Name: פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של Clostridium difficile בתגובה לטיפול אנטיביוטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: למדו שיטת מיקרוסקופיה אלקטרונית לסריקה כדי לאפיין שינויים מורפולוגיים ב-Clostridium difficile בתגובה לאנטיביוטיקה. טכניקה זו משלבת הדמיה ברזולוציה גבוהה עם שיטות תרבית תאים לחקירת מנגנוני פעולה תרופתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ניסויים אלה נתמכו על ידי מענקי מחקר מ-Merck and Co. ו-Summit, PLC.

1. בידוד C. difficile ממקורות סביבתיים או קליניים שונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד סביבתי: שימוש במדד כותנה טרום מעוקרים (רטוב קלות עם 0.85% NaCl), ספוג את פני השטח של כל תחום עניין (קומה, דלת, ידית, מדף וכו &#39; ). 8 הקפד ללבוש כפפות סטריליות במקום ספוגית צינור מעוקר לאחר השלמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבודד קליני (שרפרף): צלחת 10 עד 100 מ&quot;ג של דגימות צואה קלינית על cefoxitin-cycloserine-fructose אגר (CCFA) באמצעות לולאה חיסון ו דגירה בתנאים אנאירוביים מחמירים עבור 48 - 72 שעות. חנות מושבות מבודדות של מניות C. difficile cryovials ב -80 מעלות צלזיוס לניתוחים נוספים. 7 , 9 , 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעשיר את דגימות ספוגית הסביבה במוח הלב עירוי (BHI) מרק עם 0.05% taurocholate נתרן מקום בחדר אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוסבמשך 5 ימים. צנטריפוגה 1 מ&quot;ל של התרבות ב XG 10,000 ו resuspend גלולה μL 100 של אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים resuspended (50 μL) על cycloserinecefoxitin אגר fructose (CCFA) צלחות דגירה בחדר אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40 - 48 שעות. חנות מושבות מבודדות של מניות C. difficile cryovials ב -80 מעלות צלזיוס לניתוחים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחן חשודים מושבות C. difficile באמצעות מגיב לטקס לטקס או PCR. </li></ol> 2. Culturing C. difficile והרג תהליכים קינטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול מטוהרים סביבתיים או קליניים C. זנים difficile על צלחות אגר דם בחדר אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מושבה בודדת אחת עם לולאה חיסון, להעביר אותו 5 בינוני מ&quot;ל BHI בצינור 15 מ&quot;ל, ולגדול במשך 24 שעות בתא אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תרבויות מראש 1: 100 עד כ 10 6 מושבה להרכיב יחידהS (CFU) / מ&quot;ל ​​ב BHIS טריים מופחת מראש (BHI בתוספת 5 גרם / L תמצית שמרים 1% L- ציסטאין) בתוספת 0.1% נתרן taurocholate ואת הריכוז המתאים של אנטיביוטיקה (T0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף מדגם 1 מ&quot;ל עם פיפטה בכל נקודת זמן (T0, T6, T24, T48) ו צלחת / להפיץ aliquot קטן (100 μL בדילול סדרתי) על צלחת אגר דם. בואו התאים לגדול על צלחת אגר דם במשך 48 שעות בתא אנאירובית ב 37 ° C ולספור את מספר המתקבל של מושבות לקבוע CFU. </li></ol> הכנת דוגמאות עבור סריקת מיקרוסקופית אלקטרונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 1 מ&quot;ל של תאים מנקודת זמן בכל צינורות microcentrifuge ו צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 10 דקות. מחק את supernatant תאים לשטוף PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות ב XG 10,000 במשך 10 דקות שוב להשליך supernatant. מחדש לדלל תאים 1 מ&quot;ל של paraformaldehyde 4% ו דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות שוב 10 דקות ב 10,000 xg וזורקים supernatant. לשטוף תאים פעמיים עם מים מזוקקים ו redillute ב 100 μL של מים מזוקקים. התאם את עוצמת הקול בהתאם עכירות של הפתרון. הערה: ביצוע דילולים סדרתי מרובים הוא רעיון טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית coverslips ולהוסיף 40 μL של המדגם על זה. לדגור במשך 15 דקות במנוע הזרימה להתאדות