Name: ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: למד את שיטת ODELAY לכימות פנוטיפי גידול של תאי שמרים בודדים במיקרוסקופיה time-lapse. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה וכימות של הטרוגניות אוכלוסייתית בקנה מידה גדול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מאשרים תמיכה עבור עבודה זו על ידי מענקים U54 RR022220 ו P50 GM076547 ל- JDA מהמכון הלאומי האמריקני לבריאות. FDM הוא פוסט דוקטורט עם המכון הקנדי לחקר הבריאות. אנו מודים גם למרכז לוקסמבורג למערכות ביו-רפואה ולאוניברסיטת לוקסמבורג לתמיכה.

<ol><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+bacterial+growth+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li>
<li>Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactose+metabolism+in+yeast-structure+and+regulation+of+the+leloir+pathway+enzymes+and+the+genes+encoding+them%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).</li>
<li>Yoshikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+phenotypic+analysis+for+identification+of+genes+affecting+growth+under+ethanol+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).</li>
<li>Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mass%2C+density%2C+and+volume+during+the+cell+cycle+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).</li>
<li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+fitness+and+genetic+interactions+in+yeast+on+a+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale.</a> Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), 425-431 (2010).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).</li>
<li>Zackrisson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scan-o-matic%3A+High-Resolution+Microbial+Phenomics+at+a+Massive+Scale%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale.</a> G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).</li>
<li>Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ultra-high-density+screening+tools+for+microbial+%27omics%27%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'.</a> PloS One. 9 (1), e85177(2014).</li>
<li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous%2C+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10 (5), e1001325(2012).</li>
<li>Herricks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Cell+Doubling+Evaluation+by+Living+Arrays+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22ODELAY%21+G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast.</a> ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).</li>
<li>Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25225336">Systems cell biology.</a> J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).</li>
<li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4297649/">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> J Biol Methods. 1 (2), e10(2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

