Name: ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: למדו שיטה לשליטה בביטוי ערוצי יון במערכות הטרולוגיות באמצעות טרנספקציה זמנית עם מקדם אינדוציבלי. שיטה זו מאפשרת שליטה ברמות ביטוי חלבונים ומפשטת מחקר בפרמקולוגיה של ערוצי יון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע [מענקי 1721/12, 1368/12, 1444/16 ו] (כדי AP). AP מזוהה עם Brettler מרכז ודוד ר בלום מרכז, בית הספר לרוקחות, האוניברסיטה העברית בירושלים.

<ol><li>Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Transient+Expression+of+Membrane+Proteins+in+HEK-293+Cells+for+Functional+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization.</a> Frontiers in Physiology. 7, 300(2016).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li>
<li>Xu, X., Nagarajan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+sequence+of+the+Chinese+hamster+ovary+%28CHO%29-K1+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).</li>
<li>Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pain+receptor+TRPV1+displays+agonist-dependent+activation+stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry.</a> Scientific reports. 5, 12278(2015).</li>
<li>Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+Residue+in+the+TRPV1+Vanilloid+Binding+Pocket+Regulates+Deactivation+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+induces+different+intracellular+calcium+signaling+in+CHO+K1+versus+HEK+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells.</a> Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).</li>
<li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bivalent+tarantula+toxin+activates+the+capsaicin+receptor%2C+TRPV1%2C+by+targeting+the+outer+pore+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain.</a> Cell. 141 (5), 834-845 (2010).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6270629">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflügers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+tetracycline-responsive+recombinant+protein+production+and+effect+on+cell+growth+and+ER+stress+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).</li>
<li>Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels.</a> J Vis Exp. (71), e4209(2013).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Transfection הוא פרוטוקול בשימוש נרחב עבור ביטוי חלבון ומחקר, עם וריאציות שונות כדי לשפר את עקביות ביטוי ויציבות. ריאגנטים transfection החולפים מציעים פשוט, קל לשימוש פרוטוקול שבו התא לחלבון של עניין ניתן לנתח בתוך שעות הלילה מהרגע של transfection. למרבה הצער גישה זו יכולה להיות בלתי צפויה כאשר אמצעי ניתוח דורש רמה עקבית של ביטוי חלבון, כגון קלטות ערוץ יחידות ב אלקטרופיזיולוגיה 2. לחלופין, שורות תאים יציבות תחת מערכת ביטוי repressible טטרציקלין פותחו כדי לה...