הנוזל ולאפשר לתאים לדבוק coverslip. אם הנוזל עדיין קיים, השתמשו במפוח כדי להסיר את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslips שכותרתו עם תאים בשולחן מכונת המקרטעת ואת הקלטת למטה. זהב טהור מאובטח במכונה המקרטעת. הפעל את המכונה והתחל לדהור בלחץ נמוך (50 mTorr). תאים מעיל עבור 30 s ב 80 mA, אשר מתרגמת 20 ננומטר של ציפוי זהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים מצופים אל מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. </li></ol> 4. הדמיה ג תאים difficile על מיקרוסקופ אלקטרונים סורק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כראוי על ידי יחסי ציבורEssing את לחצן הפתיחה על תוכנת המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קלטת פחמן, מאובטח coverslips מצופה על במת מתכת. לאחר SEM הוא פרקו, הדלת צריכה לפתוח בקלות. נעל את הבמה המתכת לתוך תא SEM ידי דופק אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן PUMP בתוכנת המחשב. SEM יהיה שמיש כאשר המערכת קוראת &quot;אישור OK&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על גלאי SE תחת הכרטיסייה גלאים. הפעל את הקורה על ידי לחיצה על הלחצן המציג את המתח. התחל הדמיה במתח נמוך (5 קילו וולט) לפני המתח הגובר (עד 15 קילו וולט). תמונה תופיע לאחר שהקורה מופעלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פונקציית המעקב, למצוא שטח על coverslips מצופה לתמונה. זום לתוך האזור ולמצוא מבנים בצורת מוט; אלה הם clustridium difficile . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקרב והתמקד בתמונה כדי לכייל את המערכת. זה צריך להיעשות במרחקים עבודה מרובות: 15, 9 ו - 5 מ&quot;מ. תמונה במרחק עבודה של 5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ULtra מצב הדמיה ברזולוציה גבוהה ולהתחיל להתמקד לייעל אסטיגמציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל להתמקד בהגדלה גבוהה. השתמש להתמקד גס עדין עבור זה. התאם אסטיגמציה גם כדי לקבל תמונה ברורה יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם אסטיגמציה בהגדלה גבוהה. כדי לעשות זאת, להתאים את אסטיגמטיזם מחליף (הם נראים דומים קנס / להתמקד מחוספס להתמקד) ולבדוק את התמונה לבהירות דיגיטלית על ידי התקרבות על תוכנת המחשב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Se את פונקציית סריקה איטית לאסוף תמונה באיכות גבוהה. שמור את התמונה שנאספה כקובץ TIFF, שישמש לניתוח. ודא את שורת הנתונים נבחרה אם המדידות ייעשה במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תמונות בזוויות שונות (עד 52 ° על ידי הפיכת באופן ידני את הזווית ישירות על SEM. תמונות זווית נוטים לחשוף מידע עומק יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מתח קרן בהתאם לתאים כי הם הדמיה. שמור את זה בעיקר בין 5-15 kV לכל הניסויים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההדמיה הושלמה, להפוך את קרן ולהעלות את המרחק עובד 20 מ&quot;מ. החדר יכול אז להיות vented ואת הבמה ניתן להסיר. להעתיק את כל התמונות על הכונן לניתוח נוסף. </li></ol> 5. עיבוד תמונה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד והתקן את התוכנה הזמינה באופן חופשי, FIJI (http://fiji.sc), אל המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ התמונה ב- FIJI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פונקציית הקו, עקוב בדיוק אחר סרגל הסולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכרטיסייה ניתוח בתוכנית FIJI ולבסוף לבחור את הפונקציה בחר סולם. יופיע חלון שיידרש את הגדרת המרחק הידוע בהתבסס על סרגל הסולם. לשנות את יחידת אורך גם כן ולחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו כי התוכנית מכויל למרחק, להשתמש בפונקציה הקו למדוד אורך התא. כדי להשיג את אורך, להשתמש בפונקציה הקו כדי לעקוב אחר התא בשלמותו. בחר שוב בכרטיסייה ניתוח ולאחר מכן לחץ על מדידה. אורך צריך Appהאוזן ביחידות שצוין קודם לכן. </li></ol>

