ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים
3 ביולי 2017
אנו מציגים שיטה לכימות פנוטיפים הצמיחה של תאים שמרים בודדים כפי שהם גדלים לתוך מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ בשם, אחת הכפלה הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). הטרוגניות האוכלוסייה של תאים זהים גנטית גדל לתוך מושבות ניתן לצפות ישירות לכמת.
המטרה הכללית של ODELAY היא למדוד פנוטיפי גדילה של תאים בודדים הגדלים למושבות באופן בעל תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח במיקרוביולוגיה, גנטיקה וביולוגיה של מערכות, כגון השפעות של הפרעות גנטיות ואינטראקציות של תרופות על פנוטיפי גדילה של כל מיקרואורגניזם היוצר מושבות. היתרון המרכזי של ODELAY הוא שהיא מאפשרת לחוקר לצפות באופן ישיר ולכמת את ההטרוגניות של האוכלוסייה בקרב מספר רב של פרטים.
לפני הרכבת תבנית האגר, נקה את תבניות האקריליק בעזרת 70% ethanol ויבש אותן באמצעות אוויר דחוס. ישנן שלוש חלקי בסיס ושני חלקים אנכיים. כדי להתחיל בהרכבת תבנית האגר, קח את שלושת חלקי הבסיס והרכב אותם כך ששני החלקים הזהים יחבקו את החלק השלישי.
השתמשו בשני תפסים קטנים כדי לקבע את חלקי הבסיס בכל צד. הניחו את התומכים האנכיים בתוך התבנית תוך וידוא שהקימור של הלייזר ממוקם נכון. הניחו סרטית זכוכית נקייה ויבשה על התבנית והחזיקו אותה במקומה בזמן הנחת סרטית זכוכית שנייה בצד השני.
הדק את המכלול באמצעות תפס משרד גדול. הדק את שתי השקופיות באמצעות תפסי משרד גדולים, תוך וידאי שכל תפס עליון נמצא במגע עם השקופית זכוכית וחופף לאקריליק. לפני מילוי התבנית המורכבת באגר מומס, ודא שהקצוות אטומים על ידי הזרקה בפיפטה של כ-70 µL של מצע אגר מומס לאורך הצד הפנימי של התבנית.
מלאו את התבנית תוך מניעת כליאת בועות אוויר בפנים, על ידי העברה איטית בפיפטה של האגר הנוזלי לאורך דופן התבנית. לאחר מילוי התבנית, הניחו לה להתקרר בטמפרטורת סביבה של כ-23 degrees Celsius למשך 40-60 דקות. השלב הבא הוא הפרדת התבנית.
התחילו בהסרת תפס השליחה התחתון. לאחר מכן, הסירו את החלק התחתון של התבנית, המורכב משלוש שכבות חסומות. החזיקו את השקופיות על ידי לחיצה עליהן, ולאחר מכן הסירו בזהירות את תפסי השליחה.
מקמו את התבנית על קצה משטח העבודה כך שהצד של התבנית עם הנקודה הכחולה פונה כלפי מעלה. הניחו את שני האגודלים מתחת לאקריליק ואת האצבעות הראשונות בחלק העליון לכיוון הקצה הפנימי של התבנית, ודחפו באיטיות ובזהירות כלפי מעלה עם האגודלים כנגד התבנית, כאילו אתם מסיטים את המפריד של התבנית סביב הקצה התחתון שלה. הפעילו לחץ קבוע אך עולה באיטיות.
סדק ובועת אוויר אמורים להופיע לאורך הקו שבו זכוכית העליונה מכסה את המפריד של התבנית. לאחר הופעת קו השבירה הראשוני, המשיכו לדחוף כלפי מעלה עם שתי האגודלים והפעילו לחץ קבוע. האגר אמור להתחיל להיפרד מהזכוכית.
המשיכו להטות את התבנית כלפי מעלה. כאשר הזכוכית משתחררת לחלוטין, אחזו בה והוציאו אותה לגמרי מהתבנית. לאחר מכן, הסירו את חלק התבנית השני בתנועה דומה כדי להרים אותו מבלי להזיז את האגר.
הניחו את השקופיות בקופסת טיפים סטרילית עם מעט מים סטריליים בדרגת טוהר גבוהה בתחתית. סגרו את הקופסה ואחסנו בטמפרטורה של 4 degrees Celsius למשך לילה לשימוש ביום למחרת. התחילו את ההליך על ידי הכנת הזנים בלוח 96 well plate כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.
