פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של Clostridium difficile בתגובה לטיפול אנטיביוטי

המטרה הכוללת של שיטת הדמיה מיקרוביולוגית זו היא לספק אמצעי תיאורי יותר להבחין בהשפעות הפנוטיפיות של טיפול תרופתי. אז השיטה הזו באמת יכולה לעזור בתחום המחלות הזיהומיות. באופן ספציפי מסתכל על ההשפעות המורפולוגיות של אנטיביוטיקה מסוימת וכיצד היא הורגת את C.Difficile.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת הדמיה ברזולוציה גבוהה עם טכניקות תרבית תאים במבחנה כדי לספק מבט מפורט על פעולת ההרג התרופתי. ההשלכות של טכניקה זו עשויות להתרחב לטיפול בזיהום קלוסטרידיום דיפיצילה, או בקיצור CDI. הסיבה היא שטכניקה זו עשויה לספק אמצעי לזיהוי כיצד אנטיביוטיקה עשויה להועיל בטיפול ב-CDI.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי פעולה פרמקולוגית, ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות, כגון מודל תרבית מעורבת או מחקרים בבעלי חיים. בדרך כלל, אנשים נאבקים בשיטה חדשה זו מכיוון שגידול C.difficile והפעלת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק הוא מאתגר. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כשניסינו להבחין בין אופני פעולה שונים של אנטיביוטיקה.

ברצוני להציג בפניכם את צוות המחקר שתפגשו היום. ג'האנגיר עלאם הוא פרופסור ומיקרוביולוג. הוא מתאם את כל פעילויות המעבדה שתראו היום.

תסנובה ראשיד היא סטודנטית לתואר שני במעבדה. היא עוסקת הרבה במיקרוביולוגיה היומיומית. יוג'יני באסר היא פוסט-דוקטורנטית.

היא באמת לימדה את טסנובה הרבה מהמיומנויות וגם מסייעת במעבדה. בראד אנדרס הוא פוסט-דוקטורנט נוסף במעבדה. הוא יעשה הרבה מיקרוסקופיה בעזרת לונג צ'אנג.

כדי להכין מבודדי סביבה תוך לבישת כפפות סטריליות, השתמש בגזה כותנה מעוקרת מראש כדי לספוג את פני השטח של כל אזור עניין, כגון רצפה, דלת, ידית או מדף. לאחר מכן הכניסו את הספוגית לצינור מעוקר. החלף כפפות בין דגימות.

כדי להכין מבודדים קליניים, השתמש בלולאת חיסון כדי להצמיד 10 עד 100 מיליגרם של דגימות צואה קליניות על אגר פרוקטוז ציקלוסרין, או CCFA, ולהחדיר את הדגימות בתנאים אנאירוביים מחמירים למשך 48 עד 72 שעות. אחסן מושבות מבודדות של מלאי C.Difficile בבקבוקוני קריו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לניתוחים נוספים. העשירו את דגימות המקלון הסביבתי בעירוי לב למוח, או מרק BHI, עם 05% נתרן טאורוכולט והניחו את הדגימות בתא אנאירובי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים.

צנטריפוגה מיליליטר אחד של התרבית ב -10,000 פעמים G, והשתמש ב -100 מיקרוליטר אתנול כדי להשעות מחדש את הגלולה. צלחת 50 מיקרוליטר של התאים התלויים מחדש על לוחות CCFA ודגירה על התרביות בתא אנאירובי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 עד 48 שעות. אחסן את המושבות המבודדות של מלאי C.difficile בבקבוקוני קריו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לניתוחים נוספים.

השתמש במגיב אגלוטינציה לטקס, או PCR, כדי לבדוק את המושבות החשודות ל- C.difficile. גדל זני C.difficile סביבתיים או קליניים מטוהרים על צלחות אגר דם בתא אנאירובי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. השתמש בלולאת חיסון כדי לקחת מושבה מבודדת אחת ולהעביר אותה לחמישה מיליליטר של מדיום BHI בצינור של 15 מיליליטר.