<ol><li>Lessa, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+infection+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile infection in the United States.</a> N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).</li>
<li>Vickers, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ridinilazole%3A+a+novel+therapy+for+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection.</a> Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+update+on+emerging+antibiotic+treatment+options+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).</li>
<li>Ambrose, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+EMA+guideline+for+antimicrobial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">New EMA guideline for antimicrobial development.</a> Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).</li>
<li>Bassères, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+imaging+the+pharmacological+effects+of+antibiotic+treatment+on+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile.</a> Anaerobe. 40, 10-14 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+Effects+of+Surotomycin+Treatment+on+Clostridium+difficile+Toxin+A+and+B+Production%2C+Immune+Response%2C+and+Morphological+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).</li>
<li>Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+potentially+pathogenic+Clostridium+difficile+contamination+in+household+environs%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs.</a> Anaerobe. 27, 31-33 (2014).</li>
<li>Aitken, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+Endemic+Setting%2C+Clostridium+difficile+Ribotype+027+Is+Virulent+But+Not+Hypervirulent%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Control+Hosp+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).</li>
<li>Basseres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapse+of+antibiotic+associated+colitis%3A+endogenous+persistence+of+Clostridium+difficile+during+vancomycin+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy.</a> Gut. 24 (3), 206-212 (1983).</li>
<li>Chilton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+oritavancin+on+Clostridium+difficile+spore+germination%2C+outgrowth+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery.</a> J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).</li>
<li>Ofosu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+a+review+of+current+and+emerging+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies.</a> Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).</li>
<li>McDonald, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidemic%2C+toxin+gene-variant+strain+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng+J+Med%22%5BJournal%5D)">An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile.</a> New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).</li>
</ol>

KWG קיבלה תמיכה במחקר בעבר ובהווה מ-Merck & Co. ו-Summit, PLC.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה ליצור שיטת תפוקה גבוהה לבידוד C. difficile ובדיקת רגישות אנטיביוטית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כאמצעי לאפיון יסודי יותר של הפעולה הפרמקולוגית של האנטיביוטיקה. באמצעות הפרוטוקולים המפורטים כאן, הוכחנו כי הדמיה התגובה הפנוטיפית של התא לטיפול אנטיביוטי יכול לחשוף תובנה הפעולה הפרמקולוגית של התרופה. בסך הכל, החלק הדמיה של פרוטוקול זה לוקח בערך 2 שעות משך לאחר איסוף התאים, אבל יכול להיות הרבה יותר מפלה מאשר הרג טיפוסי מחקרים קינטיים לבד. בעו...

Clostridium difficile הוא חיידק החיידק החיידקי , הגורם לגרימת כ -500,000 זיהומים בשנה בארה&quot;ב ונחשב לאיום פתולוגי דחוף לאיום על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC), רמת הסיכון הגבוהה ביותר. 1 בעשור האחרון חלה התפתחות משמעותית של תרופות במיקרוביאלים עם פעילות נגד C. difficile . 2 , 3 במבחנה הלימודים הם מרכיב הכרחי של תהליך הפיתוח של התרופה. 4 באופן מסורתי, רגישות במבחנה והזמן להרוג מחקרים משמשים כדי לאמת בעתיד חיה ואחרים במחקר vivo . בעוד ששיטות אלה משמשות תפקיד חשוב בהערכת פעולת הריגה, הן אינן קולטות את התגובה הפנוטיפית של התאים לטיפול תרופתי. על ידי שילוב מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) עם standarD הריגת מחקרים קינטיים, אפיון יסודי יותר של ההשפעות הישירות של אנטיביוטיקה אפשרי. 5 , 6 , 7 כאן, אנו מציגים שיטה שבה SEM משמש כאמצעי פרופיל פרופיל היעילות של טיפול אנטיביוטי.