השתמשו בקורא לוחות (plate reader) למדידת הצפיפות האופטית ב-600 nanometers של כל תרבית. לאחר מכן, השתמשו בפרוטוקול דילול אוטומטי כדי לדלל את התרביות בלוח לצפיפות אופטית של כ-0.1 ב-600 nanometers. לאחר הגדרת תוכנית הדילול, טענו לוחות, מבחנות וטיפים על משטח הרובוט לטיפול בנוזלים (liquid handling robot) כפי שמוצג בסידור המשטח.
לחצו על כפתור ההפעלה להרצת תוכנית הדילול. בחרו את המספר הנכון של טיפים של 50 microliter ואת המספר הנכון של טיפים של 300 microliter. עם סיום הדילול, הוציאו את פלטת הדילול מהרובוט והדגרימו את הפלטה בטמפרטורה של 30 °C תוך שמירה על הלחות למניעת התייבשות הפלטה למשך חמש עד שש שעות.
כשעה עד שעתיים לפני השלמת הדגרה של פיתח התרבית, הפעל את תאי ההדגרה של המיקרוסקופ ואפשר להם להגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. דלל את התרבית פעם שנייה לצפיפות אופטית ב-600 nanometers של 0.01 עד 0.02 באמצעות אותו פרוטוקול דילול אוטומטי. כסה את פיתח הדילול באטם מתכתי למקפיא ובצע סוניקציה באמבט קרח למשך 30 שניות, כאשר הפיתח צף במי קרח.
סמנו ארבע פלטות בעלות 96 בארות בעובי תחתון שטוח כפלטה אחת, שתיים, שלוש וארבע. העבירו 150 microliters מכל תרבית שעברה סוניקציה מפלטת הדילול לפלטות בעלות התחתית השטוחה לפי התבנית הבאה: בארות A1 עד D6 לבארות C4 עד F9 של פלטה אחת.
את בארות A7 עד D12 לבאורות C4 עד F9 של פלטה שתיים. את בארות E1 עד H6 לבאורות C4 עד F9 של פלטה שלוש. ואת בארות E7 עד H12 לבאורות C4 עד F9 של פלטה ארבע.
כדי להתחיל בהליך זה, מקמו את שקופית האגרוז בצורה נכונה בתוך תא השקופיות. לאחר מכן, הניחו את פלטות התחתית השטוחה בעלות 96 הבארות על השולחן לפי סדר הרביעים שלהן. פלטות אחת, שתיים, שלוש וארבע משמאל לימין.
סדרו טיפים בארבע קופסאות טיפים ריקות כך ש-24 הבארים הפנימיות של כל קופסה יהיו מאוכלסות בטיפים. בקופסה חמישית, מקמו טיפ בעמדה C10 וטיפים שקצותיהם גזוזים בעמדות A1, A12, H1 ו-H12. ארבעה טיפים גזוזים אלו יספקו יציבות למחבט של פלטת הטיפים.
מקם את מחסן הקצה (tip punch) הראשון באתר ההתחלה של תוכנית הנקידה (spotting) של בקר הרובוט, כדי ליצור חור באגרוז שישמש מאוחר יותר ליישור קואורדינטת הראשית. מקם את פלטה אחת (Plate One) על הרובוט לטיפול בנוזלים כדי לבצע נקידה ברבע הראשון. הסר את המכסה והמשך בתוכנית הנקידה.
בדקו שכל הנקודות נוכחות. רייקו את הטיפים המשומשים לתוך מיכל הפסולת הביולוגית והניחו טיפים נקיים על הרובוט. המתינו כ-30 שניות עד שהנקודות יתייבשו לקוטר של כמילימטר אחד, ולאחר מכן המשיכו בתוכנית.
החליפו את פלטה אחת בפלטה שתיים והמשיכו בתוכנית הנקודים. כאשר כל ארבעת הרביעים סומנו והנקודים יבשו, החזירו את כיסוי תא השקופיות והפכו את המכשיר. הניחו שקופית זכוכית בחלקו העליון של תא השקופיות.
ראשית, הכניסו את תא השקופית למיקרוסקופ. מיקרוסקופיה של צילום רצף (Time lapse) מבוצעת על ידי הרצת סקריפט בעיצוב מותאם. לחצו על התריס כדי לפתוח את תריס האור המועבר, ולאחר מכן על כפתור הפוקוס כדי להתחיל את קצב הצילום הגבוה של המצלמה.
