נוירונים הדמיה בתוך חלקים במוח עבים שימוש בשיטת גולגי-קוקס

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע את ההשפעה היעילה של טיפול על המורפולוגיה של נוירונים בתוך מוח של מכרסמים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון המורפולוגיה הנורמלית והמורפולוגיה שעברה מניפולציה ניסוית של נוירונים באזורים שונים של מוח המכרסמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הגברת ההסתברות לזיהוי וויזואליזציה של נוירונים מסומנים הנמצאים במלואם בתוך דגימות היסטולוגיות בודדות.

התחילו את צביעת Golgi-Cox על ידי הנחת מוח עכבר טרי לתוך מבחנה זכוכית לסנצילציה בנפח 20 milliliter המכילה 17 milliliter של תמיסת Golgi-Cox. הגנו מאור והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 25 ימים. לאחר סיום תקופת ההדגרה, בצעו קריו-הגנה למוח על ידי הנחתו לתוך 40 milliliter של קריו-פרוטקטנט סוכרוז, והדגירו בחושך בטמפרטורה של 4 degrees celsius למשך 24 שעות.

לאחר האינקובציה בסוכרוז, ניתן להקפיא את המוח לאחסון לטווח ארוך, או לבצע חסימה (blocking) מיידית לצורך חיתוך, כפי שמוצג בחלקו הבא של הסרטון. במקרה של הקפאה, טבלו את המוח השלם ב-200 milliliters של isopentane שקולל מראש על קרח יבש. לאחר מכן, העבירו את המוח הקפוא לשפופרת קונית של 50 milliliter ואחסנו בחושך בטמפרטורה של minus 80 degrees celsius.

ראשית, הוציאו את המוח מהסוכרוז. השתמשו בלהב תער כדי לבצע חסימה (blocking) לצורך חיתוך, על ידי הסרת cerebellum, כך שיישאר קצה שטוח בחלק הקודאלי (caudal) הנותר של המוח. יש לבצע את החסימה בזווית מדויקת כדי להבטיח שהנוירונים הרלוונטיים יכילו באופן מלא בתוך הפרוסות שיתקבלו.

לדוגמה, עבור נוירונים פירמידליים בקליפת המוח, אנו משתמשים במישור קורונלי (coronal plane) הניצב באופן מוחלט לציר הרוסטרלי-קודאלי (rostral caudal axis). לאחר מכן, חממו אגר עד להמסתו, והמתינו שיתקרר עד לטמפרטורה הנמוכה במעט מנקודת ההמסה שלו.

לאחר מכן, הניחו את המוח בתוך כלי שקילה חד-פעמי קטן כאשר הקצה הזנבי (caudal) פונה כלפי מטה. הוסיפו אגר מומס עד לכיסוי המוח. לאחר שהאגר התמצק, הסִירו את העודפים כך שיישארו כ-2 עד 4 מיליליטרים מסביב למוח.

לאחר מכן, השתמש בכמות קטנה של ethyl cyanoacrylate כדי להדביק את המוח למבתו של הוויברטום (vibratome), כאשר הקצה הזנבי (caudal) פונה כלפי מטה. מלא את אזור המבמה של הוויברטום בכמות מספקת של חומר קריו-פרוטקטיבי מסוכרוז כדי לכסות את המוח. לאחר מכן, בצע חיתוכים של המוח בעובי פרוסות של 400 עד 500 microns, בהתאם לאזור המוח הנבדק.

באמצעות מכחול קטן, העבירו את חיתוכי המוח לבארות של פלטת תרבית רקמה בעלת שש בארות, הכוללת תבתי רשת בתחתית ומלאה מראש בבופר פוספט סוכרוז. הגנו מחשיפה לאור במהלך החיתוך. בסיום החיתוך, הדגירו את החיתוכים בחשיכה בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה.

באמצעות רשתות התמיכה (mesh bottom inserts), העבירו את חיתוכי המוח לבאר חדשה המכילה 5 milliliters של פאראפורמאלדהיד בבופר פוספאט. הדגירו על מכשיר ערבוב (rocker) במהירות נמוכה בטמפרטורת החדר ובחושך למשך 15 דקות. שטפו את החיתוכים פעמיים על ידי העברתם לבארות חדשות המכילות 5 milliliters של מים.

יש להגן מאור ולשטוף במהירות בינונית בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו את הנגדים לבאר חדשה המכילה 5 milliliters של ammonium hydroxide. נערו באיטיות בחושך בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.

שטפו את הנגדים פעמיים על ידי העברתם לבארות חדשות המכילות 5 mL של מים. שטפו על מכשיר rocker במהירות בינונית בחושך ובטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. העבירו את הנגדים לבאר חדשה המכילה 5 mL של מקבע A מדולל. דגרו על מכשיר rocker במהירות איטית בחושך ובטמפרטורת החדר למשך 25 דקות.

שטפו את החתכים במים פעמיים כפי שנעשה קודם לכן. השתמשו במכחול קטן כדי להניח את החתכים על תבנית מיקרוסקופ, ולאחר מכן השתמשו בפינצטה ובנייר סופג קטן כדי להסיר עודפי מים ואגר. ודאו שכל האגר הוסר לפני המעבר לשלבי ההתייבשות.