<table><tbody><tr><td>גזה כותנה&nbsp;</td><td>טיפול</td><td>PRM21408C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron</td><td>7532</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות 50 מ"ל</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>עירוי לב למוח (BHI)&nbsp;</td><td>קריטריון</td><td>C5141</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>אלפא Aesar</td><td>A10389</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>קריטריון</td><td>C741</td><td></td></tr><tr><td>נתרן טאורוכולט</td><td>אלפא Aesar</td><td>A18346</td><td></td></tr><tr><td>תא אנאירובי</td><td>קוי</td><td></td><td>ויניל תא אנאירובי</td></tr><tr><td>ציקלוסרינצפוקסיטין פרוקטוז אגר (CCFA) לוחות</td><td>אנאירוב מערכות אנאירוביות</td><td>AS-213</td><td></td></tr><tr><td>צלחות אגר דם</td><td>אבחון הארדי</td><td>A-10</td><td></td></tr><tr><td>מגיב לטקס אגלוטינציה</td><td>אוקסואיד</td><td>DR1107A</td><td>C. diff ערכת בדיקה</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>222363204</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-259-98</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>ג'יי מלווין משוחרר מותג</td><td>7525M</td><td>75 x 25 מ"מ</td></tr><tr><td>מכסה זרימה</td><td>Labconco</td><td>Class II סוג A2&nbsp;</td><td>ארון בטיחות ביולוגית</td></tr><tr><td>מכונת מקרטע שולחן</td><td>דנטון ואקום</td><td>שולחן II</td><td></td></tr><tr><td>קלטת</td><td>פלסטיק ליבת</td><td>05072-AB</td><td>SPI דבק דו צדדי סרט פחמן</td></tr><tr><td>זהב</td><td>דנטון ואקום</td><td>TAR001-0158</td><td>2.375 אינץ' קוטר x 0.002 אינץ' רדיד זהב עבה</td></tr><tr><td>סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>FEI</td><td>XL-30</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של<em&gt; clostridium difficile</em&gt; בתגובה לטיפול אנטיביוטי

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

הערכה של פעילות אנטיביוטית עם פיתוח תרופות חדשות מכוונת נגד חיידקים אנאירוביים קשה ותובענית מבחינה טכנית. כדי לקבל תובנה אפשרי MOA, שינויים מורפולוגיים הקשורים לחשיפה אנטיביוטיקה ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). שילוב הדמיה SEM עם עקומות להרוג מסורתיים עשוי לשפר את התובנה שלנו לתוך הפעולה סמים לקדם את תהליך הפיתוח של התרופה. כדי לבדוק את הנחת היסוד, להרוג עקומות ומחקרים SEM בוצעו באמצעות תרופות עם ידוע אך שונה MOA (vancomycin ו metronidazole). ג תאים difficile (R20291) גדלו עם או ללא נוכחות של אנטיביוטיקה עד 48 שעות. במהלך 48 שעות המרווח, תאים נאספו בנקודות זמן מרובות כדי לקבוע יעילות אנטיביוטיקה עבור הדמיה על SEM. בהתאם לדו&quot;חות קודמים, vancomycin ו- metronidazole היו בעלי פעילות חיידקית משמעותית לאחר 24 שעות של טיפול, כפי שנמדד על ידי היחידה להרכיב מושבות (CFU)טינג. באמצעות הדמיה SEM קבענו כי metronidazole היו השפעות משמעותיות על אורך התא (&gt; ירידה של 50% באורך התא עבור כל אנטיביוטיקה, P &lt;0.05) לעומת בקרים ו ונקומיצין. בעוד התגובה הפנוטיפית לטיפול תרופתי לא תועדה בעבר באופן זה, הם עולים בקנה אחד עם MOA של התרופה המדגימה את הרבגוניות והאמינות של ההדמיה והמדידות ואת היישום של טכניקה זו עבור תרכובות ניסיוניות אחרות.

Clostridium difficile הוא חיידק להרכיב נבג ולכן חשוב לקבוע את ההבדלים מורפולוגיה בין תאים צמחיים ו נבג לפני ניתוח פונקציונלי. איור 1 מציג תמונות מייצגות של תאים צמחיים שנתפסו במהלך השלב המעריכי של עקומת הצמיחה ותאי נבג. כפי שמתואר, תאים צמחיים הם מבנים ארוכים, חלקה, בצורת מוט, ואילו נבגים הם מבנים קטנים, סגלגל בעל החיצוני מחוספס. מבחינה תפקודית, תאים צמחיים לגדול ולהתחלק במהירות אחראים על ארסיות של זיהומים C.<...

יעילות האנטיביוטיקה נקבעת לרוב על ידי ביצוע מחקרים קינטיים להרג ומדידת יחידות יוצרות מושבה (CFUs). על ידי שילוב מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) עם שיטות סטנדרטיות אלה, אנו יכולים להבחין בין ההשפעות הפרמקולוגיות של הטיפול בין אנטיביוטיקות שונות.

פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; בתגובה לטיפול אנטיביוטי

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

המטרה הכללית של שיטת הדימיון המיקרוביולוגית הזו היא לספק אמצעי תיאורי יותר להבחנה בין ההשפעות הפנוטיפיות של טיפול פרמקולוגי. לפיכך, שיטה זו יכולה לסייע רבות בתחום של מחלות זיהומיות. באופן ספציפי, היא בוחנת את ההשפעות המורפולוגיות של אנטיביוטיקות מסוימות וכיצד הן הורגות את *C. difficile*.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת דימוי ברזולוציה גבוהה עם טכניקות של תרבית תאים in vitro כדי לספק מבט מפורט על פעולת ההריגה התרופתית. המשמעות של טכניקה זו עשויה להתרחב לטיפול בזיהום Clostridium difficile, או CDI בקיצור. הסיבה לכך היא שטכניקה זו עשויה לספק אמצעי לזיהוי האופן שבו אנטיביוטיקה עשויה להועיל בטיפול ב-CDI.אף ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי פעולה פרמקולוגית, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון מודל של תרבית מעורבת או מחקרי חיות in vivo. באופן כללי, אנשים מתקשים עם שיטה חדשה זו מכיוון שגידול C.difficile והפעלה של מיקרוסקופ אלקטרוני סורק הם מאתגרים. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר ניסינו להבחין בין מודוסים שונים של פעולה של אנטיביוטיקה.ברצוני להציג בפניכם את צוות המחקר שבו תפגשו היום. ג'הנגיר עלם (Jahangir Alam) הוא פרופסור ומיקרוביולוג. הוא מתאם את כל פעילויות המעבדה שתראו היום.טסנובה רשיד היא סטודנטית לתארים מתקדמים במעבדה. היא מבצעת חלק ניכר מהעבודה המיקרוביולוגית השוטפת. אוז'ני בסרה היא עמיתת פוסט-דוקטורט.היא באמת לימדה את Tasnuva רבות מהמיומנויות וכן מסייעת במעבדה. Brad Endres הוא פוסט-דוקטורט נוסף במעבדה. הוא יבצע מיקרוסקופיה רבה בעזרתו של Long Chang.להכנת בידודים מהסביבה תוך כדי חבישה בכפפות סטריליות, השתמשו בגזה מכותנה שעברה סטריליזציה כדי לסלוף את פני השטח של כל אזור רלוונטי, כגון רצפה, דלת, ידית או מדף. לאחר מכן, העבירו את הסלוף לתוך מבחנה סטרילית. החליפו כפפות בין דגימה לדגימה.להכנת בידודים קליניים, השתמשו בלולאת תסביב להעברה של 10 עד 100 מיליגרם של דגימות צואה קליניות על מצע אגר צפוקסיטין ציקלוסרין פרוקטוז (cefoxitin cycloserine fructose agar, CCFA), והדגרימו את הדגימות בתנאים אנאירוביים קפדניים למשך 48 עד 72 שעות. שמרו מושבות מבודדות של מלאי C. difficile בבקבוקי קריו (cryo vials) בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לצורך אנליזות המשך. העשירו את דגימות הסווחיים הסביבתיות במצע BHI (brain heart infusion broth) בתוספת 0.5% נתרק טאורוכולאת (sodium taurocholate), והניחו את הדגימות בתא אנאירובי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים.סובב במהירות של 10,000 ×g מיליליטר אחד של התרבית, והשתמש ב-100 µL אתנול כדי להשעות מחדש את המשקע. זרע 50 µL מהתאים שהושעו מחדש על מצעי CCFA והדגר את התרביות בתא אנאירובי בטמפרטורה של 37 °C למשך 40 עד 48 שעות. שמור את המושבות המבודדות של C.difficile במבחנות קריו בטמפרטורה של 80- °C לצורך אנליזות המשך.