Assay ODLAY יש כמה נקודות קריטיות להבטחת המדידות פנוטיפי לשחזור ואמין. הנקודה הקריטית הראשונה היא הכנה עקבית של תרבויות השמרים. יש להקפיד לקצור את תאי השמרים מן הצמיחה הלוגריתמית. אם תרבויות יש רווי, אז ההטרוגניות האוכלוסייה שלהם יהיה מוגבר אשר עלול לערפל הטרוגניות הנגרמת על ידי גורמים גנטיים או סביבתיים ( למשל, מקור פחמן) 11 . הנקודה הקריטית השנייה היא הכנה עקבית של התקשורת. באופן כללי, נפח גדול של פתרון 10X מדיה מלאי צריך להיות שנוצר ולאחר מכן נעשה שימוש לאורך זמן כדי למזער את האפקטים אצווה. גיבוש מדיה לפי משקל, ככל הניתן, מסייע לשפר את עקביות המדיום לאורך זמן על ידי הבטחת צפיפות של אגר ואת התוכן הכולל של המים של agarose ניתן לפקח מקרוב. הנקודה הקריטית השלישית כוללת מזעור או ביטול כל דפורמציה מכנית של agarose אותי. דפורמציה מכנית של התקשורת תהיה הנפוצה ביותר להתרחש במהלך ההפרדה של agarose מן שקופיות הזכוכית. כמו טכניקות מעבדה רבות, בפועל נדרש לשלוט בשלב זה. שינוי בזמן בפיגור כפי שמתואר באיור 4 , קשורה לעיתים קרובות לאחד משלושת הגורמים: עיוות מכני של המדיום agarose, וריאציה בעובי אגר מעוצב, או מקור אור יציב. אם המדיום agarose משתנה Z- גובה על פני מערך מנומר, וריאציה גובה עלול להציף את טווח של שגרת פוקוס אוטומטי, גורם לתמונות הראשונית להיות קצת מחוץ להתמקד. מסיבה זו, לבדוק את גובה המיקוד במספר כתמים במרכז לאורך הקצוות של מערך הבחין כדי להבטיח את שגרת פוקוס אוטומטי יש מספיק טווח Z כדי למצוא את המיקוד. אם יש צורך, השתמש בחלונית &#39;פוקוס אוטומטי&#39; כדי להגדיל את טווח המיקוד ולהגדיל את מספר שלבי המיקוד. קונדיט שלישי אפשרייון שעלול להוביל להתמקדות ירודה הוא מקור אור לא יציב או מהבהב, אשר יכול לשבש את ציון המיקוד מחושב עבור Z- גובה מסוים. נורות הלוגן טונגסטן נוטים להבהב הרבה לפני הנורות לשרוף. ההשפעה של המיקוד לקוי הוא ציין בדוגמה אחת שבה עקומות הצמיחה לטבול בין הראשון והשני נקודות זמן ( איור 5 א ), ואילו במקום הסמוך אין לטבול אותו ( איור 5 ב &#39; ). במקרה זה, מצב המיקוד המסכן הוקל על ידי החלפת מקור האור הלוגן טונגסטן. בפועל, המחברים מצאו כי כדי להפחית את הבהוב של 100W טונגסטן נורות הלוגן, הנורות צריך להיות מוחלף כל 500 שעות או בערך כל 2 חודשים כאשר המיקרוסקופים נמצאים תחת שימוש כבד. כדי למנוע בעיות מיקוד ירודות מנורה מהבהבת, החלף את מקור האור של הלוגן טונגסטן לעיתים קרובות או החלף את נורת ההלוגן באמצעות מקור אור דיודה. Anדוגמא למערך המציג וריאציה נמוכה בזמני ההכפלה וכן זמני פיגור אחידים יותר מוצגים באיור 6 . מערך נתונים זה נלקח עם דיודה מאיר אשר מספק תאורה יציבה יותר לאורך זמן תוך ביצוע פוקוס אוטומטי. בעוד שרבים מהנקודות שהוזכרו כאן לאופטימיזציה של הכנת המדיה עשויות להיות מובנות מאליהן, בספרות המסכים הגדולים ביותר לא משכפלים היטב זה עם זה 8 , 11 . לכן, יש לנו תיאר בקפידה את ההכנה של תרבויות התקשורת agarose כך מסכי פנוטיפי לשחזור יותר עשוי להיווצר. Assay ODLAY מוגבל כעת התפוקה בהשוואה להצמדת מבחני מבוסס כגון מערכים גנטיים סינתטיים או assay Scan-O-Matic. בעוד שיטות אלה להגדיל את מספר זנים נמדדים, הם חסרים יכולת לפתור תאים בודדים אNd ולכן לא ניתן למדוד הטרוגניות האוכלוסייה שאנו רואים בתוך זנים שמרים משובטים. מקור ההטרוגניות של אוכלוסייה זו אינו מובנת כיום, אך מיזוג הטכנולוגיה והחישוב כפי שמוצג כאן מציע הזדמנות להתייחסות אובייקטיבית למנגנונים הסלולאריים הבסיסיים 12 . המחברים מבקשים לציין כי ODELAY כרגע מותאם רק עבור מותג מיקרוסקופ מסוים סוג הגוף. שינוי ODLAY עבור מערכות מיקרוסקופ אחרות הוא ישר קדימה אבל ידרוש ידע של קוד פתוח 13 API. עם זאת, הן ה- API, כמו גם את הסקריפטים ODELAY כתובים להיות מותאמים בקלות למערכות שונות מבחני ניסיוני. בעוד ODELAY פותחה במקור עבור שמרים, היינו מסוגלים לנצל את זה ללא שינוי כדי לבחון את הצמיחה של Mycobacterium smegmatis . תצפית של המושבה האחרת להרכיב מיקרואורגניזמים הואאפשרי עם שינויים בקוד המקור שסופק 11 . באופן כללי, ODELAY הוא כלי רב עוצמה וגמיש להשוואת מיקרואורגניזמים הגדלים בתנאים סביבתיים שונים הפרעות גנטיות.