Heterologously להביע מערכות היא אחת הטכניקות המקובלות ביותר ללמוד מספר רב של פונקציות הסלולר 1. פרופיל חלבון אנדוגני הנמוך שלהם, דרישות תחזוקה מינימאליות, צמיחה אמינה, והיכולת תופסת ולהביע דנ&quot;א זר הפכו שורות תאים כגון כליה העוברית האנושי (HEK293) וסינית אוגר שחלה (CHO) כמעט חיונית למחקר ביולוגי 2, 3. תחומי מחקר באמצעות מערכות Heterologous כוללים חלבונים בממברנה, איתות תאית, ואת פעילות האנזימטית. בעקבות transfection של דנ&quot;א זר לתוך התא, צורות שונות של ניתוח יכול להתבצע, לרבות אלקטרופיזיולוגיה, הדמיה סידן ratiometric, כתם המערבי, וכו &#39;4, 5. בשל המגוון הרחב של יישומים פוטנציאליים למערכות ביטוי Heterologous, differe רבריאגנטים ומוצרים NT פותחו לנצל תאים אלה והאיכויות שלהם -6. מערכות משלוח דנ&quot;א זמני או לצמיתות לשלב דנ&quot;א זר לתאים ללמוד חלבון אקסוגני הפך לאחד הכלים הפופולריים ביותר ושימושי למחקר ביולוגי. באופן ספציפי יותר, זמני DNA transfecting לתא נעשה שימוש נרחב כתהליך פשוט, ישר קדימה הדורש מעט זמן יחסית וחומרים. יתר על כן, שיעור תאי ההצלחה לעבור transfection הוא גבוה 7. טכניקה זו היא מאוד אמינה כאשר הוא משולב עם גן סמן כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), וניתן להשתמש בו עבור טכניקות שונות כגון הדמית סידן אלקטרופיזיולוגיה 5. למרבה הצער, אם כי, זמני להביע דנ&quot;א לתוך תאי מארחים מגיע עם כמה מלכודות גדולות, לא כהוא זה כי רמת הביטוי לכל תא אינה מהימנה. מספר העותקים של ה- DNA פלסמיד נלקח up לכל תא הוא בלתי נשלט, ולכן הביטוי בין ניסויים בודדים יכול להשתנות במידה רבה 2. סוגיה זו מקבלת משמעותי כאשר אחד מנסה לשכפל מצבים פיזיולוגיים, או ביצוע טכניקות אוסף נתונים מדויקים. כפתרון הסיבוכים הנ&quot;ל, פרוטוקולי transfection יציבים עוצבו שבו גן של עניין יכול להיות מוכנס לתוך הגנום של תא תחת הפיקוח ההדוק של אמרגן מושרה, כגון מערכת ביטוי המדכא טטרציקלין, הבטחה יחידה עותק של פלסמיד משתלב בגנום של כל תא ובא לידי ביטוי רק לאחר גיוס של מנגנון שעתוק, למשל, בנוכחות דוקסיציקלין. אמנם זה פותר את המכשולים של רמות ביטוי חלבון עולות בקנה אחד, שיטה זו מאבדת את הנוחות של פרוטוקול מהיר ויחסית פשוט של transfections חולף. הקמת קו תאים יציבות לוקח לפחות כמה שבועות which יש לכייל עקומת הרג שקבע אנטיביוטיקה ספציפית כדי לשמור על ביטוי החלבון ולהבטיח שילוב של וקטור ובמיומנות לבחור ולגדול מושבות תאים. בסך הכל זה לוקח הרבה יותר זמן ומאמץ עם שיעור הצלחה נמוך 8. הנה, אנחנו מציגים פרוטוקול ביניים שמושך על נקודות החוזק של שתי אפשרויות transfection הפופולריות לספק דרך פשוטה ויעילה לשלוט ברמות ביטוי בכל שורת תאים מושרה. תוך שמירת תאים עם מערכת ט מושרה, אנו transfect הגן שלנו זמני של עניין, ערוץ קטיון פוטנציאל חלוף קולטן V subfamily חבר 1 (TRPV1), ligated לתוך וקטור כי ניתן לשלב homologously עם המערכת המדכאת. בדרך זו, הגן יכול להיות מוחדר לתאים ללא מתחילים להביע. רק עם התוספת של דוקסיציקלין אין הגן מתחיל להביע, מה שמאפשר לנו לכייל את רמות expr החלבוןession פי הטכניקה או הרמות שנצפו בתנאים פיסיולוגיים. הפרוטוקול שלנו גם ימנע סיבוכים ארוכים לפריסת יצירת קו תא להביע ביציבות. אנחנו מתחילים על ידי הצגת הרמות המשתנות של הפעלת TRPV1 בתחום הדמית סידן בלתי להתהוות מתוך ארבע שעות של אינדוקציה ואיך עליית רמות סידן תאי בקורלציה. לאחר מכן, אנו לשכפל את פרוטוקול בתצורת התא כולו של הטכניקה מהדק תיקון, מראה הזרם הגובר עם הגדלת זמן של אינדוקציה. לבסוף, אנו מציגים דוגמאות של קלטות אלקטרופיזיולוגיה ערוץ אחד, ונראה כי טכניקה זו שימושית במיוחד עבור ביטוי מבוקר כאשר מחפשים אוסף נתונים מדויק על בסיס של יחידת פרט של החלבון. באמצעות הפרוטוקול שלנו, אנו מציעים דרך נוחה לשלוט ביטוי חלבון במערכות Heterologous תוך הימנעות סיבוכי תרבית תאים ממושכים, ובכך לספק דרך לשלוט בתנאים בין ניסויים ולספק מומחדש תוצאות לשכפול.

