מיקרוסקופ המבוסס על שיטות להערכה של נדידת תאים אפיתל במהלך במבחנה ריפוי הפצע

המטרה הכוללת של הליכי פציעה מלאכותית בתרבית תאי אפיתל היא לחקור את נדידת התאים מנקודת מבט כמותית ואיכותית כאחד, המאפשרת הערכה של ההשפעות של טיפולים ספציפיים מעניינים על ריפוי פצעים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ריפוי הפצעים, מכיוון שהן מאפשרות אפיון מדויק של התפקידים של תהליכי נדידה ספציפיים במהלך שיבוש האפיתל. היתרון העיקרי של גישה זו הוא שהיא מאפשרת מתאם בין מדידות נדידת תאים לשינויים בהתנהגות של סמנים מולקולריים רלוונטיים.

ההשלכה של טכניקות אלה משתרעת על טיפול בפצעים קליניים, מכיוון שהיא מציעה הגדרה נוחה לבדיקת תרופות מוקדמת ולסגירת פצעים. בדרך כלל בשיטה זו יתחיל בגלל קשיים בהשגת יכולת שכפול עקבית בפצעים עם דור. לבדיקת שריטות פצע מלאכותי, התחל בזריעת כל באר של צלחת תרבית עם שני מיליליטר של תאי אפיתל מעניינים במדיום שלם.

תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני למשך יומיים-שלושה עד למפגש של 100%. כאשר התאים מוכנים, שטפו את התאים פעמיים במדיום טרי ללא סרום ולאחר מכן 24 שעות של תרבית במדיום טרי ללא סרום. למחרת, הניחו את הצלחת באזור עבודה סטרילי וגררו את הקצה הצר של קצה מיקרו-פיפטה סטרילי על פני תחתית כל באר פעמיים כדי ליצור פצע בצורת צלב.

פער פצע עקבי מושג על ידי הפעלת לחץ קבוע ויציב תוך הזזה חלקה של הקצה לאורך משטח האפיתל. לחץ מוגזם יעוות את הקצה, ויגרום לרדיוס פצע לא סדיר. הסר בעדינות את הסופרנטנט כדי להשליך את התאים המנותקים והוסף בזהירות מדיום טרי ללא סרום לבארות.

באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה המחובר למצלמת מכשיר מצמד מטען, יישר את קצה שדה המיקרוסקופ עם הצומת הסמוך של השריטות כדי לקבל עד ארבע תמונות ייחוס לפני הטיפול של פער השריטות בכל באר. לאחר שכל התמונות נרכשו, החליפו את המדיום בבארות הטיפול הייעודיות במדיום טרי, בתוספת טיפולים נבחרים מעניינים והחזירו את הצלחות לחממת תרבית התאים. כאשר לפחות מצב אחד מגיע לסגירת פער שריטות של כ-90%, החלף בעדינות את הסופרנטנט במיליליטר אחד של ארבעה אחוז פורמלין ב-PBS למשך 15 דקות דגירה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן שטפו בעדינות את התאים עם PBS לפחות שלוש פעמים כדי להסיר עודפי פורמלין ולדמות את הבארות כפי שהודגמו זה עתה, תוך שימוש באותם פרמטרי הדמיה באזורי הייחוס המקוריים שצולמו לאחר השריטה. כדי לנתח את התמונות באמצעות תוכנת עיבוד התמונה המתאימה, פתח את התמונה המוקלטת לפני הטיפול המעניינת ותחת תפריט תמונה, הגדר את סוג התמונה ל-8 סיביות. תחת תפריט תהליך, בחר בתפריט המשנה מסננים והחל סינון שונות.

תחת תמונה תפריט, פתח את התאם תפריט המשנה והגדר את סף לשחור לבן. בתפריט תהליך, בחר בתפריט המשנה בינארי והחל חורי מילוי. בתפריט ניתוח, בחר הגדר מדידות והפעל את האזור.

