Name: אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: למדו כיצד לנתח נדידת תאים בתלת מימד במטריצת פיברין לחקר ריפוי פצעים. שיטה זו מאפשרת הערכה של גורמים פרו ואנטי נדידתיים בדגימות אנושיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

קרנות לעבודה זו סופקה באמצעות איגוד הלב האמריקני (16SDG29870005), מחקר אוניברסיטת מדינת צפון קרוליינה, חדשנות זרע מימון.

1-יום 1: תא והכנות ריאגנט הערה: הכנה התא ואת ריאגנט יש לבצעו בבטיחות הביולוגי הקבינט למניעת זיהום של דגימות.
<ol><li>חמים מסונן Dulbecco &#39; s נשר שונה &#39; s בינוני (DMEM), סרום שור עוברית (FBS),-גלוטמין ו פניצילין/סטרפטומיצין באמבט מים 37 ° C.</li>
	<li>הכן מדיה neonatal פיברובלסט עורי אנושי (HDFn) על ידי שכשהם חימם DMEM עם 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1%-גלוטמין.</li>
	<li>להפשיר בקבוקון של מוקפאים HDFns ולא צנטריפוגה במשך 8 דקות ב- 200 גרם x כדי להסיר הקפאה קריוגנית בינוני. Resuspend תאים בתקשורת HDFn מוכן-צפיפות של עונה 1 פרק 10 6 תאים למ"ל ו זרע לתוך בקבוקון התרבות T-75.</li>
	<li>המקום את הבקבוק בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) כדי לאפשר התפשטות תא.</li>
	<li>HDFn חנות המדיה ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להכין ריאגנטים pro - ו אנטי - migratory לפי הצורך.</li>
</ol> 2. יום 3: ספרואיד הכנה <ol><li>לבצע את הפעולות הבאות בברדס תרבות למניעת זיהום של דגימות.</li>
	<li>כאשר תאים להגיע 80% confluency, תשאף מדיה ולהוסיף 5 מ של 0.25% טריפסין-EDTA. חנות את הבקבוק בתוך חממה 37 ° C עבור 5 דקות להתנתק באופן מלא תאים מפני השטח את הבקבוק.</li>
	<li>הוסף 5 מ של מדיה ומחוממת הבקבוק כדי לנטרל את טריפסין.</li>
	<li>בשפופרת microcentrifuge, לערבב μL 10 של Trypan Blue μL 10 של התליה תא.</li>
	<li>צנטריפוגה ההשעיה תא המקורית במשך 8 דקות ב- 200 g. x</li>
	<li>בעוד הוא להיות centrifuged התליה תא, להוסיף 10 μL של התליה תא Trypan Blue hemocytometer ולבצע ספירת תא.</li>
	<li>בעקבות צנטריפוגה, תשאף מדיה ללא הם מוציאים בגדר התא. Resuspend בגדר תא-ריכוז של 1.25 x 10 5 תאים למ"ל.</li>
	<li>הוסף 5 מ ל תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS) לתחתית של 10 ס מ פטרי כדי לשמור על סביבה רטוב במהלך צמיחה ספרואיד.</li>
	<li>היפוך את מכסה צלחת פטרי. הוסף מספר טיפות μL 20 של התליה תא אל השטח הפנימי של מכסה פטרי.</li>
	<li>במהירות להפוך שוב את המכסה ומניחים אותו בתחתית של המנה, נזהר לא לנתק את הטיפות לתלייה. איור 1 מדגימה תלוי בהצלחה בנוי טיפות.</li>
	<li>בקפידה למקם את המנה חממה 37 ° C ולאפשר spheroids לגדול תלייה טיפה תרבות לתקופה של ה 72</li>
</ol> 3. יום 6: הטבעה Spheroids לתוך מטריצה תלת-ממד <ol><li>לבצע את הפעולות הבאות בברדס תרבות למניעת זיהום של דגימות.</li>
	<li>על היווצרות שכבת פיברין הראשון, ליצור פתרון קריש הדם של נפח מספיק כדי להוסיף 100 μL של קריש דם פתרון לכל טוב של בארות רבות ככל הנדרש (1 ספרואיד לאדם טוב). קרישי דם מורכבות של 10% 10 X HEPES מאגר נפח (250 מ מ HEPES, 1500 מ"מ. NaCl, CaCl 50 מ מ 2, pH 7.4), פיברינוגן האנושי 2 מ"ג/מ"ל ו 0.1 U/mL תרומבין אלפא אנושי. השארית של אמצעי האחסון קריש הדם מורכבת מים אלקטרופורזה.