<table><tbody><tr><td>pcDNA וסחר; 4/TO וקטור ביטוי יונקים</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102020</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA &trade; 5 / TO וקטור ביטוי יונקים</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V103320</td><td></td></tr><tr><td>PureLink ערכת טיהור PCR מהירה</td><td>Invitrogen</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>Swift & trade; &nbsp; MaxPro Thermal Cycler</td><td>Esco&nbsp;</td>אנזימי הגבלה <td>n.a</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ER0501</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PureLink ערכת מיצוי ג'ל מהירה</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>One Shot&reg; TOP10 מוכשר כימית E. coli</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>C404006&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין (נתרן),</td><td>ביו זהב</td><td>A-301-5</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון למיקרוביולוגיה</td> בדרגת USP <td>Merck</td><td>6.19305E+13</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>BD ברחבי העולם</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>SIF6000R שייקר מודגר</td><td>LAB COMPANION</td><td>45H118</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin&reg; פלסמיד</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>MS 300V ספק כוח</td><td>מדע עיקרי</td><td>MP-300V</td><td></td></tr><tr><td>ינשוף וסחר; EasyCast ומסחר; מערכת אלקטרופורזה מיני ג'ל B1A</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>T-REx &trade;-293 קו תאים</td><td>Invitrogen</td><td>R710-07</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x), נוזלי (גלוקוז גבוה)</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF&reg;</td><td>NEB</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>ApaI</td><td>NEB</td><td>R0114S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart&reg; מאגר</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA ומסחר; 6/TR&nbsp; וקטור ביטוי יונקים</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102520</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS), מוסמך, מאושר על ידי האיחוד האירופי, שמקורו בדרום אמריקה</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1 מ ')</td> <td>תעשיות ביולוגיות</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanyl-L-Glutamine (יציב גלוטמין) (200 מ"מ)</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>03-022-1B</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&trade; 150i CO2 Incubator</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>51026406</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage&trade; ארון בטיחות ביולוגי Class II</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidine S hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) מעובד, ללא סידן כלוריד ומגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8537-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>כפול נויבאואר נשלט המציטומטר מתכתי</td><td>Hausser Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת</td><td>בינוני Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TransIT&reg;- LT1 Transfection Reagent</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית, עובי #1, קוטר 12 מ"מ</td><td>עגול Knittel Glass</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>BioCoat&trade; פולי-D-ליזין (PDL)</td> <td>קורנינג</td><td>354210</td><td></td></tr><tr>מים, <td>תעשיות ביולוגיות</td><td>בדרגת תרבית תאים</td><td>03-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין היקלאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM ester</td><td>Biotium</td><td>BTM-50034</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&reg; F-127</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-שקופית 8 היטב</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>(E)-קפסאיצין</td><td>טוקריס</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס IX70 מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>אולימפוס</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4 מחליף אורך גל</td><td>Sutter Instruments</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>EXi כחול פלואורסצנטי מיקרוסקופיה מצלמה</td><td>QImaging</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>MetaFluor פלואורסצנטי יחס הדמיה תוכנה</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בורוסיליקט דקים קירות</td><td>סאטר מכשירים</td><td>B150-110-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>סטנדרטי קירות בורוסיליקט צינורות</td><td>סאטר מכשירים</td><td>B150-86-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד נטול מים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>P1000 חולץ מיקרופיפטה</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MF-900 Microforge</td><td>NARISHIGE</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>ValveBank מערכת זלוף</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata&reg; 1440A מערכת רכישת נתונים עם רעש נמוך</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B מגבר</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.6 תוכנה</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>מכשירי סאטר</td><td>MP-225</td><td></td></tr></tbody></table>

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות transfection ועין מתנהל חלוף