לאחר מכן יש לגדל את התרבות בתא אנאירובי בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. שימוש ב-BHIS טרי ומופחת מראש בתוספת נתרן טאורוכולט והריכוז המתאים של אנטיביוטיקה כדי לדלל את התרביות המוקדמות מ-1 עד 100 עד כ-10 עד ה-CFU השישי למיליליטר. בעזרת פיפטה, אספו דגימה של מיליליטר אחד בכל נקודת זמן וצלחת או פזרו מנה קטנה על צלחת אגר דם.

דגרו את הצלחת למשך 48 שעות בתא אנאירובי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וספרו את מספר המושבות המתקבלות כדי לקבוע את ה-CFUs. אסוף מיליליטר אחד של תאים מכל נקודת זמן בצינורות מיקרו-צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-10,000 פעמים G למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשתמשו ב-PBS כדי לשטוף את התאים.

סובב שוב את הדגימות והשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן השתמש במיליליטר אחד של 4% פרפורמלדהיד כדי לדלל מחדש את התאים ולדגור את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר סיבוב הדגימות שוב והשלכת הסופרנטנט, השתמשו במים מזוקקים כדי לשטוף את התאים פעמיים לפני דילול התאים מחדש ב-100 מיקרוליטר מים מזוקקים.

התאם את עוצמת הקול בהתאם לעכירות התמיסה. לאחר תיוג תלושי הכיסוי, הוסף עליהם 40 מיקרוליטר מהדגימה. מתחת למכסה המנוע, דגרו את החלקות הכיסוי למשך 15 דקות כדי לאדות את הנוזל ולאפשר לתאים להיצמד לזכוכית.

אם עדיין קיים נוזל, השתמש במפוח כדי להסיר אותו. הנח את החלקות הכיסוי במכונת התזת שולחן והדביק אותם כלפי מטה. אבטח זהב טהור במכונת ההתזה.

לאחר מכן הפעל את המכונה והתחל לקרטע בלחץ נמוך. מצפים את התאים למשך 30 שניות ב-80 מיקרו-אמפר, מה שמתורגם ל-20 ננומטר של ציפוי זהב. כדי להתחיל בהדמיה, תחילה אוורר את ה-SEM כראוי בתוכנת המחשב על ידי לחיצה על כפתור האוורור.

לאחר ציפוי התאים, העבירו אותם למיקרוסקופ האלקטרונים הסורק, או SEM. בעזרת סרט הפחמן, אבטח את הכיסוי המצופה מחליק על שלב המתכת. לאחר אוורור ה- SEM, הדלת אמורה להיפתח בקלות.

נעל את שלב המתכת בתא ה- SEM על ידי הברגתו פנימה. לאחר מכן, לחץ על כפתור המשאבה בתוכנה. כאשר המערכת תקרא בחזרה בסדר, ה-SEM יהיה מוכן לשימוש.

בלשונית הגלאי, לחץ על גלאי SE. הפעל את הקורה על ידי לחיצה על הכפתור המציג את המתח. התחל לצלם במתח נמוך יותר לפני הגדלת המתח.

תמונה תופיע לאחר הפעלת האלומה. באמצעות פונקציית המעקב, מצא אזור על הכיסוי המצופה מחליק לתמונה. התקרב לאזור ומצא מבנים בצורת מוט, המייצגים את Clostridium difficile.

כדי לכייל את המערכת, התקרב, מקד את התמונה בגסות וקשר את Z למרחק העבודה החופשי. זה צריך להיעשות במרחקי עבודה מרובים, כגון ב-15, 9 ו-5 מילימטרים. לאחר מכן עבור למצב הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד.

השתמש במתגי המיקוד הגס והעדין כדי להתחיל להתמקד בהגדלה גבוהה. כוונן את מתגי האסטיגמציה לקבלת תמונה ברורה יותר, ובדוק את בהירות התמונה באמצעות תוכנת המחשב כדי להגדיל את התמונה. השתמש בסריקה האיטית כדי לאסוף תמונה באיכות גבוהה.