לחצו על "Go Origin" והזיזו את הבמה כדי למצוא את סימון הראשית שנוקב באגר, ולאחר מכן הזיזו אותה מעט ימינה כדי להתמקד בתאים שננקדו באזור E7. חזרו לנקב הראשית ומקמו אותו במרכז שדה הראייה. הגדירו את הראשית לערך זה על ידי לחיצה על כפתור "Set". עברו לעמדה H18 והתמקדו באמצעות בורג המשש הקרוב ביותר למיקום זה.
לאחר מכן, עברו למיקום L7 ובצעו מיקוד באמצעות בורג המשש הקרוב ביותר למיקום זה. לבסוף, עברו למיקום E7 ובצעו מיקוד באמצעות בורג המשש הקרוב ביותר למיקום זה. בדקו את המיקוד במרכז ובקצוות בנקודות E12, H12 ו-L12; התאימו את טווח המיקוד האוטומטי (autofocus range) אם ערכי ה-z של המיקוד, כפי שמוצגים על ידי ערך ה-z, גבוהים מפלוס או מינוס של טווח המיקוד האוטומטי.
לחצו על כפתור ה-Reset ולאחר מכן לחצו על DELAY. בחרו את הספריה לשמירת הנתונים. המיקרוסקופ יאסוף נתונים למשך 48 שעות או עד לסגירת התוכנית.
תמונות timelapse מייצגות אלו מראות תאי שמרים הגדלים על מצע מוצק בשעה אפס, שלוש שעות, שש שעות ותשע שעות לאחר הזריעה. מוצג כאן סט נתונים מייצג המשווה בין שני זני שמרים לאחר עיבוד תמונות ה-timelapse. זמני הכפלה אחידים יחסית משקפים את שקופית האגרוז שהוכנה היטב, עם זאת, זמני השיהוי (lag times) משתנים במידה ניכרת בשל הגדרות מיקוד אוטומטי שאינן אופטימליות.
כאן מוצגת מערך נתונים עקבי יותר, שבו נראה כי כל זמני הכפלת המספר חופפים היטב וזמני הפיגור (lag times) נראים עקביים. ברגע שהשיטה נלמדת, ניתן לבצע את הגדרת ה-ODELAY תוך שלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. השלבים הקריטיים ביותר למדידות ODELAY הדירות הן הכנת המצעים באופן עקבי ומניעת עיוות מכני של המצעים בעת הפרדת השקופיות.
ODELAY היא בדיקה רגישה מאוד. לדוגמה, היא יכולה לזהות פגמי גדילה בזני שמרים הרגישים לטמפרטורה בטמפרטורת החדר, בעוד שבדיקות מבוססות-נקודות (spot assays) נפוצות דורשות תרבית של שמרים ב-37 °C כדי לחשוף פגם גדילה. למרות ש-ODELAY פותחה עבור שמרים, השיטה ישימה לכל אורגניזם היוצר מושבות, כולל פתוגנים, במטרה לחקור מגוון רחב של תנאים סביבתיים וגנטיים כדי להבין את התנהגותם של מיקרואורגניזמים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע ODELAY למדידת פנוטיפים של צמיחה של מיקרואורגניזמים חד-תאיים היוצרים מושבות על מצע מוצק. זכרו כי עבודה עם מיקרואורגניזמים עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מיגון אישי המתאים לאורגניזמים הנלמדים.
סקירה כללית
שיטת ODELAY מאפשרת כימות של פנוטיפי גדילה בתאי שמרים בודדים בעודם מתפתחים למושבות על מצע מוצק באמצעות מיקרוסקופיה של צילום רצף (time-lapse). טכניקה זו מקלה על התצפית ומדידה של ההטרוגניות האוכלוסין בין תאים זהים גנטית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- גנטיקה
- ביולוגיה של מערכות
רקע
- הטרוגניות של האוכלוסייה עשויה להשפיע באופן משמעותי על תוצאות הגדילה במושבות מיקרוביאליות.
- הבנת פנוטיפי הגדילה חיונית להשגת תובנות לגבי השפעות גנטיות וסביבתיות.
- מיקרוסקופיה של צילומי lapsed-time מספקת מבט דינמי על גדילת תאים ואינטראקציות ביניהם.
- ODELAY מציעה גישה בעלת תפוקה גבוהה לחקר מיקרואורגניזמים היוצרים מושבות.
מטרת המחקר
- למדידה ולכימות של פנוטיפי גדילה של תאי שמרים בודדים.
- לבחינת ההשפעות של הפרעות גנטיות על גדילת התאים.
- לחקירת אינטראקציות בין תרופות והשפעתן על גדילה מיקרוביאלית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תבניות אגר לתרבית שמרים.