יש להניח לחתכים להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר תוך הגנה מאור. זמן הייבוש המתאים הוא קריטי, ויש לקבוע אותו עבור כל מעבדה. זמן קצר מדי עלול לגרום לנשירת החתכים מהשקופיות במהלך שלבי הדהידרציה, וזמן ארוך מדי עלול לגרום לסדקים בחתכים.

לאחר הייבוש, ראשית הניחו את השקופיות בחומר הבהרה למשך חמש דקות. העבירו את השקופיות ל-100% ethanol למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו אותן דרך סדרה של ריכוזי ethanol יורדים למשך שתי דקות בכל שלב.

לאחר סדרת האלכוהול, יש להניח את השקופיות במים למשך חמש דקות. לאחר מכן, יש לצבוע ב-0.5% cresyl violet במים למשך שבע דקות. בעקבות הצביעה ב-cresyl violet, יש להניח את השקופיות במים למשך שתי דקות.

לאחר מכן, יש לבצע דהידרטציה לחתכים באמצעות סדרה של ריכוזי אלכוהול עולים למשך שתי דקות כל אחד. לאחר מכן, יש לבצע שני שטיפות ב-100% ethanol למשך חמש דקות. יש להניח את הדגימות בחומר שקיפות (clearing agent) למשך חמש דקות.

לבסוף, הוסיפו מדיום קיבוע (mounting medium) אנחידרי והניחו זכוכית כיסוי מעל לחתכים. אפשרו לשקופיות להתייבש במצב אופקי בחושך בטמפרטורת החדר למשך חמישה ימים לפחות. כדי לצלם סדרות תמונות (image stacks) ברזולוציה גבוהה של האזור המכיל את הנוירון הרצוי, בחרו תחילה במיקרוסקופ בעדשה אובייקטיבית עם שמן סיליקון ב-30X 1.05 NA.

לאחר מכן, טפטפו שלוש עד ארבע טיפות של שמן טבילה מסיליקון על הפסלייד. מקמו את העדשה מעל הפסלייד, תוך הבטחה ליצירת מגע בין העדשה לשמן. התמקדו בתמונה וכווננו את הגדרות המצלמה, כולל החשיפה והמאזן הלבן, בתוכנת הדימיג.

בשלב הבא, הגדירו את הגבולות העליונים והתחתונים של ערימת התמונות על ידי מיקוד בחלק העליון של החתך, ולאחר מכן בחירה ב-set לצד top of stack בחלון רכישת התמונות. לאחר מכן, בצעו מיקוד בחלק התחתון של החתך, ובחרו ב-set לצד bottom of stack. הגדירו את מרחק הצעד ל-1 micron על ידי הזנת 1 micron לצד distance between images בחלון רכישת התמונות.

לבסוף, צלמו את מחזור התמונות (image stack) על ידי בחירה ב-acquire image stack בחלון רכישת התמונות. חזרו על השלבים הקודמים כדי לצלם את כל אזור העניין, תוך וידוא שכל מחזורי התמונות חופפים בלפחות 10% בצירים X ו-Y. תמונה זו של קליפת המוח (cerebral cortex) היא היטל Z ממוזג של מחזורי תמונות שנרכשו מחתך בעובי 500 micron באמצעות עדשה של 10X.

הרקמה בתמונה זו עובדה באמצעות הפרוטוקול הראשי לרקמה טרייה. האזור המסומן בריבוע אדום צולם באמצעות עדשת שיקוף עם שמן סיליקון בהגדלה של 30X, ונרכשה מחסנית תמונות של השחלה (Z projection) ממוזגת ברזולוציה גבוהה יותר. החץ האדום מראה את השחלת ה-Z הדו-ממדית של נוירון שעוקב ממחסנית התמונות ברזולוציה גבוהה של 30X.

כאן נעשה שימוש בגרסת הפרוטוקול הטריה עם צביעת cresyl violet. תמונה זו ברזולוציה גבוהה יותר מציגה את החתך הצבוע ב-cresyl violet. וזהו שרטוט הנוירונים שהתקבל.

לבסוף, רקמה זו עובדה באמצעות גרסת הפרוטוקול שבה המוחות מוקפאים לאחר צביעת Golgi-Cox. כאן ניתן לראות את הרקמה שהוקפאה קודם לכן ברזולוציה גבוהה יותר. ושוב, התקבלה השלכה דו-ממדית (Z projection) באיכות גבוהה של מעקב אחר הנוירון.

ניתן להשלים טכניקה זו בתוך חודש אחד, כאשר שלבי העיבוד והדימוג מבוצעים במהלך השבוע האחרון. לחלופין, ניתן להקפיא את המוחות לאחר הטיבעת בשיטת Golgi-Cox, מה שמאפשר להשלים את העיבוד והדימוג במועד מאוחר יותר. לאחר הליך זה, מדעני עצבים יכולים להשתמש בתמונות שצולמו כדי לבצע ניתוחים מורפולוגיים מפורטים, כגון מורכבות דנדריטים או צפיפות קוצים, כדי לקבוע כיצד מניפולציה ניסויית יכולה לשנות את מבנה הנוירונים בתוך המוח.