פנוטיפים גדילה של מיקרואורגניזמים הם אינדיקציה חזקה של הכושר הגנטי הבסיסי שלהם למצב סביבתי נתון. הצמיחה מופרדת באופן קלאסי לשלושה משטרי צמיחה שונים: שלב השלב, שלב הפאזה וצמיחת פאזה נייחת 1 . כל שלב גדילה יכול לגלות היבטים שונים של כושר התלויים בתנאים סביבתיים וגנטיים שונים. לדוגמה, זמן השהיה, או משך הזמן האורגניזם מבלה בשלב השהיה לפני תחילת הצמיחה מעריכי, יכול להצביע על יכולתו של אורגניזם להגיב לתנאים סביבתיים שונו 2 . הכפלת זמן הגידול במהלך שלב הפלט, המדד הנפוץ ביותר של כושר הסלולר, מגלה את היעילות הכוללת של יכולתו של אורגניזם לחלק על ידי חילוף החומרים ושימוש בחומרים סביבתיים לשכפול. שלב נייחים, שבו הצמיחה לאחר שלב יומן מופחת במהירות, הוא אינדיקטור נוסף של כושר, שהוא קבועLy משמש נקודת סיום הצמיחה במקום מבוססי מבחני שמרים צמיחה. כמה שמרים צמיחה שמרים זמינים כיום נחשב שיטות סטנדרטיות להערכת פנוטיפים הצמיחה בשמרים 3 , 4 , 5 . מבחני אלה מבוססים בעיקר על שיטות גידול שמרים או על מוצק או בתקשורת נוזלית. על מוצק התקשורת, המושבה להצמיד מבחני להעביר מספר קטן של תאים על גבי אגר מוצק עם סיכה, תאים שמרים מותר לגדול לתקופה מוגדרת של זמן. המושבות הם צילמו ואז הגודל שלהם מושווים בנקודת קצה מסוף 6 . אלה מושבות pinning המושבה הוכיחו חזקים וניתן להרחבה כדי ליצור מסך רחב הגנום. לאחרונה, הדמיה תקופתית באמצעות סורקים שטוחה שטוח עדשות יחיד רפלקס (SLR) מצלמות שולבו אלה מבחני להקליט צמיחה המושבה לאורך זמן 7 , 8, 9 . עם זאת, הפתרון של התקנים אלה מונע מהם לגלות תאים בודדים ולכן, אלה מושבות הצמיד המושבה לא ישירות לצפות בפיגור זמן ולא ניתן להבחין וריאציה בין תאים בודדים לגדול לתוך מושבות. מבחני צמיחה מבוססי נוזלים הועסקו גם כדי לבצע מסכי גנום רחבים 3 . צימוד assay צמיחה נוזלית עם מיקרוסקופ זמן לשגות חשף ההטרוגניות האוכלוסייה בזמן הכפלת תאים בודדים זהים גנטית, אשר מציעה נקודת מבט חשובה להבנת רגולציה גנטית הסתגלות סביבתית. עם זאת, assay זה אינו מודד היבטים אחרים של צמיחה כגון זמן השהיה כושר נשיאה 10 . כאן אנו מציגים שיטה לאפיין את כל שלבי הצמיחה של המושבה להרכיב מיקרואורגניזמים על מדיה מוצקה באמצעות assay אנחנו מונח ODELAY 11 . ODELAY מורכב utiliZing גבוהה התפוקה זמן לשגות מיקרוסקופ כדי להקליט תמונות של תאים בודדים גדל לתוך מושבות על מוצק התקשורת. אוכלוסייה זו של תאים בודדים הגדלים לתוך מושבות מגלה את ההטרוגניות הבסיסית של האוכלוסייה, אשר לא זוהה על ידי מדידות פחות רגישות אחרות כגון ניקוד נקודות קצה סופיות. אנו מדגימים את השיטה על שמרים, אבל ODELAY ניתן להחיל על כל אורגניזם זה מראה בניגוד מיקרוסקופ שדה בהיר.

<table><tbody><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>ג'ל טמפרטורת 36C, חוזק ג'ל (1%) 1.2 גרם/ס"מ</td></tr><tr><td>תמצית שמרים פפטון (YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>תערובת תוספות מלאה (CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td>זן שמרים BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>זן שמרים BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות פלקון</td><td>קורנינג</td><td>430291</td><td>מארז 15</td></tr><tr><td>מ"ל צינורות פלקון</td><td>קורנינג</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 אינץ' 1.0 מ"מ שקופיות בעובי 1/2 ברוטו</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות תחתון שטוח</td><td>קורנינג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>353072 רובוט טיפול בנוזל הידרה</td><td>תרמו</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>המילטון מיקרולאב כוכב טיפול בנוזל רובוט</td><td>המילטון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>הידרה 100 מ"ל טיפים אורך מורחב DARTS</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 קורא צלחות</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 10X/0.3NA אובייקטיבי</td><td>Leica</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה ORCA Flash 4.0 מצלמה</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB עם ארגז כלים לעיבוד תמונה</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>ODELAY Microscope Control (סקריפטים של MATLAB ו-GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY עבור סקריפטים ותוכנות של Matlab</td></tr><tr><td>תא</td><td></td><td></td> מיקרוסקופ <td>ODELAY www.aitchisonlab.com\ODELAY לשרטוטים מכניים</td></tr><tr><td>תבניות</td><td></td><td></td> אגר ODELAY <td>www.aitchisonlab.com\ODELAY לציורי עובש</td></tr></tbody></table>