השתמשו בריאגנט לאגלוטינציה של לטקס, או ב-PCR, כדי לבדוק את מושבות ה-C.difficile החשודות. גדלו זני C.difficile סביבתיים או קליניים מטוהרים על צלחות אגר דם בתא אנאירובי בטמפרטורה של 37 °C למשך 48 שעות. השתמשו בלולאת הזרקה כדי לקחת מושבה בודדת אחת ולהעבירה ל-5 mL של מצע BHI בשפופרת של 15 mL.לאחר מכן, גדלו את התרבית בתא אנאירובי בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 24 שעות. השתמשו במצע BHIS טרי ומחזר מראש, מועשר ב-sodium taurocholate ובריכוז המתאים של אנטיביוטיקה, כדי לדלל את תרביות המקור ביחס של 1 ל-100, עד לריכוז של כ-10 to the sixth CFU ל-milliliter. בעזרת פיפטה, אספו דגימה של one milliliter בכל נקודת זמן, והעבירו או פזרו מנה קטנה על צלחת blood agar.דגרו את הפלטה למשך 48 שעות בתא אנאירובי בטמפרטורה של 37 °C וספרו את מספר המושבות שהתקבלו כדי לקבוע את ה-CFUs. אספו מיליליטר אחד של תאים מכל נקודת זמן לתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 10,000 ×g למשך 10 דקות. השליכו את העילם והשתמשו ב-PBS כדי לשטוף את התאים.סובבו את הדגימות שוב והסילו את הנוזל העליון. לאחר מכן, השתמשו ב-1 ml של 4% paraformaldehyde כדי לדלל מחדש את התאים והדגירו את המבחנות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר סבוב נוסף של הדגימות והסלת הנוזל העליון, שטפו את התאים פעמיים במים מזוקקים לפני דילולם מחדש ב-100 µl של מים מזוקקים.כווננו את הנפח בהתאם לעכירות התמיסה. לאחר סימון לוחות הכיסוי, הוסיפו עליהם 40 µL מהדגימה. תחת מטאלימנר (flow hood), הדגירו את לוחות הכיסוי למשך 15 דקות כדי לאפשר לנוזל להתאדות ולתאים להיצמד לזכוכית.אם עדיין קיים נוזל, השתמשו במנשב אוויר כדי להסיר אותו. הניחו את כיסויי הזכוכית במכשיר התססור (sputtering machine) לשולחן והדביקו אותם עם סרט דביק. אבטחו זהב טהור במכשיר התססור.לאחר מכן, הדליקו את המכשיר והתחילו את תהליך ההשפריצה (sputtering) בלחץ נמוך. צפו את התאים למשך 30 שניות בזרם של 80 microamperes, דבר המתרגם לכיסוי זהב בעובי של 20 nanometers. כדי להתחיל בדימות, פתחו תחילה את ה-SEM כראוי בתוכנת המחשב על ידי לחיצה על כפתור ה-Vent.לאחר ציפוי התאים, העבירו אותם למיקרוסקופ אלקטרונים סורק, או SEM. בעזרת סרט פחמן, קבעו את הזריסות הבעטויות על גבי הבמה המתכתית. ברגע שחלה אוורור ב-SEM, הדלת תיפתח בקלות.נעלו את הבמה המתכתית בתוך תא ה-SEM על ידי הברגה. לאחר מכן, לחצו על כפתור ה-Pump בתוכנה. כאשר המערכת תחזיר אישור תקינות, ה-SEM יהיה מוכן לשימוש.בלשונית ה-Detector, לחצו על גלאי ה-SE. הפעילו את הקרן על ידי לחיצה על הכפתור המציג את המתח. התחילו את הדמיון במתח נמוך לפני העלאת המתח.תמונה תופיע לאחר הפעלת הקרן. בעזרת פונקציית המעקב (tracking), מצא אזור להדמיה על פני כיסורי הזכוכית המצופים. בצע זום לאזור ומצא מבנים בצורת מוט, המייצגים את Clostridium difficile.כדי לכלול את המערכת, בצעו זום פנימה, התמקדו באופן גס בתמונה וקשרו את ציר ה-Z למרחק העבודה החופשי. יש לבצע זאת במספר מרחקי עבודה, כגון 15, 9 ו-5 מילימטרים. לאחר מכן, עברו למצב דימוי ברזולוציה גבוהה במיוחד.השתמשו במגשרי המיקוד הגס והעדין כדי להתחיל למקד בהגדלה גבוהה. כווננו את מגשרי האסטיגמטיזם לקבלת תמונה ברורה יותר, ובדקו את בהירות התמונה באמצעות תוכנת המחשב כדי לבצע זום דיגיטלי על התמונה. השתמשו בסריקה איטית כדי לאסוף תמונה באיכות גבוהה.