נוירונים הדמיה בתוך חלקים במוח עבים שימוש בשיטת גולגי-קוקס

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את הטיפול היעיל במורפולוגיה של נוירונים במוח המכרסם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון המורפולוגיה הנורמלית והמניפולטיבית הניסיונית של נוירונים באזורים שונים במוח המכרסם. לטכניקה זו יש את היתרון העיקרי של הגדלת ההסתברות לזיהוי והדמיה של נוירונים מסומנים הכלולים במלואם בתוך דגימות היסטולוגיות בודדות.

התחל לצבוע את גולגי-קוקס על ידי הנחת מוח עכבר טרי לתוך בקבוקון זכוכית של 20 מיליליטר המכיל 17 מיליליטר של תמיסת גולגי-קוקס. יש להגן מפני אור ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 25 יום. לאחר שחלפה תקופת הדגירה, Cryo מגן על המוח על ידי הכנסתו ל-40 מיליליטר של חומר סוכרוז קריופרוטקטקט, ודוגר בחושך ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

לאחר הדגירה בסוכרוז, ניתן להקפיא את המוח לאחסון לטווח ארוך, או לחסום אותו מיד לחיתוך כפי שמוצג בחלק הבא של הסרטון. אם מקפיאים, טבלו את כל המוח ב-200 מיליליטר איזופנטן שמקורר מראש על קרח יבש. לאחר מכן הניחו את המוח הקפוא בצינור חרוטי של 50 מיליליטר ואחסנו בחושך במינוס 80 מעלות צלזיוס.

כדי להתחיל, הסר את המוח מהסוכרוז. והשתמשו בסכין גילוח כדי לחסום אותו לצורך חיתוך על ידי כריתת המוח הקטן, והשארת קצה שטוח בקצה הזנב הנותר של המוח. יש לחסום את המוח בזווית מדויקת כדי להבטיח שתאי עצב מעניינים נמצאים במלואם בתוך החלקים המתקבלים.

לדוגמה, אנו משתמשים במישור עטרה הניצב לחלוטין לציר הזנב הרוסטרלי עבור נוירונים פירמידליים בקליפת המוח. לאחר מכן, מחממים אגר עד שהוא נמס. ונותנים לו להתקרר עד שהוא מעט מעל נקודת ההיתוך שלו.

לאחר מכן הניחו את המוח בכלי שקילה חד פעמי קטן כשקצה הזנב פונה כלפי מטה. מוסיפים אגר מומס כדי לכסות את המוח. לאחר שהאגר התמצק, חתוך את העודף והשאיר כשניים עד ארבעה מיליליטר המקיפים את המוח.

לאחר מכן השתמש בכמות קטנה של אתיל ציאנואקרילט כדי להדביק את המוח לשלב הוויברטום כשהקצה הזנבי שלו פונה כלפי מטה. מלאו את אזור הבמה של הוויברטום במספיק חומר סוכרוז כדי לכסות את המוח. לאחר מכן חתכו את המוח בעובי פרוסה של 400 עד 500 מיקרון בהתאם לאזור המוח שיש לבדוק.

בעזרת מברשת צבע קטנה, הניחו קטעי מוח לבארות של צלחת תרבית רקמות של שש בארות המכילה תוספות תחתונות רשת וממולאות מראש במאגר סוכרוז M פוספט. הגן מפני אור במהלך החיתוך. בסיום החיתוך, דגרו קטעים בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

בעזרת תוספות תחתית הרשת, העבירו את חלקי המוח לבאר חדשה המכילה חמישה מיליליטר של פרפורמלדהיד במאגר פוספט. דגירה על נדנדה הנעה במהירות איטית בטמפרטורת החדר בחושך למשך 15 דקות. שטפו את החלקים פעמיים על ידי העברתם לבארות חדשות המכילות חמישה מיליליטר מים.

יש להגן מפני אור ולשטוף במהירות בינונית בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו את החלקים לבאר חדשה המכילה חמישה מיליליטר אמוניום הידרוקסיד. מתנדנדים לאט בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

שטפו את החלקים פעמיים על ידי העברתם לבארות חדשות המכילות חמישה מיליליטר מים. שוטפים על נדנדה הנעה במהירות בינונית בחושך בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. העבירו את החלקים לבאר חדשה המכילה חמישה מיליליטר של קיבוע מדולל A.Incubate על נדנדה הנעה במהירות איטית בחושך בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות.

שוטפים חלקים במים פעמיים מקודם. השתמש במכחול קטן כדי להניח את החלקים על שקופית מיקרוסקופ, ולאחר מכן השתמש בפינצטה וברקמה קטנה כדי להסיר עודפי מים ואגר. ודא שכל האגר מוסר לפני שתמשיך בשלבי ההתייבשות.

