ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק דרך נוחה לשלוט בביטוי תעלות יונים במערכות הטרולוגיות תוך הימנעות מסיבוכים ממושכים של תרבית תאים. ובכך מספק דרך לשלוט בתנאים בין ניסויים ולהפיק תוצאות ניתנות לשכפול יותר. שיטה זו יכולה לסייע בהקלת המחקר בתחום תעלת היונים.

כגון אפיון תכונות הערוץ בפרמקולוגיה. מכיוון שהשיטות הנוכחיות מורכבות או מראות ביטוי חלבון לא עקבי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים להגיע לרמות ביטוי מבוקרות של מגוון רחב של חלבונים המותאמים לניסויים בודדים תוך זמן קצר יחסית.

כדי להתחיל בהליך זה, העבר תאי TREX 293 לצלחת של 12 בארות שהוכנה עם 0.9 מיליליטר של DMEM מלא לבאר ליצירת מפגש של 50 אחוז. ודגרו על התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור CO2. לאחר מכן, הכינו תערובת טרנספקציה המורכבת מ-DMEM, הגן המעניין, המוצג כאן, TRPV1, פלסמיד אינרטי ומגיב העברת השומנים.

עבור ניסויים אלקטרופיזיולוגיים, כלול EGFP בפלסמיד ביטוי יונקים בקוקטייל הטרנספקציה על מנת לדמיין את התאים שעוברים בהצלחה טרנספקציה. דגרו את תערובת הטרנספקציה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את התאים על ידי פיפטינג של תערובת הטרנספקציה בטיפה על התאים המצופים בצלחת 12 הבארות.

נדנד את הצלחת במרץ כדי להבטיח פיזור הומוגני של DNA ומגיב טרנספקציה. לאחר מכן, דגרו על התאים שעברו טרנספטקט למשך הלילה בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, אם מבצעים אלקטרופיזיולוגיה, ודא שהתאים עברו בהצלחה על ידי התבוננות באות הפלואורסצנטי של EGFP מתחת למנורת UV.

אם מבצעים אלקטרופיזיולוגיה, העבירו תאים מצלחת 12 הבאר להחלקות כיסוי מצופות PDL ב-500 מיקרוליטר של DMEM מלא. אם מבצעים הדמיית סידן, אתר כ-20,000 תאים לתאי הדמיית סידן מצופים PDL. בהליך זה, הכינו תמיסת מלאי דוקסיציקלין במיליגרם אחד למיליליטר במים מזוקקים כפולים.

הגן על תמיסת המלאי מפני אור בארבע מעלות צלזיוס למשך עד שלושה שבועות. לאחסון לטווח ארוך, שמור את תמיסת מלאי הדוקסיציקלין בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו תמיסת דוקסיציקלין טרייה ב-DMEM מלא.

ולחמם אותו ל -37 מעלות צלזיוס. לרישומים אלקטרופיזיולוגיים, פיפטה 500 מיקרוליטר של תמיסת דוקסיציקלין בשני מיקרוגרם למיליליטר לכל באר כדי ליצור ריכוז סופי של דוקסיציקלין במיקרוגרם אחד למיליליטר. להדמיית סידן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת דוקסיציקלין בשלושה מיקרוגרם למיליליטר לכל באר כדי ליצור ריכוז סופי של דוקסיציקלין במיקרוגרם אחד למיליליטר.

דגרו את הדגימה למשך הזמן הרצוי לאינדוקציה ב-37 מעלות צלזיוס, וחמישה אחוזי CO2. כדי לכייל את ביטוי החלבון באמצעות הדמיית סידן, הכינו את התמיסה של רינגר וחממו אותה ל-37 מעלות צלזיוס. כדי לסייע בפיזור אסטרי AM, מחווני יונים זורמים, כגון Fura-2 בפתרונות מימיים, מכינים תמיסה של F-127 לא יוני ב-DMSO.

מחממים את התמיסה ל -27 מעלות צלזיוס עד להמסת ה- F-127 הלא יוני. לאחר מכן אחסן את תמיסת ה-F-127 הלא יונית בטמפרטורת החדר וחמם אותה שוב ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. לאחר מכן, הכינו תמיסת העמסה של Fura-2 AM מתמיסת ה-Ringer, בתוספת שניים עד שלושה מיקרו-מולרי Fura-2 AM, 02 מיליגרם למיליליטר F-127 לא יוני ו-10 מילי-מולרי D-גלוקוז.