odlay: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

פנוטיפים גדילה של מיקרואורגניזמים הם אינדיקטור חזק של הכושר הגנטי הבסיסי שלהם וניתן להפריד בין 3 משטרי צמיחה: שלב בפיגור, שלב שלב, שלב נייח. כל שלב גדילה יכול לגלות היבטים שונים של כושר הקשורים לתנאים סביבתיים וגנטיים שונים. מדידות ברזולוציה גבוהה וכמותית של כל 3 שלבי הצמיחה הם בדרך כלל קשה להשיג. כאן אנו מציגים שיטה מפורטת לאפיין את כל השלבים 3 צמיחה על מדיה מוצקה באמצעות assay שנקרא תא בודד הכפלת הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). ODLAY מכמת פנוטיפים הצמיחה של תאים בודדים גדל מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ. שיטה זו יכולה ישירות לבחון את ההטרוגניות האוכלוסייה עם כל פרמטר הצמיחה בתאים זהים גנטית גדל מושבות. הטרוגניות אוכלוסייה זו מציעה נקודת מבט ייחודית להבנת רגולציה גנטית ואפיגנטית ותגובותהפרעות גנטיות וסביבתיות. בעוד שיטת ODLAY מודגם באמצעות שמרים, זה יכול להיות מנוצל על כל המושבה היוצרים מיקרואורגניזם זה גלוי על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר.

<html> תמונות לדוגמה של שמרים גדל במיקרוסקופ זמן לשגות מוצגים באיור 3 ב . לאחר עיבוד הזמן לשגות תמונות, נתונים נציג קבוצה השוואת זנים שמרים BY4741 &amp; BY4742 מוצג באיור 4 . במערך זה לדוגמה, יש וריאציה מעט מאוד זמן הכפלה בין עמדות שונות על הצלחת. אם בינוני agarose מוכן כראוי, אז סטייה ברורה הן זמן הכפלת זמן השהיה יהיה ברור עמדות נקודה חופפות עם האזור המעוות של ג&#39;ל agarose. בעוד שכפול פעמים נראה אחיד יחסית, דוגמה זו מציגה שינויים במידות הזמן בפיגור. מערך נתונים עקבי יותר מוצג באיור 6 . במערך זה זמן הפיגור וכפל הזמן הם אחידים. <html> Files / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: אגר עובש עובש. הרכיבים של עובש אגר מוצגים ב ( א ). להרכיב את הבסיס כפי שמוצג ב ( B ) ולאחר מכן מהדק את הבסיס עם קליפים קלסר קטן. מניחים את החלקים זקוף יותר בחלל של הבסיס ( ג ) ולאחר מכן המחנה שקופיות עובש כפי שמוצג ( D ). מבט צד מראה את הזווית של התבנית ואת הכיוון של קרף עובש הדרוש הפרדה עקבית של אגר מן השקופית זכוכית ( E ). הערה המיקום של האגודל ואת האצבע, כמו גם את הקו הישר של אגר להפריד את השקופית ( F ) ולשים לב את החץ האופקי. קו ההפרדה צריך לנוע באופן שווה לכיוון החצים האנכיים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> = &quot;Jove_content&quot; עבור: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> איור 2: שיטת סוניקציה ואיתור. Sonicate את הצלחת במים הקרח באמצעות מחזיק דלי צנטריפוגות לעזור לתמוך את הצלחת ( א ). הנח את הצלחות ממדרגות 3.8.1 החוצה לזיהוי על צלחת agarose ( B ). כמו כן, לארגן את הטיפים כך את הקצה השמאלי ביותר קצה יש עצה אחת במצב C10 ולאחר מכן ארבעה טיפים אחרים עם הקצוות שלהם מנותקים כך שהם לא לקרוס את מחזיק צלחת ( ג ). מניחים את הטיפים הנותרים בארבעה קופסאות כך שהמקומות הפנימיים של 24 הטייסים כבושים ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3: ODELAY ממשק משתמש גרפי. צילום מסך של ממשק משתמש גרפי עבור &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). ממשק זה מאפשר ניטור של המצלמה עבור התאמת הגדרות תאורה מיקרוסקופ עבור מצבי epifluorescent ובהיר שדה. החצים האדומים מצביעים על הלחצנים &#39;פוקוס&#39; ו&#39;מעבר &#39;המפעילים את המצלמה כדי לרכוש תמונות במהירות ולפתוח את תריס האור המועבר בהתאמה. החצים הכחולים משמשים להעתקת הבמה למקור ולאחר מכן הגדרת המקור עם הלחצן &quot;Go Origin&quot; ו- &quot;Set&quot;. חיצים ירוקים מצביעים על &quot;אפס&quot; ו &quot;ODELAY !!!&quot; לחצנים המאפסים מצבי תמונה של ODELAY לתנאים הנוכחיים ומפעילים אוסף תמונות של ODELAY. זמן לשגות תמונות של שמרים גדל על בינוני מוצק ב 0, 3, 6, ו 9 שעות לאחר תצפית ( ב ). צילום מסך של ממשק המשתמש הגרפי עבור &quot;ODELAY_IPT.m&quot; או th<html> עיבוד תמונה כלי ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> איור 4: דוגמה פלט ODLAY. מערך נתונים זה משווה זנים BY4741 ו BY4742 על מדיה YPD. נתון זה הוא דוגמה של שקף agarose מוכן היטב; עם זאת, הגדרות פוקוס אוטומטי אינן אופטימליות. הנתונים המוצגים בכל עמוד, משמאל לימין, הם: יכולת הנשיאה ביומן 2 באזור המושבה; הכפלת הזמן, נתון דקות; ו בפיגור זמן, נתון דקות. בדוגמה זו, פעמים הכפלה של כל הכתמים על קו השקופית אגר למעלה גם עם כמות קטנה של זמן הכפלת כפול לכיוון העמודה. עם זאת, פעמים בפיגור להשתנות במידה ניכרת במערך זה._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> איור 5: דוגמאות לעקומת הצמיחה. דוגמה זו ממחישה כיצד המיקוד הראשוני המסכן עלול לגרום לזמן השהיה המשוער (t lag ) להגדלה ( A ), ואילו המיקום הסמוך מציג זמן פיגור קצר יותר ( B ). T d הוא זמן הכפלת דקות, ו l בפיגור הוא זמן השהיה דקות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> איור 6: דוגמה לניסוי המבוצע בהצלחה. הXample של זן BY4742 נבדק לאחר החלפת נורת הלוגן טונגסטן עם מנורה דיודה ולהבטיח את המיקוד האוטומטי מוגדר כראוי. נראה כי כל זמני ההכפלה חופפים היטב והזמן בפיגור נראה עקבי. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