שמרו את התמונה שנאספה כקובץ tiff לצורך ניתוח מאוחר יותר, וודאו שסרגל הנתונים (data bar) נבחר אם יבוצעו מדידות במהלך הניתוח. אספו תמונות מזוויות שונות כדי לחשוף מידע רב יותר על העומק על ידי הטיית הבמה ב-SEM. בצעו אופטימיזציה של המיקוד והסטיגמטיזם לפני איסוף תמונה בסריקה איטית.לאחר השלמת הדמיה, כבה את קרן האלקטרונים והגדל את מרחק העבודה ל-20 millimeters. לאחר מכן, פתח את ואקום התא והוצא את הבמה. עבד את התמונות ופתח את קבצי התמונה ב-Fiji.באמצעות פונקציית הקו, סמנו במדויק את סרגל המقياس. לחצו על לשונית Analyze, ולאחר מכן בחרו בפונקציית Select Scale. יופיע חלון שידרוש הגדרה של מרחק ידוע בהתבסס על סרגל המقياس.שנו גם את יחידת האורך, ולחצו על אישור. לבסוף, כדי למדוד את אורך התא, השתמשו בפונקציית הקו כדי לשרטט את התא במלואו. בחרו שוב בלשונית Analyze, ואז לחצו על measure.האורך צריך להופיע ביחידות שצוינו קודם לכן. תמונות אלו מציגות תאי צמח (vegetative cells) של *C. difficile* שנתפסו במהלך הפאזה המעריכית (exponential phase) של עקומת הגדילה, וכן תאי נבג. תאי הצמח הם מבנים ארוכים, חלקים ובצורת מוט; לעומת זאת, הנבגים הם מבנים ביצתיים קטנים בעלי מעטפת חיצונית מחוספסת.כפי שמוצג בדמות זו, תאי הבקרה גדלים ומגיעים למישור (plateau); לעומת זאת, בתאים שטופלו באנטיביוטיקה vancomycin ו-metronidazole חלה ירידה בסך ה-CFUs עד לגבול הגילוי, דבר המעיד על השפעה בקטריצידית. כפי שהודגם, vancomycin ו-metronidazole יעילים בהריגת C.difficile בריכוזים העולים על ה-MIC. כדי להדגים את התועלת בשימוש ב-SEM להדמיית C.difficile, התאים הודמייו לפני ואחרי הטיפול בתרופות כדי לקבוע כיצד השתנתה המורפולוגיה.במקרה של vancomycin, חלק מדפנות התאים הושפעו וחלק מהתאים שטופלו ב-metronidazole היו קטנים יותר. כדי לבדוק אם גודל התא הושפע, נותח אורך התא באמצעות התוכנה Fiji. כפי שמוצג בתמונה זו, גודל התאים הווגטטיביים עשוי להשתנות מעט במקרה של הביקורת; אך רובם הם באורך של כ-6 micrometers.עם זאת, כפי שניתן לראות בגרף זה, אורך התאים הושפע בתאים שטופלו ב-metronidazole, אך לא בתאים שטופלו ב-vancomycin. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משני ימים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שהדגימה מקובעת ויבשה לחלוטין לפני הציפוי והדימוי.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האופן שבו חיידקים יגיבו לטיפולים באנטיביוטיקה; דבר זה עשוי לספק לנו תובנות נוספות להבנת מנגנוני הפעולה של אנטיביוטיקה, למשל. לטכניקה זו פוטנציאל עצום והיא עשויה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה להעמיק את חקר הפיזיולוגיה והפרמקולוגיה ב-Clostridium difficile. אני מקווה שנהניתם לצפות בסרטון זה היום.אני מקווה שהרווחתם מכאן כיצד לגדל ולאפיין תאי C.difficile, כיצד לבחון את קינטיקת ההריגה של אנטיביוטיקה נגד C.Difficile, ולאחר מכן כיצד להעריך את השינויים המורפולוגיים הקשורים לתבניות הריגה אלה באמצעות מיקרוסקופיה ברמה גבוהה. בעודנו עובדים עם Clostridium difficile, עלינו לנקוט באמצעי זהירות נוספים ולהשתמש בכל מיגני

