לפחות שלוש דגימות של עלים חד-עלים בשלבי התפתחות שונים במקצת. בעזרת סכין גילוח טרי, הסר את הצלע האמצעית מכל עלה חד עלים, ולאחר מכן חתוך את השאריות לרצועות של 0.5 עד מילימטר אחד.

בעזרת זוג מלקחיים, העבירו בעדינות את רצועות העלים מיד ל -10 מיליליטר של תמיסת אנזים טרייה שהוכנה בצינור של 15 מיליליטר. ואקום חודר לרצועות העלים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. דגרו את רצועות העלים בתמיסת האנזים בתסיסה עדינה בתאורה חלשה למשך ארבע עד שש שעות בטמפרטורת החדר.

כאשר פרוטופלסטים משתחררים, תמיסת האנזים תהפוך לצבע צהוב-ירוק. בדוק את תמיסת האנזים פרוטופלסט מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 כדי לבחור את הדגימה עם עיכול הפרוטופלסט הטוב ביותר. הפרוטופלסטים המשוחררים הם כדוריים בצורתם, ואילו לתאים הלא מעוכלים יש צורות לא סדירות או סגלגלות.

כדי לעצור את העיכול, שפכו בעדינות את 10 מיליליטר תמיסת האנזים פרוטופלסט עם עיכול הפרוטופלסט הטוב ביותר לצינור של 50 מיליליטר, והוסיפו 10 מיליליטר תמיסת W5 בטמפרטורת החדר. הפוך בעדינות את הצינור כמה פעמים. לאחר מכן, שפכו בעדינות את תמיסת האנזים פרוטופלסט לרשת ניילון נקייה של 75 מיקרון המונחת על גבי צינור של 50 מיליליטר כדי להסיר את רקמות העלים הלא מעוכלות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הזרימה דרך תמיסת האנזים פרוטופלסט ב-100 פעמים G למשך דקה עד שתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי להסיר בעדינות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור הפרוטופלסט. השעו מחדש את הפרוטופלסט בתמיסת W5 מקוררת, והשאירו את צינור ה-50 מיליליטר על קרח.

לאחר ספירת מספר הפרוטופלסט על המוציטומטר תחת המיקרוסקופ, יש לדלל לריכוז של שניים כפול 10 עד החמישי פרוטופלסטים למיליליטר בתמיסת W5 מקוררת. שמור את הפרוטופלסט על קרח למשך 30 דקות. צנטריפוגה את המתלה ב 100 פעמים G למשך דקה עד שתיים בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי להסיר בעדינות את תמיסת W5 מבלי להפריע לכדור הפרוטופלסט. יש להשעות מחדש את הפרוטופלסט בתמיסת MMG בטמפרטורת החדר בריכוז של פי שניים מ-10 עד הפרוטופלסטים החמישיים למיליליטר. כדי להכין את הפרוטופלסט לטרנספורמציה, השתמש בקצות פיפטה לא חתוכות של 200 מיקרוליטר כדי ליצור 100 מיקרוליטר של פרוטופלסטים בצינורות מיקרו-צנטריפוגה עם הידבקות נמוכה של 1.5 מיליליטר.

הקדישו אליקוט אחד כדי לשמש כבקרה שלילית. לכמות הנותרת של פרוטופלסטים, הוסף 10 מיקרוליטר של DNA פלסמיד. הוסף לאט לאט 110 מיקרוליטר של תמיסת יתד טרייה שהוכנה על הקיר הפנימי של צינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן הפוך בעדינות וסובב את הצינור עד שהתמיסה הופכת הומוגנית. דגרו את תערובות הטרנספורמציה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לעצור את הטרנספורמציה, הוסף לאט 400 מיקרוליטר של תמיסת W5 לכל צינור של 1.5 מיליליטר בטמפרטורת החדר, והפוך בעדינות את הצינור עד שהתמיסה הופכת הומוגנית.

צנטריפוגה את הצינורות ב 100 פעמים G למשך דקה עד שתיים בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת WI לכל צינור.

מצפים את פני הבאר של צלחת תרבית רקמות של שש בארות כדי למנוע מהפרוטופלסטים להידבק לצלחת. הוסף מיליליטר אחד של סרום עגל סטרילי של חמישה אחוזים לכל באר, ולאחר מספר שניות, הסר את סרום העגל באמצעות פיפטה. העבירו את הפרוטופלסטים התלויים לבארות צלחת התרבות, וכסו את הצלחת במכסה.

לפני הקטיף, דגרו את הפרוטופלסטים בטמפרטורת החדר למשך יומיים בחושך. לאחר יומיים, העבירו את תמיסת הפרוטופלסט לצינור מיקרו-צנטריפוגה עם הידבקות נמוכה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינורות ב 100 פעמים G למשך דקה עד שתיים בטמפרטורת החדר.

הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה. מעבירים 10 מיקרוליטר פרוטופלסט על שקופית זכוכית. התבונן באותות פלואורסצנטיים תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או קונפוקלית באמצעות פרוטופלסטים לא מותמרים כבקרה שלילית.

תאי פרוטופלסט הוכנו מאיברים שונים של פולי סויה בני 10 ימים ונצפו תחת המיקרוסקופ. דפנות תאים מהיפוקאוד ואפיקאודלי כמעט ולא התעכלו. וחלק מהתאים נשארו מחוברים זה לזה.

בעופרת זנב ובשורש, דפנות התאים הוסרו רק בחלק קטן מהתאים. לעומת זאת, מספר רב של פרוטופלסטים נצפו כאשר נעשה שימוש בחד-עלים. השתילים בתמונה זו משמאל לימין ממחישים עלים חד-עלים שאינם מורחבים, פשוט מורחבים או מורחבים במלואם.

בעוד שגם העלים החד-עלים הלא מורחבים וגם העלים המורחבים זה עתה הביאו ליבול גבוה של פרוטופלסטים, גודלם של הפרוטופלסטים מהחד-עלים שהורחב זה עתה היה אחיד יותר מהחד-עלים הלא מורחבים. עבור החד-עלים המורחבים במלואם, דפנות התאים עדיין היו שלמות ברוב התאים. בדיקת מגוון כמויות שונות של DNA פלסמיד הצביעה על כך שכמויות גדולות יותר של DNA הביאו ליעילות טרנספורמציה גבוהה יותר.

תמונות קונפוקליות של פרוטופלסטים של פולי סויה שעברו טרנספורמציה עם המבנה המבטא GFP התמזג לגן E1 הספציפי לקטניות, הראו לוקליזציה גרעינית של חלבון ההיתוך E1 GFP, בהתאם למחקר הקודם באמצעות מערכת הפרוטופלסט של Arabidopsis. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לייעל כל תנאי ניסוי באופן אמפירי, כגון בחירת השלב הנכון של חומר העלה, אורך זמן העיכול של דופן התא, גיל הריכוז וכמות ה-DNA של הפלסמיד לטרנספורמציה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון RNA ושכפול חלבונים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו אילו גנים או אילו חלבונים מווסתים או לא מווסתים?

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג תאי פרוטופלסט סויה באיכות גבוהה.