לאחר מכן צייר את האזור הניתן למדידה, בהתאם לקווי המתאר של הקצוות הנודדים כדי לתחום את הפער. בתפריט Analyze, בחר Analyze Particles ורשום את ערכי השטח הכולל של משטח השטח המצויר. כדי לכמת את הנדידה המוחלטת עבור כל קבוצה של דגימות בודדות כהפרש בין מדידות פני השטח של הפער, ייצא את ערכי שטח הפנים הכולל לפני ואחרי הטיפול לגיליון אלקטרוני ושרטט את תפוקות הכימות.

לבדיקת חזית נדידה מלאכותית, בתנאים סטריליים, הוסף שכבה אחת של עד 33 כיסויים עגולים מעוקרים לתוך לוחות תרבית ריקים של 10 סנטימטרים. כאשר משטח הצלחת מכוסה לחלוטין, זרע בעדינות את תאי האפיתל המעניינים בריכוז המאפשר מפגש של 100% לאחר יומיים או שלושה של תרבית. במידת הצורך, לחץ בעדינות על הכיסויים עם קצה מיקרופיפטה סטרילי כדי למנוע ציפה.

כאשר התאים מגיעים למפגש, החלף את הסופרנטנט במדיום נטול סרום למשך 24 שעות נוספות של תרבית. לאחר מכן, השתמש ב-tweesers סטריליים כדי להעביר בזהירות כיסוי אחד לצלחת חדשה של 10 ס"מ המכילה מדיום טרי ללא סרום, תוך הקפדה להחזיק את הכיסוי לאורך ההיקף שלו. כדי ליצור את הפצעים המלאכותיים, גרור סכין גילוח מעוקר קדימה ואחורה על פני כל כיסוי כדי ליצור קו רוחבי של שלושה עד ארבעה מילימטרים מעל מרכז כל תרבית תאים כדי להסיר לחלוטין את הרצועה החד-שכבתית המרכזית.

הקפד למקם את קצה סכין הגילוח בכבדות על פני משטח הכיסוי בעת ביצוע הפצע כדי להגן מפני צורת קצה לא סדירה ויצירת חלקי אפיתל מתנפנפים. העבירו עד ארבעה כיסויי פצעים, צד התא כלפי מעלה, לבארות בודדות של צלחת שש בארות, המכילות לפחות שני מיליליטר של מדיום נטול סרום ושטפו בעדינות כל באר פעמיים עם מדיום טרי ללא סרום כדי להסיר תאים מנותקים. לאחר שכל התאים המנותקים הושלכו, החלף בעדינות את מדיום הכביסה במדיום טרי בתוספת הטיפולים המעניינים, והנח את הצלחת בחממת תרבית התאים.

בתום תקופת הניסוי המתאימה, יש לתקן את התאים עם ארבעה אחוז פורמלין ב-PBS כפי שהודגם זה עתה, ולצבוע את התאים בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים מתאימים. לאחר מכן דמיין את השינויים המבניים המתרחשים בקצה הקדמי הנודד על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהתאם לפרמטרים הניסיוניים המעניינים. בניסוי זה, פערי הפצע נמדדו לפני ואחרי הטיפול בגורם גדילה אפידרמיס, גורם ידוע לשגשוג ונדידה של תאי אפיתל.

לאחר מכן חושבה הנדידה המוחלטת כהפרש בין שטחי הפנים של הפער לפני ואחרי הטיפול. טיפול בגורם גדילה אפידרמיס מגביר את הדינמיקה של השלד התא כפי שנצפה בתמונות מיקרוסקופ סריקת לייזר אלה של צביעת F-Actin של תאים מגורים של גורם הגדילה. יתר על כן, ביטוי יתר של c-Jun נצפה עם ביטוי מוגבר של החלבון הנראה בתאים הסמוכים לחזית הנודדת.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק את תקינות קצוות הפצע לאיתור דשי תאי אפיתל שעלולים לשבש את כימות הנדידה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך כמותית ואיכותית את התנהגות הנדידה של