	<ol><li>תרומבין הוספה אחרונה ובמהירות להוסיף פתרון וולס הרצוי לתוך צלחת 48-טוב כדי למנוע קרישי דם polymerizing לפני להתווסף וולס.</li>
	</ol></li> <li>בעדינות לנער/ברז צלחת טוב על מנת להבטיח כי תערובת קריש פיברין ציפוי כולו טוב, ולאחר מכן מקם טוב צלחת בחממה עבור h 1 כדי לאפשר התחתון קריש לשכבה פולימריזציה. אל תלחץ חזק מספיק לגרום היווצרות בועה; טוב צלחת פשוט רוק צלחת לפי הצורך עד מצופה מכלול של הבאר. אם נעשה שימוש אחסון קריש דם גדולים יותר, צעד זה לא יהיה נחוץ.</li>
	<li>העברת spheroids על שכבת פיברין.
	<ol><li>הסר הבאר צלחת הפטרי המכיל spheroids ב התליה ירידה תרבות מן החממה, לבחון spheroids תחת מיקרוסקופ. ואז למקם את המנה וחטף תרבות.</li>
		<li>להפוך בזהירות את מכסה הפטרי כדי לאפשר גישה כדי התליה שחרר תרבויות.</li>
		<li>בזהירות באמצעות מחט 21 G המצורפת מזרק 1 מ"ל, להעביר טיפה אחת מן המכסה הפוך לתוך המרכז של כל טוב, מקפיד לא לנקב את שכבת פיברין polymerized ציפוי בתחתית הבאר. להעביר ביעילות את המסירה, לאט לאט למשוך את הירידה לתוך המחט. תפסיק למשוך את הבוכנה בחזרה ברגע הירידה כולו נמצא בתוך המחט; מושך את הירידה בחזרה לכת עשוי להציג בועות אוויר, אשר יכול לשבש העברה ספרואיד יעיל או על יצירת תמונות עוקבות.</li>
		<li>לבחון את הצלחת היטב תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח כי spheroids העבירו כראוי לתוך וולס הרצוי כל.</li>
	</ol></li> <li>להיווצרות שכבת פיברין השני, ליצור פתרון קריש דם אחר באמצעות הכנת אותו לעיל עבור יצירה של השכבה הראשונה פיברין (שלב 3.2). פיפטה 100 μL על גבי כל טיפה המכילות ספרואיד ובזהירות לבדוק תחת מיקרוסקופ שוב כדי לוודא spheroids עדיין לא נדחקו על הקצוות של הבארות.</li>
	<li>להחזיר את הצלחת היטב את החממה, לאפשר לשכבה השנייה פולימריזציה עבור ה 1</li>
</ol> 4. יום 6: תוספת של Pro-נודדים או גורמים מעכבים <ol><li>HDFn חמים למדיה-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לבצע את הפעולות הבאות בברדס למניעת זיהום.</li>
	<li>להכין מדיה עבור כל קבוצה כולל המתאים ריכוזי pro/אנטי-migratory סוכנים להערכה.</li>
	<li>הסר את לוחית טוב של חממה ומקום בשכונה תרבות.</li>
	<li>ΜL להוסיף 500 של מדיה סטנדרטי בכל טוב של קבוצת הביקורת ספרואיד μL 500 של מדיה מעכבות כל טוב של הקבוצה ספרואיד עכבות ההעברה, μL 500 של מדיה פרו-נודדת כל טוב של הקבוצה ספרואיד משופרת ההעברה.</li>
	<li>להחזיר את הצלחת היטב החממה.</li>
	<li>שינוי מדיה בכל ה 48</li>
</ol> 5. ימים 6-9: הערכה של נדידת תאים והתפשטות spheroids <ol><li>התמונה באמצעות מיקרוסקופ brightfield מיד לאחר תוספת של תקשורת (0 h), ואז כל 24 שעות עבור ה 72 אופציונלי: בכל נקודה בזמן, לקחת תמונה z-מחסנית כדי לקבוע אם ההעברה מתרחש במישורים מחוץ לאזור הראשי של המוקד. מניסיוננו זה אינו מתרחש; עם זאת, זה שימושי להבטיח זה המקרה בבכל ניסוי.</li>
	<li>שימוש ImageJ כדי לקבוע תא תוצר כל היטב על-ידי ניתוח הגדלת אחוז באזור עבור כל ספרואיד על ידי מעקב גבול התא עבור כל ספרואיד בכל נקודה בזמן רצופים באמצעות &#34; מידה &#34; פונקציה כדי להשיג את האזור.</li>
</ol>