אנו מציגים שיטה לכימות פנוטיפים הצמיחה של תאים שמרים בודדים כפי שהם גדלים לתוך מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ בשם, אחת הכפלה הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). הטרוגניות האוכלוסייה של תאים זהים גנטית גדל לתוך מושבות ניתן לצפות ישירות לכמת.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

המטרה הכללית של ODELAY היא למדוד פנוטיפי גדילה של תאים בודדים הגדלים למושבות באופן בעל תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח במיקרוביולוגיה, גנטיקה וביולוגיה של מערכות, כגון השפעות של הפרעות גנטיות ואינטראקציות של תרופות על פנוטיפי גדילה של כל מיקרואורגניזם היוצר מושבות. היתרון המרכזי של ODELAY הוא שהיא מאפשרת לחוקר לצפות באופן ישיר ולכמת את ההטרוגניות של האוכלוסייה בקרב מספר רב של פרטים.לפני הרכבת תבנית האגר, נקה את תבניות האקריליק בעזרת 70% ethanol ויבש אותן באמצעות אוויר דחוס. ישנן שלוש חלקי בסיס ושני חלקים אנכיים. כדי להתחיל בהרכבת תבנית האגר, קח את שלושת חלקי הבסיס והרכב אותם כך ששני החלקים הזהים יחבקו את החלק השלישי.השתמשו בשני תפסים קטנים כדי לקבע את חלקי הבסיס בכל צד. הניחו את התומכים האנכיים בתוך התבנית תוך וידוא שהקימור של הלייזר ממוקם נכון. הניחו סרטית זכוכית נקייה ויבשה על התבנית והחזיקו אותה במקומה בזמן הנחת סרטית זכוכית שנייה בצד השני.הדק את המכלול באמצעות תפס משרד גדול. הדק את שתי השקופיות באמצעות תפסי משרד גדולים, תוך וידאי שכל תפס עליון נמצא במגע עם השקופית זכוכית וחופף לאקריליק. לפני מילוי התבנית המורכבת באגר מומס, ודא שהקצוות אטומים על ידי הזרקה בפיפטה של כ-70 µL של מצע אגר מומס לאורך הצד הפנימי של התבנית.מלאו את התבנית תוך מניעת כליאת בועות אוויר בפנים, על ידי העברה איטית בפיפטה של האגר הנוזלי לאורך דופן התבנית. לאחר מילוי התבנית, הניחו לה להתקרר בטמפרטורת סביבה של כ-23 degrees Celsius למשך 40-60 דקות. השלב הבא הוא הפרדת התבנית.התחילו בהסרת תפס השליחה התחתון. לאחר מכן, הסירו את החלק התחתון של התבנית, המורכב משלוש שכבות חסומות. החזיקו את השקופיות על ידי לחיצה עליהן, ולאחר מכן הסירו בזהירות את תפסי השליחה.מקמו את התבנית על קצה משטח העבודה כך שהצד של התבנית עם הנקודה הכחולה פונה כלפי מעלה. הניחו את שני האגודלים מתחת לאקריליק ואת האצבעות הראשונות בחלק העליון לכיוון הקצה הפנימי של התבנית, ודחפו באיטיות ובזהירות כלפי מעלה עם האגודלים כנגד התבנית, כאילו אתם מסיטים את המפריד של התבנית סביב הקצה התחתון שלה. הפעילו לחץ קבוע אך עולה באיטיות.סדק ובועת אוויר אמורים להופיע לאורך הקו שבו זכוכית העליונה מכסה את המפריד של התבנית. לאחר הופעת קו השבירה הראשוני, המשיכו לדחוף כלפי מעלה עם שתי האגודלים והפעילו לחץ קבוע. האגר אמור להתחיל להיפרד מהזכוכית.המשיכו להטות את התבנית כלפי מעלה. כאשר הזכוכית משתחררת לחלוטין, אחזו בה והוציאו אותה לגמרי מהתבנית. לאחר מכן, הסירו את חלק התבנית השני בתנועה דומה כדי להרים אותו מבלי להזיז את האגר.