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, המסירה של חומצות גרעין זרים לתא, הוא כלי רב עוצמה במחקר חלבון. באמצעות שיטה זו, ניתן לחקור תעלות יונים באמצעות ניתוח אלקטרו, אפיון ביוכימי, מחקרים מוטאציות, והשפעתם על תהליכים תאיים. transfections חלוף להציע פרוטוקול פשוט שבו החלבון הופך המנותחת תוך מספר שעות עד ימים. אמנם שיטה זו מציגה פרוטוקול יחסי פשוט זמן יעיל, אחד המרכיבים הקריטיים הוא לכיול הביטוי של הגן של ריבית לרמות נהוגות פיסיולוגיות רלוונטיות או רמות שאינן מתאימים לניתוח. לשם כך, גישות שונות רבות המציעות את היכולת לשלוט על הביטוי של הגן של עניין צמחו. מספר פרוטוקולי התא transfection היציבים לספק דרך להציג גן של עניין לצמיתות לגנום התא תחת הרגולציה של transcrip טטרציקלין שבשליטההפעלה תזונתית. אמנם שיטה זו מייצרת רמות ביטוי אמינות, כל גן של עניין דורש כמה שבועות של עבודה המיומנת כולל כיול עקום הרג, בחירה של מושבות תאים, ובסך הכילו יותר משאבים. כאן אנו מציגים פרוטוקול המשתמשת transfection חולף של V subfamily ערוץ קטיון פוטנציאל חלוף קולטן חבר 1 (TRPV1) גנים מערכת מושרה כדרך יעילה להביע חלבון באופן מבוקר שהוא חיוני בניתוח ערוץ יון. אנו מראים כי באמצעות טכניקה זו, אנו מסוגלים לבצע הדמיה סידן, התא כולו, וניתוח ערוץ אחד עם רמות ערוץ נשלט הנדרש לכל סוג של איסוף נתונים עם transfection יחיד. בסך הכל, זה מספק טכניקה לשכפול, שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את המבנה תעלות יונים ותפקוד.

כדי ליצור במהירות מודל ביטוי מושרה, עשינו שימוש HEK293 תאי מבטאי חלבון טטרציקלין מדכא (TR) (למשל, T-REX-293) ו וקטורים המכילים רצפים מפעילים טטרציקלין (TETO) בין אמרגן CMV ואת אתר השיבוט המרובה (למשל, pcDNA4 / TO). כאשר transfected לתאי Trex-293, הביטוי של הגן של עניין pcDNA4 / TO שמודחק, כמו TR נקשר TETO. הוספת דוקסיציקלין למדיום מונע אינטראקציה TR-TETO, ובכך מאפשר את הביטוי של חלבון transfected. כדי לשלוט על הבעת TRPV1 חולדה (rT...