<ol><li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li>
<li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+during+wound+repair%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li>
<li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+chemotaxis+and+contact+inhibition+of+locomotion+determines+exploratory+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration.</a> Nat Commun. 6, 6619(2015).</li>
<li>Ngalim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Adhesive+and+Soluble+Gradients+for+Imaging+Cell+Migration+with+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).</li>
<li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+Lead+the+Way%3A+A+Unified+View+of+3D+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).</li>
<li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li>
<li>Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-642-00534-3_12">Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing.</a> Bioengineering Research of Chronic Wounds. , http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-00534-3_12 263-280 (2009).</li>
<li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).</li>
<li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li>
<li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cell+Migration+within+a+Three-dimensional+Collagen+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li>
<li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2221-3759/2/4/198">A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model.</a> J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).</li>
<li>Ross, R., Benditt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+collagen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound healing and collagen formation.</a> The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).</li>
<li>Sproul, E. P., Argraves, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine+axis+regulates+elastin+formation+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytokine axis regulates elastin formation and degradation.</a> Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).</li>
<li>Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+signaling+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+REs+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Elastin signaling in wound repair.</a> Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).</li>
<li>Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Matrix+and+Dermal+Fibroblast+Function+in+the+Healing+Wound%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound.</a> Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).</li>
<li>Cox, S., Cole, M., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+Human+Dermal+Fibroblasts+in+Three-Dimensional+Fibrin+Clots%3A+Dependence+on+Fibrinogen+and+Thrombin+Concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration.</a> Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).</li>
<li>Brown, A. C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin-based+biomaterials%3A+Modulation+of+macroscopic+properties+through+rational+design+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).</li>
<li>Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+anti-inflammatory+mesenchymal+stem%2Fprecursor+cells+%28MSCs%29+through+sphere+formation+using+hanging+drop+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, Unit-2B.6 (2014).</li>
<li>Bainbridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+the+role+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Wound healing and the role of fibroblasts.</a> J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מאפשר הבחינה של נדידת תאים בריפוי הפצע הקשורים ECMs באמצעות מודל במבחנה תלת-ממד. צעד מכריע בביצוע תקין של ההליך הוא התפתחות נאותה של פיברובלסט spheroids; תא ריכוז במהלך ההכנה היה אופטימיזציה לתת של ריכוז הראשונית של תאים 2,500/שחרור, ומאפשר spheroids לטופס באופן אמין על תקופת דגירה של 72 h. אם מספר לא מספיק של תאים משמשים, spheroids ולא צבורים ביעילות, ייתכן נשברים ברגע להיות מועברים ומוטבעים לתוך שכבות פיברין. אם סוגי תאים שונים משמשים, הריכוז ההתחלתי תא ו/או ספרואיד הבשלה הזמן ייתכן יותאם על מנת לק...