הניחו את השקופיות בקופסת טיפים סטרילית עם מעט מים סטריליים בדרגת טוהר גבוהה בתחתית. סגרו את הקופסה ואחסנו בטמפרטורה של 4 degrees Celsius למשך לילה לשימוש ביום למחרת. התחילו את ההליך על ידי הכנת הזנים בלוח 96 well plate כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.השתמשו בקורא לוחות (plate reader) למדידת הצפיפות האופטית ב-600 nanometers של כל תרבית. לאחר מכן, השתמשו בפרוטוקול דילול אוטומטי כדי לדלל את התרביות בלוח לצפיפות אופטית של כ-0.1 ב-600 nanometers. לאחר הגדרת תוכנית הדילול, טענו לוחות, מבחנות וטיפים על משטח הרובוט לטיפול בנוזלים (liquid handling robot) כפי שמוצג בסידור המשטח.לחצו על כפתור ההפעלה להרצת תוכנית הדילול. בחרו את המספר הנכון של טיפים של 50 microliter ואת המספר הנכון של טיפים של 300 microliter. עם סיום הדילול, הוציאו את פלטת הדילול מהרובוט והדגרימו את הפלטה בטמפרטורה של 30 °C תוך שמירה על הלחות למניעת התייבשות הפלטה למשך חמש עד שש שעות.כשעה עד שעתיים לפני השלמת הדגרה של פיתח התרבית, הפעל את תאי ההדגרה של המיקרוסקופ ואפשר להם להגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. דלל את התרבית פעם שנייה לצפיפות אופטית ב-600 nanometers של 0.01 עד 0.02 באמצעות אותו פרוטוקול דילול אוטומטי. כסה את פיתח הדילול באטם מתכתי למקפיא ובצע סוניקציה באמבט קרח למשך 30 שניות, כאשר הפיתח צף במי קרח.סמנו ארבע פלטות בעלות 96 בארות בעובי תחתון שטוח כפלטה אחת, שתיים, שלוש וארבע. העבירו 150 microliters מכל תרבית שעברה סוניקציה מפלטת הדילול לפלטות בעלות התחתית השטוחה לפי התבנית הבאה: בארות A1 עד D6 לבארות C4 עד F9 של פלטה אחת.את בארות A7 עד D12 לבאורות C4 עד F9 של פלטה שתיים. את בארות E1 עד H6 לבאורות C4 עד F9 של פלטה שלוש. ואת בארות E7 עד H12 לבאורות C4 עד F9 של פלטה ארבע.כדי להתחיל בהליך זה, מקמו את שקופית האגרוז בצורה נכונה בתוך תא השקופיות. לאחר מכן, הניחו את פלטות התחתית השטוחה בעלות 96 הבארות על השולחן לפי סדר הרביעים שלהן. פלטות אחת, שתיים, שלוש וארבע משמאל לימין.סדרו טיפים בארבע קופסאות טיפים ריקות כך ש-24 הבארים הפנימיות של כל קופסה יהיו מאוכלסות בטיפים. בקופסה חמישית, מקמו טיפ בעמדה C10 וטיפים שקצותיהם גזוזים בעמדות A1, A12, H1 ו-H12. ארבעה טיפים גזוזים אלו יספקו יציבות למחבט של פלטת הטיפים.מקם את מחסן הקצה (tip punch) הראשון באתר ההתחלה של תוכנית הנקידה (spotting) של בקר הרובוט, כדי ליצור חור באגרוז שישמש מאוחר יותר ליישור קואורדינטת הראשית. מקם את פלטה אחת (Plate One) על הרובוט לטיפול בנוזלים כדי לבצע נקידה ברבע הראשון. הסר את המכסה והמשך בתוכנית הנקידה.בדקו שכל הנקודות נוכחות. רייקו את הטיפים המשומשים לתוך מיכל הפסולת הביולוגית והניחו טיפים נקיים על הרובוט. המתינו כ-30 שניות עד שהנקודות יתייבשו לקוטר של כמילימטר אחד, ולאחר מכן המשיכו בתוכנית.