תעלות יוני לימוד באמצעות מערכת להביע heterologously הפכו טכניקת ליבה במחקר ביו. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה יעילה זמן כדי להשיג ביטוי ערוץ יון תחת פיקוח הדוק על ידי ביצוע transfection חולף בשליטת האמרגן מושרה.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק דרך נוחה לשלוט בביטוי של תעלות יונים במערכות הטרולוגיות תוך הימנעות מסיבוכים של תרביות תאים ממושכות. בכך מסופקת דרך לשלוט בתנאים בין ניסויים וליצור תוצאות הניתנות לשחזור רב יותר. שיטה זו יכולה לסייע בקידום המחקר בתחום תעלות היונים.כגון אפיון תכונות של תעלים בפרמקולוגיה. מכיוון שהשיטות הנוכחיות הן מורכבות או מראות ביטוי חלבון לא עקבי, היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת להגיע לרמות ביטוי מבוקרות של מגוון רחב של חלבונים המותאמים לניסויים בודדים בפרק זמן קצר יחסית.כדי להתחיל בהליך זה, העבירו תאי TREX 293 לפלטת 12 בארות שהוכנה עם 0.9 milliliters של DMEM מלא לכל בארה, כדי להגיע ל-50 אחוזי התמסכות (confluency). דגרו את התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתוך אינקובטור CO2. לאחר מכן, הכינו תערובת טרנספקציה המורכבת מ-DMEM, הגן המבוקש, המופיע כאן, TRPV1, פלסמיד אינרטי וחומר טרנספקציה ליפידי.עבור ניסויי אלקטרופיזיולוגיה, יש להוסיף EGFP בפלסמיד ביטוי לממליאנים לתערובת הטרנספקציה כדי לאפשר ויזואליזציה של התאים שעברו טרנספקציה בהצלחה. דגרו את תערובת הטרנספקציה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, בצעו טרנספקציה לתאים על ידי הוספה בטיפות של תערובת הטרנספקציה על התאים בלוחית 12 הבארים.נערה את הפלטה בחוזקה כדי להבטיח פיזור הומוגני של ה-DNA ותססוֹר הטרנספקציה. לאחר מכן, דגרו את התאים שעברו טרנספקציה למשך לילה בטמפרטורה של 27 °C. למחרת בבוקר, במידה ומבצעים אלקטרופיזיולוגיה, ודאו שהתאים עברו טרנספקציה בהצלחה על ידי צפייה באות הפלואורסצנציה של EGFP תחת מנורת UV.אם מבצעים אלקטרופיזיולוגיה, העבירו את התאים מהפלטה בעלת 12 הבארים לכיסויות זכוכית (cover slips) מצופות PDL ב-500 microliters של DMEM מלא. אם מבצעים דימוי סידן, טפטפו כ-20,000 תאים לתאי דימוי סידן מצופים PDL. בהליך זה, הכינו תמיסת מלאי של doxycycline בריכוז של one milligram per milliliter במים מזוקקים פעמיים.שמרו את תמיסת המלאי ממרחב אור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד שלושה שבועות. לאחסון לטווח ארוך, שמרו את תמיסת המלאי של ה-doxycycline בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו תמיסת doxycycline טרייה ב-DMEM מלא.חממו את התמיסה ל-37 °C. עבור רישומים אלקטרופיזיולוגיים, העבירו בפיפטה 500 µL של תמיסת doxycycline בריכוז של 2 µg/mL לכל באר, כדי להגיע לריכוז סופי של doxycycline של 1 µg/mL. עבור דימוי סידן, הוסיפו 100 µL של תמיסת doxycycline בריכוז של 3 µg/mL לכל באר, כדי להגיע לריכוז סופי של doxycycline של 1 µg/mL.דגרו את הדגימה למשך זמן האינדוקציה הרצוי ב-37 °C ו-5% CO2. כדי לנטר את ביטוי החלבון באמצעות דימוי סידן, הכינו תמיסת Ringer וחממו אותה ל-37 °C. כדי לסייע בפיזור של אסטרי AM, שהם אינדיקטורים פלואורסצנטיים ליונים, כגון Fura-2 בתמיסות מימיות, הכינו תמיסה של F-127 לא-יוני ב-DMSO.חממו את התמיסה ל-27 °C עד להמסה של ה-F-127 הבלתי-יוני. לאחר מכן, אחסנו את תמיסת ה-F-127 הבלתי-יוני בטמפרטורת החדר וחממו אותה שוב ל-37 °C לפני השימוש. לאחר מכן, הכינו תמיסת טעינה של Fura-2 AM מתמיסת רינגר (Ringer's solution), בתוספת 2 עד 3 µM של Fura-2 AM, 0.2 mg/mL של F-127 בלתי-יוני, ו-10 mM של D-glucose.