ריפוי הפצע הוא תהליך מורכב אשר התוצאות השיקום של רקמות תקינות בעקבות פגיעה. תהליך זה מחולק לארבעה שלבים חופפים הקיף על ידי hemostasis, דלקת, התפשטות, שיפוץ, שמווסתים אחד על ידי שילוב מורכב של רמזים מסיסים, תא-מטריקס אינטראקציות ותקשורת תא-תא. 1 , 2 העיבוד התזמורתי של רמזים אלה שולט שפע של תגובות הסלולר ב ריפוי הפצע כולל, חשוב, נדידת תאים. 3 , 4 נדידת תאים הוא תהליך דינמי מאוד תלויה פנוטיפים הסלולר והן את המאפיינים הביוכימי ו ביופיזיקלי של הסביבה שבה התרחשה מטריצה חוץ-תאית. 5 תאים ללא הרף לחקור את סביבתם מטריצה חוץ-תאית בתיווך אינטגרין מסלולים; תהליך זה מאפשר תאים לחוש מגוון רחב של נכסים מטריקס כולל הטופוגרפיה, קשיחות של כליאה. ניתוח דו מימדי (2D) של נדידת תאים מדגים כי ההעברה הוא מונע על ידי היווצרות lamellipodia בחוד דרך הדור של אקטין פילמנט חבילות. לאחר מכן היווצרות הידבקויות מוקד בחוד, בשילוב עם actomyosin מונע הכחשה להתכווצות בקצה נגרר, כונני התא קדימה. 6 ההעברה סלולרית תלת מימדי (3D) כיום אינה מובנת היטב, אולם מחקרים אחרונים מדגימים כי ההעברה 3D הוא שונה במידה ניכרת מאשר שצויינו תיאר מנגנון בדו מימד, והוא ככל הנראה מונע על ידי מנגנונים alterative. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה על ידי פיטרי ואח. הפגינו, בהתאם, את המאפיינים של ה-ECM תאים ב- 3D מטריצות באפשרותך לעבור בין lamellipodium לבין lobopodium מונע מנגנונים של הגירה. 7 כיוון נדידת תאים הוא מרכיב קריטי של הפצע ריפוי התגובה, דגמי תלת-ממד של נדידת תאים הם קריטיים להבנת תגובות פיזיולוגיות לגירויים שונים במהלך ריפוי הפצע. למרות בהתנהגות התא נודדים על משטחים 2D הוכח שפתרון של ההעברה ב- 3D מטריצות, ביותר במבחנה המודלים הנוכחיים של נדידת תאים במהלך תהליך, כולל assay מאפס, ומבוססת על ריפוי הפצע לנצל 2D טפט תרבויות. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 יותר לאחרונה פיתח מבחני נעזרו מטריצה תלת-ממד, אך עדיין התרבות תאים חד שכבתי על גבי המטריצה, ובכך יגביל את היכולת באמת לסכם את אתמהא של הסביבה תא ויוו. 15
מטרת השיטה המתוארת כאן היא ללמוד נדידת תאים דגם תלת-ממד רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, ולא על משטח דו-מימדית, על מנת להשיג הבנה עמידים יותר של תגובות ההעברה המשויך הגירויים יישומית. שיטה זו מאפשרת על ההערכה של נדידת תאים בתוך מטריצה קריש פיברין 3D בנוכחות גורמים להפעיל או לעכב מסלולים הקשורים עם נדידת תאים. מטריצה פיברין נבחרה עבור שיטה זו עקב הפעלת פיברין תפקיד קריטי בשלבים המוקדמים של ריפוי הפצע; פגיעה הבאים, קריש פיברין נוצר בתוך הפצע סביבות לבלום את אובדן הדם ומשמש לפיגום חדירה לתא ההתחלתי במהלך שיפוץ ותיקון רקמות. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . בנוסף, פיברין משמש קלינית כמו איטום כירורגי, ההרכב של אוטמים היתה קשורה נדידת תאים ו- ultimate ריפוי תוצאות. מחקר קודמות מאת קוקס ואח. חקר פיברובלסט הגירה עם קרישי פיברין מורכבת פיברין משתנות ובתמצית תרומבין לצורך מיטוב של פיברין. במחקרים אלה, נדידה של תאים מחוץ קרישי פיברין על גבי כלים פלסטיק הייתה לכמת. 20 . אנו מציגים שיטה המאפשרת על כימות של נדידה של תאים בתוך הסביבה פיברין תלת-ממד. בעוד השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה באופן ספציפי משתמשת פיברין, מודל זה יכול בקלות להיות שונה להשתמש בחומרים אלטרנטיביים מטריקס כרצונכם, כגון קולגן או אחרים מטריצות תלת-ממד. בנוסף, אנו מציגים את השימוש פיברובלסט spheroids assay הזה כי ההעברה פיברובלסט. לתוך המיטה הפצע היא בעלת חשיבות עליונה סינתזה מטריצה חוץ-תאית, רקמות תיקון/שיפוץ. עם זאת, במהלך התיקון תהליך נויטרופילים הם סוג התא הראשון להעביר לתוך המיטה הפצע, ואחריו מקרופאגים. Fibroblasts אז מתחיל לחדור את הסביבה הפצע כ- 48 שעות לאחר הפגיעה, בתחילת השלב המקדימות תהליך ריפוי הפצע. 19 assay הזה יכול בקלות לשנות כדי לכלול נויטרופילים, מקרופאגים או סוגי תאים אחרים כדי להעריך כיצד שינויים במבנה קריש פיברין משפיעים על ההעברה אחד מסוגי התאים. 21
כדי ליישם את assay, ראשית, ספרואיד פיברובלסט נוצר באמצעות שינוי של טכניקות שתואר קודם לכן לתרבות תאי גזע. 22 ספרואיד פיברובלסט לאחר מכן מועבר לתוך מטריצה פיברין 3D ואז תוצר יכול להיות בקלות תחת פיקוח לכמת על פני מספר ימים. פרוטוקול זה לוקח בחשבון את מימד של מערכות פיזיולוגיות על-ידי הטבעת תא 3D spheroids בתוך מטריצה פיברין, וכך להימנע המגבלות ב רלוונטיות הביא על ידי באמצעות משטח צמיחה דו-מימדית טפט תא מודל להתנהגות הנדידה, בזמן מתן אפשרות להערכת בהתנהגות התא בסביבה מבוקרת מאוד במבחנה .