a-protocol-to-characterize-morphological-changes-clostridium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: וינסטון, ג'יי. א. ואחרים. מודל עכבר מטופל בספפרזון של זן Clostridium difficile R20291 הרלוונטי קלינית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את הכימות של Clostridium difficile בדגימות צואה ממודל עכבר נגוע באמצעות טכניקות תרבית סלקטיביות. הוא מפרט את ההליכים לאיסוף דגימות, עיבוד אנאירובי, דילול סדרתי וספירת מושבות להערכת התיישבות חיידקית ואינטראקציות בין מאכסן-פתוגנים.

כימות של Clostridium difficile בדגימות צואה ממודל עכבר נגוע

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת הצטברות של בדיקה אנטיביוטית פלואורסצנטית בתאי חיידקים. חשיפה למעכב משאבת אפלוקס משבשת את שיפוע הפרוטון הטרנסממברנה בתאי חיידקים, שעליו מתווספת אנטיביוטיקה מצומדת פלואורופור. עיכוב של משאבות אפלוקס עקב שיפוע פרוטונים משובש גורם להצטברות של אנטיביוטיקה בתוך החיידקים. תאי חיידקים עוברים ליזה, ועוצמת הפלואורסצנטיות נמדדת כדי לאשר הצטברות אנטיביוטיקה.

בדיקה למדידת הצטברות של בדיקה אנטיביוטית פלואורסצנטית בתאי חיידקים

difficile Clostridium הוא חיידק פתוגניים שהוא anaerobe מחמיר וגורם לשלשול לאנטיביוטיקה קשור (AAD). כאן, שיטות לבידוד, culturing ושמירה על ג תאים של צמח difficile ונבגים מתוארים. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר דורשת תחזוקה שוטפת על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי טיפוח difficile.

Culturing ושמירה<em&gt; Difficile Clostridium</em&gt; בסביבת אנאירובית

פרוטוקול זה מתאר את מודל עכבר cefoperazone של זיהום difficile Clostridium (CDI) באמצעות זן קליני רלוונטי וגנטי-צייתן, R20291. דגש על ניטור מחלה קליני, פקידת חיידקי C. difficile, cytotoxicity רעלן, ושינויי histopathological ברחבי CDI במודל של עכברים מפורטים בפרוטוקול.

Cefoperazone שטופל עכבר דגם של קליני רלוונטי<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 הזנים

מאמר זה מתאר שיטה microarray חלבון עבור פרופיל החיסונית ההורמונאלית, התגובות פאנל 7-ה-plex של מאוד מטוהרים Clostridium difficile אנטיגנים של sera אנושי. ניתן להאריך את הפרוטוקול מצפני תגובות נוגדנים ספציפיים בהכנות של ורידי polyclonal.

שיטת Microarray לקביעת סרולוגית לזיהום Clostridium difficile נוגדן התגובות הבאות אנטיגן ספציפי

פלואור שתייגת אנטיביוטיקה הם כלים רבי-עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד היבטים מרובים של עמידות מיקרוביאלית. מאמר זה מתאר את הכנת אנטיביוטיקה מתויג fluorescently היישום שלהם כדי ללמוד עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. רגשים יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים של עמידות חיידקים (למשל, אפלוקס) על ידי ספקטרופוטומטר, זרימה cy try, ו מיקרוסקופ.

ויזואליזציה של עמידות בקטריאלי באמצעות הפלורסנט אנטיביוטי רגשים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס מודל עכברי קוליטיס המושרה על ידי פסאודו-חיידקים נטולי חיידקים דקסטרן סולפט נתרן כדי לחקור את תפקידה של מיקרוביוטת המעיים בוויסות ההשפעות החיוביות של Bacillus cereus על קוליטיס.

חקירת ההשפעות המקלות של מתן Bacillus cereus על קוליטיס באמצעות אפנון מיקרוביוטה של המעיים

התמדה אנטיביוטית מתארת את היכולת של תת-אוכלוסיות קטנות בתוך אוכלוסייה איזוגנית רגישה לסבול באופן זמני מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה קוטלת חיידקים. הפרוטוקול הנוכחי משלב גישות לאפיון פנוטיפ ההתמדה האנטיביוטית ברמה המולקולרית והתאית לאחר חשיפת Escherichia coli למינונים קטלניים של אופלוקסצין.

ניתוח אוכלוסייה ותא בודד של התמדה אנטיביוטית ב- Escherichia coli

בדיקות אבחון רגישות מיקרוביאלית הנוכחי מסתמך על צמיחה של planktonic מבודד ב מזין, עשיר תנאים אירוביים. כאן, אנו מעסיקים בינוני חלופה כיח מלאכותית ללמוד הרגישות מיקרוביאלית של Pseudomonas aeruginosa biofilms תחת שני תנאים אירוביים ו microaerophilic נציג נוסף של הריאה סיסטיק פיברוזיס.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

למדו שיטת מיקרוסקופיה אלקטרונית לסריקה כדי לאפיין שינויים מורפולוגיים ב-Clostridium difficile בתגובה לאנטיביוטיקה. טכניקה זו משלבת הדמיה ברזולוציה גבוהה עם שיטות תרבית תאים לחקירת מנגנוני פעולה תרופתיים.

פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של

גלה סרטונים נוספים