לאחר מכן, שאבו את המצע מהתאים בתאים (chambers) והחליפו אותו בתמיסת טעינה של Fura-2 AM. דגרו את התאים למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה. לאחר מכן, שאבו את תמיסת ה-Fura-2 AM.יש לשטוף את התאים עם תמיסת Ringer's ו-10 millimolar D-glucose כדי להסיר צבע חוץ-תאי. השאירו 200 microliters של תמיסת Ringer's ו-10 millimolar D-glucose בכל מבחנה. לאחר מכן, הדגרימו את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.לאחר 30 דקות, הנח את התא על הבמה מעל ראש המיקרוסקופ, ואבטח אותו בעזרת מחזיק. לאחר מכן, חשב והכן ריכוז עבודה של האגוניסט הספציפי ל-TRPV1, קפסאיצין (capsaicin), בהתאם לריכוז הסופי הרצוי. בשלב הבא, הדלק את המנורה, המצלמה והמיקרוסקופ, ובחר במסנן Fura-2 כדי לזהות פליטה באורך גל של 510 nanometer.כווננו להגדלה הרצויה ומקדו את התאים בשדה הנבחר על ידי מניפולציה של פרמטרים אלה באמצעות כפתורי המיקרוסקופ. בתנאי חושך, בצעו חיסור של אור הרקע והגדירו את זמן החשיפה. הגדירו את קצב דגימת התמונות לפי הקצב הרצוי.לאחר מכן, התחילו בתיעוד תגובת הפלואורסצנציה של תאים הטעונים ב-Fura-2 על ידי עירור באורכי גל של 340 nanometer ו-380 nanometer. היחס בין אותות 340 ל-380 מהווה מדד לריכוז הסידן התוך-תאי, ולפיכך גם לפעילות של TRPV1. לאחר מכן, הוסיפו 2 micromolar capsaicin ב-200 microliters של תמיסת Ringer's כדי ליצור ריכוז רוויה סופי של 1 micromolar capsaicin, במטרה להעריך את רמת הביטוי של TRPV1 ולנתח את התגובה של TRPV1.כדי לקבוע את זמן ההשראה האידיאלי להקלטה של תעלה בודדת, הכינו תחילה את תמיסות האמבט והפיפטה. לאחר מכן הכינו פיפטות זכוכית, שעברו ליטוש באש להתנגדות של 10 עד 12 megaohms. בצעו patch clamp של התא כולו על ידי יצירת אטימה על ממברנה של התא המטרה.בשלב הבא, הגדירו את פוטנציאל השמירה ל-40- millivolts. לאחר מכן, קרעו את הממברנה על ידי הפעלת לחץ שלילי. לאחר מכן, בעזרת המיקרו-מניפולטור, הרימו את הפיפט עם פיסת הממברנה הרחק מהתא.לאחר מכן, מקם את מערכת הפרפוזיה בסמיכות ישירה לפיפט המכיל את רقعת הממברנה. הנמך את מסנן Bessel ואת הגבר הפלט ל-2 עד 5 kHz ול-10 amps בהתאמה. לאחר מכן, בצע פרפוזיה של ריכוזי רוויה של אגוניסט על רقعת הממברנה.לאחר מכן, נתחו את מספר הPATCH-ים של ערוץ בודד שהוקלטו בהצלחה אל מול זמן האינדוקציה שהופעל על התאים, והתאימו את זמן האינדוקציה בהתאם לתוצאות הרצויות. מוצגות כאן תמונות בצבעי פסאודו של תאי TREX 293 המבטאים באופן זמני RTRPV1, לפני ואחרי יישום של capsaicin. וכאן מוצגים השינויים התואמים ברמות הסידן התוך-תאי לאורך זמן בתאי TREX 293 שעברו טרנספקציה וטיפול.כל גרף מייצג ממוצע של 50 תאים. שיעור ההצלחה של patch בערוץ יחיד בהקלטות TRPV1 תלוי בזמן ההשראה. להלן עקומות זרם של patches מתאי TREX 293 המבטאים באופן זמני את ה-RTRPV1 לאחר שעתיים וארבע שעות של השראה.תרשים זה מתאר את מספר התעלות בטלאי (patch) לאחר זמן ההשראה המצוין. טכניקה זו יכולה לספק לנו ניתוח של חלבון עם ביטוי מבוקר בתוך 12 שעות מהטרנספקציה, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להגדיר רמות סטנדרטיות של ריכוזי הטרנספקציה וזמן ההשראה עבור חלבונים שונים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק מערכת ביטוי ניתנת לבקרה באופן יעיל מבחינת זמן עבור היון לבחירתכם.