<table><tbody><tr><td><חזק>חומרים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר המותאם של Dulbecco, 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, עם נתרן פירובט, ללא L-גלוטמין</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>DMEM שכבר מכיל L-גלוטמין ניתן להשתמש גם</td></tr><tr><td>בצלחת תרבית רקמות 100 מ"מ, לא מטופלת, מעוקרת, לא פירוגנית</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>ניתן להשתמש בכלים בכל גודל לתליית תרבות טיפה&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי ממדינות מאושרות על ידי USDA, מומת בחום, מסונן סטרילית, נבדק בתרבית תאים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>פישר Scientific</td><td>ICN1680149</td><td>אין צורך אם משתמשים ב-DMEM שכבר מכיל L-גלוטמין&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין מיוצבת, מסוננת סטרילית, עם 10,000 יחידות פניצילין ו-10 מ"ג סטרפטומיצין/מ"ל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>פיברובלסטים עוריים אנושיים, יילודים</td><td>תרמו פישר</td><td>C0045C</td><td>ניתן להחלפה בסוג תא אחר מעניין</td></tr><tr><td>21 גרם x 1 1/2' מחט</td><td>BD&nbsp;</td><td>305167</td><td>22 גרם x 1 1/2 מחטים יעבדו גם</td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>ניתן להשתמש במזרקים בכל נפח</td></tr><tr><td>תרבית תאים צלחות מרובות, פוליסטירן, גריינר ביו-וואן (עטוף באופן אינדיבידואלי) (48 בארות) VWR</td><td></td> <td>82051-004&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פיברינוגן אנושי - פלסמינוגן, פקטור פון ווילברנד ופיברונקטין</td><td>מעבדות מחקר אנזימים</td> מדוללים <td>FIB 3</td><td>ניתן להחליף בחלבון מטריקס מעניין</td></tr><tr><td>מעבדות מחקר אנזימי</td><td>אלפא תרומבין אנושי</td><td>HT 1002a</td><td>ייתכן שלא יהיה צורך בהתאם לחלבון המטריצה המעניין</td></tr> <tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>מכסה המנוע <td></td><td></td><td></td><td>של תרבית תאים BSL2</td></tr><tr><td>חממת</td><td></td><td></td><td></td>תרבית תאים</tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך עם צנטריפוגה אובייקטיבית</td><td></td><td></td><td></td>פי 10</tr><tr><td>תואם לצינורות</td><td></td><td></td><td></td> של 15 מ"ל</tr></tbody></table>