- מיקרוסקופיה בשיטת Time-lapse לצפייה בצמיחת תאים.
- פרוטוקולי דילול אוטומטיים לסטנדרטיזציה של ריכוזי תאים.
- שימוש ברובוטים לטיפול בנוזלים לעיבוד דגימות בספיקת גבוהה (high-throughput).
תוצאות עיקריות
- הרכבה ושימוש מוצלחים בתבניות אגר לצמיחת שמרים.
- כימות של פנוטיפי צמיחה חשף הגויה אוכלוסיות משמעותית.
- הוכח כי ניתן לתצפת על השפעות של אינטראקציות גנטיות ותרופתיות על הצמיחה.
- מתודולוגיה בthroughput גבוה הגבירה את היעילות באיסוף הנתונים.
מסקנות
- ODELAY היא שיטה יעילה לחקר פנוטיפים של צמיחת שמרים.
- הטכניקה משפרת את ההבנה של דינמיקת אוכלוסיות מיקרוביאליות.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב למיקרואורגניזמים אחרים היוצרים מושבות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה כמותית רב-פרמטרית של פנוטיפים של צמיחה מיקרובית היא קריטית להפחתת סיכונים בהשערות לגבי יעדים גנטיים ולהבנת ההטרוגניות של האוכלוסייה בשלבי הגילוי המוקדמים. ODELAY מאפשרת ניתוח בעל תפוקה גבוהה עם רזולוציית זמן של צמיחת תאים בודדים, ובכך תומכת בתיקוף יעדים חסון ובהבנה מכניסטית. יכולת זו מחזקת את הביטחון החזוי בנקודות מפתח של תהליכי גנטיקה מיקרובית וגנומיקה תפקודית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר כימות ישיר של פנוטיפי צמיחה לאורך שלבי הלג, הלוג והשלב הסטציונרי לצורך חקירה של מטרות פונקציונליות.
- חושף הטרוגניות באוכלוסייה, דבר התומך בהסרה של סיכונים מכניסטיים ובבירור של מסלולים גנטיים.
- מסייע בהערכת השפעות של הפרעות גנטיות וסביבתיות על כשירות מיקרוביאלית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין בדיקות צמיחה כמותיות ומאומתות עבור תהליכי סינון המשכיים.
- תומך בשחזור ובסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות טיפול מדגמים והדמיה אוטומטיים.
- מייצר נתונים בעלי תוכן גבוה ורזולוציה זמנית, המתאימים להכנה לסריקות של תרכובות או סריקות גנטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר מידול של תגובות אוכלוסיות מיקרוביאליות לשינויים גנטיים או סביבתיים הרלוונטיים למצבים מחלה או למסגרות תעשייתיות.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת נקודות סיום פנוטיפיות כמותיות ורובסטיות.
- משפר החלטות קידום מותאמות סיכון על ידי הבהרה של השונות הביולוגית וספי סף של תגובה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
ODELAY משתלב ברצף השלב שבין הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים, ומספק פלטפורמה ניתנת להרחבה לבדיקת היפותזות ולפיתוח בדיקות במערכות מיקרוביאליות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערת האפס ובניתוח מסלולים על ידי כימות תגובות גדילה לשינויים גנטיים או סביבתיים.
- סריקה: מספקת מדדי גדילה כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות ויכולת הרחבה של הסריקה.
- אנליטיקה: מספקת מדידות רב-פרמטריות בעלות רזולוציית זמן המאפשרות השוואה סטטיסטית של תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מתאימה פלט פנוטיפי לדרישות של מודלים פרה-קליניים בעת חקר מיקרואורגניזמים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה וניתנת לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה למיקרואורגניזמים מגוונים היוצרים מושבות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה של בדיקות צמיחה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ויעילות הון על ידי הבהרת הסיכון הביולוגי בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום של מטרות או התערבויות מיקרוביאליות מותאם סיכון.
שיקולים ליישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה של צילום רצף (time-lapse), גנטיקה מיקרוביאלית וניתוח נתונים כמותי.
- נדרש גישה למערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים, תשתית דימוי ואחסון נתונים חסון.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להכנת מצעים ולהגדרת הבדיקה (assay).
- ניתן להתאמה למיקרואורגניזמים שונים היוצרים מושבות הנראים במיקרוסקופיה בשדה בהיר (bright field).
- קריטי למנוע עיוות מכני של המצעים ולהבטיח תנאים סביבתיים עקביים לצורך שחזור התוצאות.