לאחר מכן שאפו את המדיום מהתאים בתאים והחליפו אותו בתמיסת טעינה Fura-2 AM. דגרו את התאים למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, שאפו את תמיסת Fura-2 AM.

ושטפו את התאים בתמיסת רינגר ו-10 מילי-מולרית D-גלוקוז כדי להסיר צבע תאי עודף. השאירו 200 מיקרוליטר של תמיסת רינגר ו-10 מילי-מולרית D-גלוקוז בכל אחד. ודגרו אותו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.

לאחר 30 דקות, הנח את החדר על הבמה מעל חתיכת האף של המיקרוסקופ, ואבטח אותו עם המחזיק. לאחר מכן חשב והכין ריכוז עבודה של הקפסאיזין האגוניסטי הספציפי ל-TRPV1 בהתאם לריכוז הרצוי הסופי. לאחר מכן, הפעל את המנורה, המצלמה והמיקרוסקופ, ובחר במסנן Fura-2 כדי לזהות פליטה באורך גל של 510 ננומטר.

התאם להגדלה הרצויה ומקד את התאים בשדה הנבחר על ידי מניפולציה של פרמטרים אלה באמצעות כפתורי המיקרוסקופ. בחושך, הפחיתו את אור הרקע והגדירו את זמן החשיפה. הגדר דגימת תמונה בקצב הרצוי.

לאחר מכן, התחל ברישום תגובת הקרינה של תאים טעוני Fura-2 על ידי ריגושם באורכי גל של 340 ננומטר ו-380 ננומטר. היחס בין 340 ל-380 אותות הוא אינדיקטור לריכוז הסידן התוך תאי ובכך גם לפעילות TRPV1. לאחר מכן, הוסף שני קפסאיצין מיקרומולרי ב-200 מיקרוליטר של תמיסת רינגר כדי ליצור ריכוז רוויה סופי של קפסאיצין מיקרומולרי אחד על מנת להעריך את רמת הביטוי של TRPV1 ולנתח את תגובת TRPV1.

כדי לקבוע את זמן האינדוקציה האידיאלי להקלטת ערוץ יחיד, הכינו תחילה את האמבטיה ואת פתרונות הפיפטה. לאחר מכן הכינו כמה פיפטות זכוכית, מלוטשות באש להתנגדות של 10 עד 12 מגה-אוהם. בצע מהדק תיקון תא שלם על ידי יצירת אטימה על הממברנה של התא הממוקד.

לאחר מכן, הגדר את פוטנציאל ההחזקה ל-40 מילי-וולט שלילי. ולקרוע את הממברנה על ידי הפעלת לחץ שלילי. לאחר מכן, באמצעות המיקרומניפולטור, הרם את הפיפטה עם מדבקת המבראן הרחק מהתא.

לאחר מכן מקם את מערכת השפע ישירות ליד הפיפטה המכילה את תיקון הממברנה. הורד את מסנן Bessel ואת רווח הפלט לשניים עד חמישה killahurtz ו-10 אמפר בהתאמה. לאחר מכן, יש להעשיר את ריכוזי הרוויה של אגוניסט על מדבקת הממברנה.

לאחר מכן נתח את מספר תיקוני הערוץ הבודד שנרשמו בהצלחה כנגד זמן האינדוקציה המופעל על התאים והתאם את זמן האינדוקציה בהתאם לתוצאות הרצויות. מוצגות כאן תמונות פסאודו-צבעוניות של תאי TREX 293 המבטאים באופן חולף RTRPV1, לפני ואחרי יישום קפסאיצין. והנה השינויים המתאימים ברמות הסידן התוך תאיות עם הזמן בתאי TREX 293 המטופלים והעוברים טרנספטציה.

כל גרף מייצג בממוצע 50 תאים. שיעור ההצלחה של תיקון ערוץ יחיד בהקלטות TRPV1, תלוי בזמן האינדוקציה. להלן העקבות הנוכחיים של טלאים מתאי TREX 293 המבטאים באופן זמני את RTRPV1 לאחר שעתיים וארבע שעות של אינדוקציה.

ועלילה זו מתארת את מספר הערוצים בתיקון לאחר זמן האינדוקציה המצוין. טכניקה זו, יכולה לתת לנו ניתוח של חלבון עם ביטוי מבוקר תוך 12 שעות מרגע הטרנספקציה אם היא מבוצעת כראוי. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור לתקן את ריכוזי הטרנספקציה וזמן האינדוקציה עבור חלבונים שונים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר מערכת ביטוי הניתנת לשליטה בצורה יעילה בזמן עבור יון לבחירתך.