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

כיום, רוב במבחנה מודלים של פצע ריפוי, כגון מבחני מאפס ומבוססת, לערב לומד תא העברה וגמר הסגר על משטחים דו-ממדית. עם זאת, הסביבה פיזיולוגיות אשר ויוו ריפוי הפצע מתקיים הוא תלת מימדי ולא דו מימדי. כעת ברור יותר ויותר בהתנהגות התא משתנה במידה רבה בין מימדי לעומת סביבות תלת-מימדי; לכן, אין צורך יותר מבחינה פיזיולוגית הרלוונטיים במבחנה מודלים עבור לומד התנהגויות ההעברה תא לסגירת הפצע. השיטה המתוארת במסמך זה מאפשר לחקר נדידת תאים במודל תלת-ממדי שמשקף טוב יותר בתנאים פיזיולוגיים מאשר שנקבעו קודם מימדי מבחני מאפס. מטרת מודל זה היא להעריך תא תוצר באמצעות הבחינה של נדידת תאים מהגוף ספרואיד מוטבע בתוך מטריצה פיברין בנוכחות גורמים פרו - או אנטי - migratory. באמצעות שיטה זו, תוצר תא מהגוף ספרואיד במטריצה תלת מימדי יכול להיות שנצפו והוא לכימות בקלות לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופ brightfield וניתוח של ספרואיד הגוף באזור. גם ניתן להעריך את ההשפעה של גורמים פרו-נודדים ו/או מעכבות על נדידת תאים במערכת זו. שיטה זו מספקת חוקרים שיטה פשוטה של ניתוח נדידת תאים הפצע תלת ממדי משויכות מטריצות במבחנה, ובכך מגדילים את הרלוונטיות של חוץ גופית בתוך התא מחקרים לפני השימוש ב- vivo חיה מודלים.

ספרואיד תרבות יכול להיות מנוצל כדי להעריך את ההשפעה של סוכנים pro אנטי הנדידה על ההעברה פיברובלסט במבחנה בהצלחה Spheroids פיברובלסט 3D יכול להיווצר באמצעות תלוי תרבות טיפה על פני תקופה של 72 h (איור 1). בעקבות תקופת תרבות, spheroids מוטמעים בתוך המטריצה קריש דם, עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ brightfield (איור 2). האזורים הראשונית של spheroids (מתואר באיור כמו האזורים ותחום על-ידי גבולות לבן) היו נחושים באמצעות Im...

המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך את ההשפעה של גורמים פרו - ו אנטי - migratory על נדידת תאים בתוך מטריצה תלת מימדי פיברין.

