אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון את ההשפעה של טיפולים ספציפיים נבחרים על נדידת תאים בתוך פיגום פיברין תלת-ממדי הקשור לפצע. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ריפוי הפצעים, בנוגע לאופן שבו שינויים במבנה רשת הסיבים משפיעים על נדידת תאים לקרישי פיברין באתרי פצעים; היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה פשוטה וניתנת לשחזור לניתוח נדידת תאים בתוך קרישי פיברין בתלת-ממד. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, כיוון שהעברת הספרואידים עשויה להיות מאתגרת.

התחילו בחימום של מבחנה עם פיברובלסטים דרמליים אנושיים של רך-נולד קפואים באמבט מים של 37 °C. כאשר התאים เพה הפשירה, אספו אותם באמצעות סבוב (centrifugation) ותלו את המשקע במדיום טרי לפיברובלסטים דרמליים אנושיים של רך-נולד בריכוז של 1 x 10⁶ תאים ל-mL. לאחר מכן, זרעו את התאים בבקבוק תרבית T75 לדגירה של 72 שעות ב-37 °C ו-5% CO2.

כאשר התרבית מגיעה ל-80% confluency, נתקו את התאים באמצעות חמישה מיליליטר של trypsin EDTA. לאחר חמש דקות ב-37 degree celsius, נטרלו את ה-trypsin בעזרת חמישה מיליליטר של מצע מחומם וערבבו 40 microliters של תאים עם trypan blue ביחס של 1:1. שמרו מנה של 10 microliter של תאים לצורך ספירה.

אספו את התאים על ידי סנטריפוגציה והשעיו מחדש את המשקע בריכוז של 1.25 x 10⁵ תאים למילליטר. לאחר מכן, מלאו את תחתיתה של צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטר בחמישה מיליליטר של PBS סטרילי. לאחר מכן, הפכו את מכסה צלחת הפטרי והוסיפו מספר טיפות של 20 µL מת сусפנזיית התאים אל פני השטח הפנימיים של המכסה.

לאחר הנחת כל הטיפות, החזירו את המכסה על הצלחת באופן הפוך, תוך הקפדה שלא להזיז את הטיפות התלויות, והניחו בעדינות את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 degree celsius למשך 72 שעות. בתום הדגירה, הוסיפו 100 microliters של תמיסת קריש לכל ספרואיד לכל באר, בתוך פלטה בעלת 48 בארות, ונערו והקישו בעדינות על הפלטה כדי להבטיח שתערובת קריש הפיברין תכסה את הבאר כולה. הניחו את הפלטה באינקובטור למשך שעה אחת.

לאחר ששכבת הקריש התמצקה, יש לוודא את נוכחות הספרואידים בתרבית הטיפה התלויה תחת מיקרוסקופ אור, ולהעביר את הפלטה בעלת 48 הבארים ואת צלחת תרבית הטיפה התלויה למCב (מנשף) לתרבית תאים. הפוך בזהירות את מכסה פטרי the petri dish כדי לגשת לתרביות הטיפה התלויה, והשתמש במזרק של 1 mL המצויד במחט 21 gauge, כדי להעביר טיפה אחת לכל באר מצופה בפיברין. הקפד על זהירות מרבית בעת השאיבה וההשתלה של הספרואידים, שכן השלב הקשה והקריטי ביותר בתהליך הוא העברת הספרואידים מבלי להרוס אותם.

בחנו את הפלטה תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהספרואידים נזרעו כראוי בבארים המתאימות. העבירו בעדינות שכבה של 100 microliters של תמיסת קריש שהוכנה טרי על כל טיפה המכילה ספרואיד, ובחנו שוב את הספרואידים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהם עדיין שלמים ונמצאים במרכז כל באר. לאחר מכן, החזירו את פלטת 48 הבארים לאינקובטור כדי לאפשר לשכבת הפיברין השנייה להתפולימר.

לאחר שעה אחת, טפלו בכל באר ב-500 microliters של המצע המתאים לקבוצת הספרואידים הניסויית הרלוונטית והחזירו את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 degree celsius. השגיחו תמונות של הספרואידים באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר (bright field microscopy) מדי 24 עד 72 שעות, תוך שימוש ב-z stack לצפייה בחתכים רצופים של תרבית התאים התלת-ממדית. לאחר מכן, בתוכנה המתאימה לניתוח תמונות, התקיפו את גבול התאים של כל ספרואיד בכל נקודת זמן רצופה והשתמשו בפונקציית המדידה (measure function) כדי לקבוע את אחוז העלייה בשטח עבור כל ספרואיד.

בעקבות גידולם בנוכחות הסוכן המעודד או המעכב הגירה הנחקר, ניתן לקבוע את השטחים הראשוניים של הספרואידים באמצעות דימוי במיקרוסקופ בשדה בהיר, ולהשתמש בהם כנקודת ייחוס לקביעת מידת צמיחת התאים העוקבת מגופי הספרואידים בכל נקודת זמן רצופה. בניסוי מייצג זה, הספרואידים שנחשפו לסוכן מעודד הגירה הפגינו מידה מוגברת באופן משמעותי של הגירה מהגוף המקורי של הספרואיד, בהשוואה לספרואידים שנחשפו לסוכן מעכב הגירה או לסוכן בקרה. לעומת זאת, הספרואידים שנחשפו לסוכן מעכב הגירה הפגינו מידה מופחתת באופן משמעותי של הגירה מהגוף המקורי של הספרואיד, בהשוואה לספרואידים שעברו טיפול בבקרה.

לאחר שליטה בטכניקה, ניתן להשלים אותה תוך שעתיים וחצי, למעול זמן תרבית התאים, במידה והיא מבוצעת כהלכה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לגדל ולהטמיע ספרואידים של תאים עבור בדיקות נדידת תאים תלת-ממדיות במבחנה (in vitro). בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו מבנה רשת הפיברין בתוך הקריש או יישור האקטין בתאי הספרואיד תואמים לנדידת תאים מוגברת או מופחתת.

אל תשכחו שעבודה עם תרביות תאים ומחטים עלולה להיות מסוכנת ביותר, וכי יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן מתאים ועבודה תחת מנדף סטרילי, בעת ביצוע הליך זה.