controllable-ion-channel-expression-through-inducible-transient

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

אנו מדגימים כיצד ללמוד את ההשפעה של מוטציה נקודה אחת על התפקוד של ערוץ יון.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

מקור: ברנס, ס. ואחרים. יישום מערכת ביטוי אינדוקטיבי לחקר התערבות של גורמי אלימות חיידקיים עם איתות תוך-תאי. J. Vis. Exp. (2015)הסרטון הזה מדגים את השימוש במערכת ביטוי אינדוקסיבית לזיהוי היכן חלבון האפקטור החיידקי CaeB משבש את מפל האפופטוטיה של המארח. הוא מפרט את השלבים להעברת תאים מבטאים CaeB למערכת מגיבה לטטרציקלין כדי לעורר ביטוי גנים פרו-אפופטוטי, במטרה לזהות את נקודת ההפרעה בתוך המפל.

טרנספקציה של מערכת ביטוי גנים מושרה לתאים המבטאים חלבון אפקטור חיידקי

סרטון זה מתאר את השיטה של ויסות ביטוי גנים בתאים בתרבית על ידי טרנספקציה עם פלסמיד המכיל גן מעניין ופלסמיד רגולטורי. הביטוי של פלסמיד זה יכול להיות נשלט על ידי טטרציקלין או אנלוגים סינתטיים שלה, מה שהופך את המערכת הזאת מודל שימושי ללמוד ביטוי גנים מוסדר.

Inducible Tet-Off Regulatable System: שיטה במבחנה לווסת ביטוי גנים בתאים בתרבית באמצעות מערכת טטרציקלין-אוף

השיטה המתוארת כאן משמשת לגרימת מפל האיתות האפופטוטי בשלבים מוגדרים על מנת לנתח את הפעילות של חלבון אפקטור חיידקי אנטי-אפופטוטי. שיטה זו יכולה לשמש גם לביטוי השראה של חלבונים פרו-אפופטוטיים או רעילים, או לניתוח הפרעות עם מסלולי איתות אחרים.

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

הפרעות בקצב לב בירושה לעתים קרובות נגרמים על ידי מוטציות המשנות את מסירת השטח של תעלות יונים אחד או יותר. הנה, אנחנו מתאימים זרימת cytometry מבחני לספק כימות של ביטוי החלבון הכולל ותא יחסית משטח של תעלות יונים רקומביננטי לידי ביטוי בתאים TSA-201.

קביעת פני התא יחסית והביטוי סה&quot;כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

מערכות Nonlytic ביטוי תא חרקים הם מנוצלים לייצור, סחר / לוקליזציה הסלולר, וניתוח פונקציונלי חלבון רקומביננטי. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת וקטורי ביטוי והבעת חלבון חולפת עוקבת בשורות תא פרפראים זמינות מסחרי. שיתוף הלוקליזציה של aquaporins tabaci Bemisia עם חלבונים בסמן פלורסנטי התת-תאי מוצגת גם.

ביטוי חולף ואת סלולר לוקליזציה של חלבונים רקומביננטי תאים בתרבית חרקים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור אפנון הביטוי transgene באמצעות מתג יחיד ג'ין pEUI(+) על ידי טיפול tebufenozide.

Ecdysone המבוסס על קולטן מיוחד במינו ג'ין מתג עבור הביטוי מכוון של Transgene עם חוסן, הפיכות Leakiness זניח

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפתח מערכת inducible דומיננטה-שלילי, שבו כל חלבון יכול להיות מותנה מומת על ידי הפיכה overexpressing גרסה מוטציה דומיננטית-שלילי של זה.

עיכוב חלבונים inducible והפיך דומיננטי שלילי (DN)

מחקר זה מתאר שיטה לניסויים בתפוקה גבוהה באמצעות מערך LED מודפס בתלת מימד כדי לייעל את ביטוי הגנים המושרה באור בתאי HEK293T.

אופטימיזציה מהירה של מערכת השראת אור לשליטה בביטוי גנים של יונקים

למדו שיטה לשליטה בביטוי ערוצי יון במערכות הטרולוגיות באמצעות טרנספקציה זמנית עם מקדם אינדוציבלי. שיטה זו מאפשרת שליטה ברמות ביטוי חלבונים ומפשטת מחקר בפרמקולוגיה של ערוצי יון.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

גלה סרטונים נוספים