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון את ההשפעה של טיפולים ספציפיים נבחרים על נדידת תאים בתוך פיגום פיברין תלת-ממדי הקשור לפצע. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ריפוי הפצעים, בנוגע לאופן שבו שינויים במבנה רשת הסיבים משפיעים על נדידת תאים לקרישי פיברין באתרי פצעים; היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה פשוטה וניתנת לשחזור לניתוח נדידת תאים בתוך קרישי פיברין בתלת-ממד. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, כיוון שהעברת הספרואידים עשויה להיות מאתגרת.התחילו בחימום של מבחנה עם פיברובלסטים דרמליים אנושיים של רך-נולד קפואים באמבט מים של 37 °C. כאשר התאים เพה הפשירה, אספו אותם באמצעות סבוב (centrifugation) ותלו את המשקע במדיום טרי לפיברובלסטים דרמליים אנושיים של רך-נולד בריכוז של 1 x 10⁶ תאים ל-mL. לאחר מכן, זרעו את התאים בבקבוק תרבית T75 לדגירה של 72 שעות ב-37 °C ו-5% CO2.כאשר התרבית מגיעה ל-80% confluency, נתקו את התאים באמצעות חמישה מיליליטר של trypsin EDTA. לאחר חמש דקות ב-37 degree celsius, נטרלו את ה-trypsin בעזרת חמישה מיליליטר של מצע מחומם וערבבו 40 microliters של תאים עם trypan blue ביחס של 1:1. שמרו מנה של 10 microliter של תאים לצורך ספירה.אספו את התאים על ידי סנטריפוגציה והשעיו מחדש את המשקע בריכוז של 1.25 x 10⁵ תאים למילליטר. לאחר מכן, מלאו את תחתיתה של צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטר בחמישה מיליליטר של PBS סטרילי. לאחר מכן, הפכו את מכסה צלחת הפטרי והוסיפו מספר טיפות של 20 µL מת сусפנזיית התאים אל פני השטח הפנימיים של המכסה.לאחר הנחת כל הטיפות, החזירו את המכסה על הצלחת באופן הפוך, תוך הקפדה שלא להזיז את הטיפות התלויות, והניחו בעדינות את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 degree celsius למשך 72 שעות. בתום הדגירה, הוסיפו 100 microliters של תמיסת קריש לכל ספרואיד לכל באר, בתוך פלטה בעלת 48 בארות, ונערו והקישו בעדינות על הפלטה כדי להבטיח שתערובת קריש הפיברין תכסה את הבאר כולה. הניחו את הפלטה באינקובטור למשך שעה אחת.לאחר ששכבת הקריש התמצקה, יש לוודא את נוכחות הספרואידים בתרבית הטיפה התלויה תחת מיקרוסקופ אור, ולהעביר את הפלטה בעלת 48 הבארים ואת צלחת תרבית הטיפה התלויה למCב (מנשף) לתרבית תאים. הפוך בזהירות את מכסה פטרי the petri dish כדי לגשת לתרביות הטיפה התלויה, והשתמש במזרק של 1 mL המצויד במחט 21 gauge, כדי להעביר טיפה אחת לכל באר מצופה בפיברין. הקפד על זהירות מרבית בעת השאיבה וההשתלה של הספרואידים, שכן השלב הקשה והקריטי ביותר בתהליך הוא העברת הספרואידים מבלי להרוס אותם.בחנו את הפלטה תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהספרואידים נזרעו כראוי בבארים המתאימות. העבירו בעדינות שכבה של 100 microliters של תמיסת קריש שהוכנה טרי על כל טיפה המכילה ספרואיד, ובחנו שוב את הספרואידים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהם עדיין שלמים ונמצאים במרכז כל באר. לאחר מכן, החזירו את פלטת 48 הבארים לאינקובטור כדי לאפשר לשכבת הפיברין השנייה להתפולימר.לאחר שעה אחת, טפלו בכל באר ב-500 microliters של המצע המתאים לקבוצת הספרואידים הניסויית הרלוונטית והחזירו את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 degree celsius. השגיחו תמונות של הספרואידים באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר (bright field microscopy) מדי 24 עד 72 שעות, תוך שימוש ב-z stack לצפייה בחתכים רצופים של תרבית התאים התלת-ממדית. לאחר מכן, בתוכנה המתאימה לניתוח תמונות, התקיפו את גבול התאים של כל ספרואיד בכל נקודת זמן רצופה והשתמשו בפונקציית המדידה (measure function) כדי לקבוע את אחוז העלייה בשטח עבור כל ספרואיד.בעקבות גידולם בנוכחות הסוכן המעודד או המעכב הגירה הנחקר, ניתן לקבוע את השטחים הראשוניים של הספרואידים באמצעות דימוי במיקרוסקופ בשדה בהיר, ולהשתמש בהם כנקודת ייחוס לקביעת מידת צמיחת התאים העוקבת מגופי הספרואידים בכל נקודת זמן רצופה. בניסוי מייצג זה, הספרואידים שנחשפו לסוכן מעודד הגירה הפגינו מידה מוגברת באופן משמעותי של הגירה מהגוף המקורי של הספרואיד, בהשוואה לספרואידים שנחשפו לסוכן מעכב הגירה או לסוכן בקרה. לעומת זאת, הספרואידים שנחשפו לסוכן מעכב הגירה הפגינו מידה מופחתת באופן משמעותי של הגירה מהגוף המקורי של הספרואיד, בהשוואה לספרואידים שעברו טיפול בבקרה.לאחר שליטה בטכניקה, ניתן להשלים אותה תוך שעתיים וחצי, למעול זמן תרבית התאים, במידה והיא מבוצעת כהלכה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לגדל ולהטמיע ספרואידים של תאים עבור בדיקות נדידת תאים תלת-ממדיות במבחנה (in vitro). בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו מבנה רשת הפיברין בתוך הקריש או יישור האקטין בתאי הספרואיד תואמים לנדידת תאים מוגברת או מופחתת.אל תשכחו שעבודה עם תרביות תאים ומחטים עלולה להיות מסוכנת ביותר, וכי יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן מתאים ועבודה תחת מנדף סטרילי, בעת ביצוע הליך זה.

characterizing-cell-migration-within-three-dimensional-vitro-wound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מאמר זה מציג שיטה לתייג קולגן שניתן להשתמש בו גם תיקון נוסף ולהדמית חיה של תרביות תאי 3D fluorescently. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול מותאם לדמיין חלבוני cytoskeletal אנדוגניים של תאים בתרבית בסביבות 3D.