החליפו את פלטה אחת בפלטה שתיים והמשיכו בתוכנית הנקודים. כאשר כל ארבעת הרביעים סומנו והנקודים יבשו, החזירו את כיסוי תא השקופיות והפכו את המכשיר. הניחו שקופית זכוכית בחלקו העליון של תא השקופיות.ראשית, הכניסו את תא השקופית למיקרוסקופ. מיקרוסקופיה של צילום רצף (Time lapse) מבוצעת על ידי הרצת סקריפט בעיצוב מותאם. לחצו על התריס כדי לפתוח את תריס האור המועבר, ולאחר מכן על כפתור הפוקוס כדי להתחיל את קצב הצילום הגבוה של המצלמה.לחצו על "Go Origin" והזיזו את הבמה כדי למצוא את סימון הראשית שנוקב באגר, ולאחר מכן הזיזו אותה מעט ימינה כדי להתמקד בתאים שננקדו באזור E7. חזרו לנקב הראשית ומקמו אותו במרכז שדה הראייה. הגדירו את הראשית לערך זה על ידי לחיצה על כפתור "Set". עברו לעמדה H18 והתמקדו באמצעות בורג המשש הקרוב ביותר למיקום זה.לאחר מכן, עברו למיקום L7 ובצעו מיקוד באמצעות בורג המשש הקרוב ביותר למיקום זה. לבסוף, עברו למיקום E7 ובצעו מיקוד באמצעות בורג המשש הקרוב ביותר למיקום זה. בדקו את המיקוד במרכז ובקצוות בנקודות E12, H12 ו-L12; התאימו את טווח המיקוד האוטומטי (autofocus range) אם ערכי ה-z של המיקוד, כפי שמוצגים על ידי ערך ה-z, גבוהים מפלוס או מינוס של טווח המיקוד האוטומטי.לחצו על כפתור ה-Reset ולאחר מכן לחצו על DELAY. בחרו את הספריה לשמירת הנתונים. המיקרוסקופ יאסוף נתונים למשך 48 שעות או עד לסגירת התוכנית.תמונות timelapse מייצגות אלו מראות תאי שמרים הגדלים על מצע מוצק בשעה אפס, שלוש שעות, שש שעות ותשע שעות לאחר הזריעה. מוצג כאן סט נתונים מייצג המשווה בין שני זני שמרים לאחר עיבוד תמונות ה-timelapse. זמני הכפלה אחידים יחסית משקפים את שקופית האגרוז שהוכנה היטב, עם זאת, זמני השיהוי (lag times) משתנים במידה ניכרת בשל הגדרות מיקוד אוטומטי שאינן אופטימליות.כאן מוצגת מערך נתונים עקבי יותר, שבו נראה כי כל זמני הכפלת המספר חופפים היטב וזמני הפיגור (lag times) נראים עקביים. ברגע שהשיטה נלמדת, ניתן לבצע את הגדרת ה-ODELAY תוך שלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. השלבים הקריטיים ביותר למדידות ODELAY הדירות הן הכנת המצעים באופן עקבי ומניעת עיוות מכני של המצעים בעת הפרדת השקופיות.ODELAY היא בדיקה רגישה מאוד. לדוגמה, היא יכולה לזהות פגמי גדילה בזני שמרים הרגישים לטמפרטורה בטמפרטורת החדר, בעוד שבדיקות מבוססות-נקודות (spot assays) נפוצות דורשות תרבית של שמרים ב-37 °C כדי לחשוף פגם גדילה. למרות ש-ODELAY פותחה עבור שמרים, השיטה ישימה לכל אורגניזם היוצר מושבות, כולל פתוגנים, במטרה לחקור מגוון רחב של תנאים סביבתיים וגנטיים כדי להבין את התנהגותם של מיקרואורגניזמים.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע ODELAY למדידת פנוטיפים של צמיחה של מיקרואורגניזמים חד-תאיים היוצרים מושבות על מצע מוצק. זכרו כי עבודה עם מיקרואורגניזמים עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מיגון אישי המתאים לאורגניזמים הנלמדים.