שמור את התמונה שנאספה כקובץ tiff לניתוח מאוחר יותר, כדי להבטיח שסרגל הנתונים נבחר אם יבוצעו מדידות במהלך הניתוח. אסוף תמונות בזוויות שונות כדי לחשוף מידע עומק נוסף על ידי הטיית הבמה ב-SEM. מטב את המיקוד והאסטיגמציה לפני איסוף תמונת סריקה איטית.

לאחר השלמת ההדמיה, כבה את הקרן והעלה את מרחק העבודה ל -20 מילימטרים. ואז אוורור את החדר והסר את הבמה. עבד את התמונות, פתח את קבצי התמונה בפיג'י.

באמצעות פונקציית הקו, עקוב במדויק אחר סרגל קנה המידה. לחץ על הכרטיסייה ניתוח; ולאחר מכן בחר את הפונקציה Select Scale. יופיע חלון שידרוש הגדרת מרחק ידוע על סמך סרגל קנה המידה.

שנה גם את יחידת האורך ולחץ על אישור. לבסוף, כדי למדוד את אורך התא, השתמש בפונקציית הקו כדי לעקוב אחר התא בשלמותו. בחר שוב בכרטיסייה ניתוח ולאחר מכן לחץ על מדידה.

האורך אמור להופיע ביחידות שצוינו קודם לכן. תמונות אלה מציגות תאים וגטטיביים של C.difficile שנלכדו במהלך השלב האקספוננציאלי של עקומת הגדילה, כמו גם תאי נבגים. תאים צמחיים הם מבנים ארוכים, חלקים, בצורת מוט; ואילו נבגים הם מבנים סגלגלים קטנים בעלי מראה חיצוני מחוספס.

כפי שמוצג באיור הזה, תאי הבקרה גדלים ומגיעים למישור; ואילו התאים שטופלו באנטיביוטיקה ונקומיצין ומטרונידזול יורדים בסך ה-CFUs עד לגבול הזיהוי, מה שמעיד על השפעה חיידקית. כפי שהודגם, ונקומיצין ומטרונידזול יעילים בהריגת C.difficile בריכוזי סופר MIC. כדי להדגים את התועלת של שימוש ב-SEM להדמיית C.difficile, תאים צולמו לפני ואחרי טיפול תרופתי כדי לקבוע כיצד המורפולוגיה השתנתה.

במקרה של ונקומיצין, חלק מדפנות התאים נפגעו וחלק מהתאים שטופלו במטרונידזול היו קטנים יותר בגודלם. כדי לבדוק אם גודל התא הושפע, נותח אורך התא באמצעות התוכנית פיג'י. כפי שמודגם בתמונה זו, גודל התא הצמחי יכול להשתנות במידה מסוימת במקרה הביקורת; אבל רובם באורך של כ-6 מיקרומטר.

עם זאת, כפי שמוצג בגרף זה, אורך התא הושפע בתאים שטופלו במטרונידזול, אך לא בתאים שטופלו בוונקומיצין. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מיומיים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהדגימה שלך קבועה ויבשה לחלוטין לפני ציפוי והדמיה.

בעקבות הליך זה, אנו יכולים לבצע שיטות נוספות כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד חיידקים יגיבו לטיפולים אנטיביוטיים; וזה יכול לתת לנו תובנה נוספת להבנת מכניקת הפעולה של אנטיביוטיקה, למשל. לטכניקה זו יש פוטנציאל עצום ועשויה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה לחקור עוד יותר את הפיזיולוגיה והפרמקולוגיה ב-Clostridium difficile. אני מקווה שנהניתם לצפות בסרטון הזה היום.

אני מקווה שמה שהרווחת מזה הוא איך לגדל ולאפיין תאי קלוסטרידיום דיפיצילה, איך להסתכל על קינטיקה הורגת של אנטיביוטיקה נגד קלוסטרידיום דיפיצילה, ואז איך להעריך את השינויים המורפולוגיים הקשורים לדפוסי ההרג האלה באמצעות מיקרוסקופיה ברמה גבוהה. בזמן שאנו עובדים עם קלוסטרידיום דיפיצילה, עלינו לנקוט באמצעי זהירות נוספים ולהשתמש בכל אמצעי ההגנה