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

בשימוש נפוץ, שיטות נגישות ביותר לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה מתוארות. השיטה הראשונה היא assay סגירת פצע תא המודד את תנועתיות תא. השיטה השנייה היא assay ההגירה והפלישה transwell שמעריך את chemotactic וקיבולת פולשני של תאים.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

מאמר זה מספק מתודולוגיות מפורטות לשימוש במבחנים תלת ממדי (3D) לכמת פלישת תאי סרטן השד. באופן ספציפי, אנו דנים בהליכים הנדרשים להקמת מבחני כאלה, כימות, וניתוח נתונים, וכן שיטות לבדיקת ההפסד של שלמות קרום המתרחש כאשר תאים לפלוש.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

נדידת תאים היא תופעה ביולוגית כי הוא מעורב בשפע של פיסיולוגי, כגון ריפוי פצעים ותגובה חיסונית, ותהליכי pathophysiological, כמו סרטן. Assay הגירת מטריצת 3D-קולגן הוא כלי תכליתי כדי לנתח את מאפייני נדידת תאים מסוגים שונים של מסגרת בסביבה דמוית פיזיולוגית 3D.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

הנכסים ומייקרו של המטריצה ​​תאית מכאניים מאוד משפיעים על הגירת 3D של תאים. שיטה במבחנה ללמוד spatiotemporal התנהגות נדידת תאים בסביבות biophysically משתנים, בשתי רמות אוכלוסייה ותא בודדות, מתואר.

מערכת ג&#39;ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

המחקר מדווח על שתי שיטות שונות לניתוח של הפלישה תא והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן, במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ ריפוי פצע וזמינותו. הפרוטוקולים עבור שני ניסויים אלה מתוארים, היתרונות והחסרונות שלהם מושווים.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

פרוטוקול זה מתאר של assay הפוכה הפלישה אנכי יכול לשמש כדי לכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים בתוך תפאורה תלת מימדי תוך שמירה על microenvironment תא. Assay הזה מתאים תאים נדירים ו/או רגישים.

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

כתב יד זה מתאר איך חתך דמוי נגעים על monolayers בתרבית תאים אפיתל בנוחות דגם פצע ריפוי במבחנה, ומאפשר הדמיה על ידי קונאפוקלית או סריקה מיקרוסקופ לייזר, אשר יכול לספק באיכות גבוהה נתונים כמותיים ואיכותיים ללמוד בהתנהגות התא והן את המנגנונים המעורבים בהעברה.

מיקרוסקופ המבוסס על שיטות להערכה של נדידת תאים אפיתל במהלך במבחנה ריפוי הפצע

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההשפעה של פפטידים על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט. שיטה זו מאפשרת הקניית מהיר ולא מאוד לשחזור נתונים כמותיים על מהירות הסגר ההעברה וגמר התא.

הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת פצעים באפיתל של מדוזה חיה של Clytia hemisphaerica וריפוי פצעים ברזולוציה גבוהה in vivo. בנוסף, מוצגת טכניקה להחדרת צבעים ותרופות להפרעות לתהליכי איתות בתאי האפיתל ובמטריצה החוץ תאית במהלך ריפוי פצעים.

אפיון ריפוי פצעי אפיתל in vivo באמצעות אורגניזם המודל הקנידרי Clytia hemisphaerica

פרוטוקול להערכה כמותית של נדידת תאים תלת מימדיים בתוך ולתוך הממשק של הידרוג'לים גרגירים מוצג כאן.

כימות נדידת תאים תלת מימדית בתוך ובתוך ביו-חומרים הידרוג'ל גרגירים

למדו כיצד לנתח נדידת תאים בתלת מימד במטריצת פיברין לחקר ריפוי פצעים. שיטה זו מאפשרת הערכה של גורמים פרו ואנטי נדידתיים בדגימות אנושיות.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

גלה סרטונים נוספים