odelay-large-scale-method-for-multi-parameter-quantification-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הזדקנות בשמרים כרונולוגית מתייחס לאובדן של כדאיות התא הקשורים זמן בשלב נייח. כאן אנו מתארים את שיטת תפוקה גבוהה עבור כמותית בקביעת תוחלת החיים בשמרים כרונולוגי.

כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני

ניתוח כמותי כושר (QFA) היא סדרה משלימה של שיטות ניסיוניות חישובית לאומדן fitnesses התרבות חיידקים. QFA מעריך את ההשפעה של מוטציות גנטיות, תרופות או טיפולים אחרים החלים על הצמיחה חיידק. ניסויים דרוג מניתוח מרוכז של תרבויות בודדות לאלפי תרבויות מקבילות יכול להיות מתוכנן.

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

אנו מציגים פרוטוקול פשוט להשיג סרטי הקרינה מיקרוסקופיה של תאי שמרים גדלו, וחבילת תוכנה מבוססת GUI כדי לחלץ את נתוני זמן סדרת תא בודד. הניתוח כולל שושלת אוטומטית והקצאת זמן החלוקה משולבת עם בדיקה חזותית ואוצרות ידני של נתונים מסומנים.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

כאן אנו מתארים בדיקה ביולוגית חזקה לכימות השיעור היחסי של פרוטאוליזה על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום. קריאת הבדיקה היא קצב גידול השמרים בתרבית נוזלית, התלוי ברמות התאיות של חלבון מדווח הכולל אות פירוק המותך לסמן מטבולי חיוני.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

כימות מדויק של אירועי סחר בשלפוחית מספק לעתים קרובות תובנות מפתח לגבי תפקידים של חלבונים ספציפיים והשפעות של מוטציות. מאמר זה מציג שיטות לשימוש ב-pHluorin סופר-אקליפטי, וריאנט GFP רגיש ל-pH, ככלי לכימות אירועים אנדוציטיים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי וציטומטריית זרימה.

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את חילוף החומרים בדרכי הנשימה, fermentative על-ידי התאמת הגידול האקספוננציאלי של האפייה למשוואה צמיחה אקספוננציאלית. חישוב הפרמטרים קינטי מאפשר להקרנה של השפעות של חומרים/תרכובות תסיסה או מיטוכונדריאלי נשימה.

שמר האפייה קינטיקה גידול אקספוננציאלי בתרבות אצווה כדי לנתח את חילוף החומרים הנשימה ואת Fermentative

כאן, אנו מציגים יישום MATLAB של זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ביקוע ותאי שמרים.

ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית

צוואר בקבוק במחזור ' עיצוב-לבנות בדיקה ' של הנדסת חיידקים היא המהירות שבה אנחנו יכולים לבצע מסכי פונקציונלי של זנים. אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה לסינון המתח המוחל על מאות אלפי תאים שמרים לכל ניסוי העושה שיטה ברצף RNA מבוסס droplet.

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

פנוטיפים של צמיחת שמרים נמדדים במדויק באמצעות הדמיה מקבילה מאוד של תאים משותקים הגדלים למיקרוקולוניות. במקביל, ניתן לעקוב אחר עמידות ללחץ, ביטוי חלבון ולוקליזציה של חלבונים, וליצור ערכות נתונים משולבות כדי לחקור כיצד הבדלים סביבתיים וגנטיים, כמו גם הטרוגניות של ביטוי גנים בקרב תאים איסוגניים, מווסתים את הצמיחה.

הדמיה חיה בעלת תפוקה גבוהה של מיקרוקולוניות למדידת הטרוגניות בצמיחה ובביטוי גנים

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכמות של סוגים עיקריים של מטבוליטים מסיסים במים ב cerevisiae Saccharomyces שמרים. השיטה המתוארת היא רב-תכליתית, חזקה ורגישה. היא מאפשרת הפרדה בין איסומרים מבניים וצורות סטריאואיזומריות של מטבוליטים מסיסים במים זה מזה.

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

למד את שיטת ODELAY לכימות פנוטיפי גידול של תאי שמרים בודדים במיקרוסקופיה time-lapse. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה וכימות של הטרוגניות אוכלוסייתית בקנה מידה גדול.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

גלה סרטונים נוספים