הניחו לחלקים להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר מוגנים מפני אור. זמן הייבוש המתאים הוא קריטי, ויש לקבוע אותו עבור כל מעבדה. זמן קצר מדי עלול לגרום לנפילת חלקים ממגלשות במהלך שלבי התייבשות, וזמן ארוך מדי עלול לגרום לסדקים של קטעים.

לאחר הייבוש, הניחו תחילה את השקופיות בחומר ניקוי למשך חמש דקות. הניחו את השקופיות ב-100% אתנול למשך חמש דקות. לאחר מכן עברו דרך סדרה של ירידה בריכוזי האתנול למשך שתי דקות כל אחד.

לאחר סדרת האלכוהול, הניחו את המגלשות במים למשך חמש דקות. לאחר מכן מכתימים 0.5% סגול קרסיל במים למשך שבע דקות. בעקבות הכתם הסגול של הקרזיל, הניחו את השקופיות במים למשך שתי דקות.

לאחר מכן ייבשו את החלקים באמצעות סדרה של ריכוזי אלכוהול הולכים וגדלים למשך שתי דקות כל אחד. ואז שתי שטיפות באתנול 100% למשך חמש דקות. מניחים בחומר סליקה למשך חמש דקות.

לבסוף, הוסף אמצעי הרכבה נטול מים והניח החלקת כיסוי מעל החלקים. אפשר למגלשות להתייבש אופקית בחושך בטמפרטורת החדר למשך חמישה ימים לפחות. כדי ללכוד ערימות תמונות ברזולוציה גבוהה של האזור המכיל את הנוירון המעניין, בחר תחילה יעד טבילה של שמן סיליקון 30X 1.05 NA במיקרוסקופ.

לאחר מכן מרחו שלוש עד ארבע טיפות שמן טבילה מסיליקון על המגלשה. הנח את המטרה מעל המגלשה, והבטיח מגע בין המטרה לשמן. מקד את התמונה והתאם את הגדרות המצלמה כולל החשיפה ואיזון הלבן בתוכנת ההדמיה.

לאחר מכן, קבעו את הגבולות העליונים והתחתונים של אוסף התמונות באמצעות התמקדות בראש המקטע, ולאחר מכן בחירה באפשרות 'קבע ליד החלק העליון של האוסף' בחלון רכישת התמונה. לאחר מכן התמקד בתחתית המקטע ובחר קבע לצד תחתית הערימה. הגדר את מרחק הצעד למיקרון אחד על ידי הזנת מיקרון אחד ליד המרחק בין תמונות בחלון רכישת התמונה.

לבסוף, לכוד את אוסף התמונות על-ידי בחירה באפשרות Acquire Image Stack בחלון רכישת התמונות. חזור על השלבים הקודמים כדי ללכוד את כל אזור העניין, וודא שכל אוספי התמונות חופפים ב- 10% לפחות בציר X ו- Y. תמונה זו של קליפת המוח היא הקרנת Z ממוזגת של ערימות תמונות שנרכשו מקטע בעובי 500 מיקרון באמצעות מטרה של פי 10.

הרקמה בתמונה זו עובדה באמצעות הפרוטוקול העיקרי הכל טרי. האזור המצוין על ידי הריבוע האדום צולם באמצעות מטרת טבילה בשמן סיליקון פי 30 ונרכשה ערימת תמונות הקרנה Z ממוזגת ברזולוציה גבוהה יותר. החץ האדום מראה את הקרנת Z הדו-ממדית של תא עצב שאותר מערימת התמונות ברזולוציה גבוהה פי 30.

כאן נעשה שימוש בגרסת הפרוטוקול הטרייה עם צביעת סגול קרסיל. תמונה זו ברזולוציה גבוהה יותר מציגה את החלק המוכתם בסגול קרזיל. וזה מעקב הנוירונים שהושג.

לבסוף, רקמה זו עובדה באמצעות גרסת הפרוטוקול שבה מוחות מוקפאים לאחר הספגה של גולגי-קוקס. כאן נראית הרקמה שהוקפאה בעבר ברזולוציה גבוהה יותר. ושוב מתקבלת הקרנת Z דו-ממדית באיכות גבוהה של מעקב הנוירונים.

ניתן להשלים טכניקה זו תוך חודש אחד כאשר שלבי העיבוד וההדמיה הושלמו בשבוע האחרון. לחלופין, ניתן להקפיא מוחות לאחר הספגה של גולגי-קוקס, מה שמאפשר להשלים את העיבוד וההדמיה במועד מאוחר יותר. בעקבות הליך זה, מדעני מוח יכולים להשתמש בתמונות שצולמו כדי לבצע ניתוחים מורפולוגיים מפורטים כגון מורכבות דנדריטים או צפיפות עמוד השדרה על מנת לקבוע כיצד מניפולציה ניסיונית יכולה לשנות את מבנה הנוירונים בתוך המוח.