Name: הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: חקור תגובות תאיות לגירוי מכני חריף ב-Dictyostelium discoideum באמצעות מיקרוסקופיה וזרימת גזירה. השיטה מאפשרת בחינת תגובות ראשוניות ללא הפרעת ניידות תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק R35 GM118177 PND.

<ol><li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+chemotaxis%3A+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility%2C+directional+sensing%2C+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li>
<li>Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li>
<li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt%2FPKB+during+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li>
<li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell%27s+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li>
<li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3%2C4%2C5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li>
<li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li>
<li>Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li>
<li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li>
<li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves%2C+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li>
<li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li>
<li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+towards+a+paradigm%3A+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li>
<li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li>
<li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+j%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li>
<li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li>
<li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li>
<li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li>
<li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li>
<li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24535823">PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).</li>
<li>Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3381519/">Analysis of chemotaxis in Dictyostelium.</a> Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brenner, M., Thoms, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+blocks+activation+of+cyclic+AMP+synthesis+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum.</a> Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Actin+Patterns+and+Arp2%2F3+Assembly+at+the+Substrate-Attached+Surface+of+Motile+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells.</a> Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).</li>
<li>Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protein+Callipygian+defines+the+back+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).</li>
<li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Akt%2FPKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li>
<li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטות המתוארות כאן מציעים דרך נוחה כדי להעריך את האוכלוסייה והן תא בודד התנהגות בתגובה להטיה זרימה. חשוב, ואילו מחקרים קודמים ניתח לוקליזציה של המוביל, משתרך סמני קצה במהלך ההעברה, הגישה הנוכחית מאפשרת חקירת תופעות מיידית על-ידי החלת זרימת הטיה בחריפות. בשיטה זו אנו הוכיח כי, למעשה, התגובה הראשונית של תאים להטיית הזרימה אינה דורשת נדידת תאים. במקום זאת, התגובה המהירה וחולף הגירוי זרימה הטיה הראשונית מקדים כיווניות ההעברה ראיתי עם חשיפה ממושכת להטיית זרימה, בדומה התגובה הכללית הראשונית עם מעבר צבע chemoattractant.
<p...

ההעברה של התאים האיקריוטים מוטה על ידי רמזים כימיים מגוונים בסביבה, לרבות מעברי צבע של chemoattractants מסיסים או מאוגד המצע, נוקשות משתנה של מצעים, שדות חשמליים או הטיה זרימה. אמנם היו הרבה התקדמות בהבנתנו המנגנונים המולקולריים נהיגה כימוטקסיס, פחות ידוע על סוגים אחרים של ההעברה מכוונת, כמה אותות אלה מגוונים משולבים ברמה התאית לייצר מאוחדת נודדות תגובה.
ביים ההעברה לכיוון הגדלת ריכוז chemoattractant כוללת שלושה מרכיבים התנהגותיים: תנועתיות כיוונית חישה, קטביות1. תנועתיות מתייחס לתנועה אקראית של תאים מושגת על ידי בליטה pseudopod. כיוונים חישה היא היכולת של תא כדי לזהות את מקור chemoattractant, אשר יכול להתרחש אפילו באופן מתאושש תאים. קוטביות מתייחס ההתפלגות סימטרית יציבה יותר של רכיבים תאיים בין המוביל לבין לקרטע קצה תא, מה שמוביל התמדה מוגברת בתנועה.
תגובה תאית chemoattractant תלוי הפעילות של ארבע רשתות בקרה רגולטריות שהוגדר מושגית: קולטן / גרם חלבון, אותות, שלד התא אקטין, קוטביות1. Chemoattractant מחייב לקולטן G-חלבון בשילוב משדר את האות דרך heterotrimeric גרם חלבונים α וβγ לרשת התמרה חושית האות במורד הזרם, אשר מגביר את האות כיוונית. משעולים מרובות בתוך הרשת התמרה חושית אות לפעול במקביל, להאכיל לתוך הרשת שלד התא אקטין פלמור אקטין הסטייה ולאחר חדירת pseudopod הסוגר, בכיוון של מעבר הצבע. חשוב סמביוזה כימוטקסיס נמנים GTPase בראס, TorC2, phosphoinositide 3-קינאז (PI3K) homolog פוספטאז ו- tensin (PTEN), guanylyl cyclase. מנגנוני משוב בתוך הרשת התמרה חושית אות ובין אותות לבין אקטין שלד התא רשתות נוספות להגביר את התגובה. בסופו של דבר, הרשת קוטביות מוגדרת היטב מקבל קלט שלד התא אקטין, בהמשך biases האות התמרה חושית הרשת כדי לקדם את ההעברה מתמיד בכיוון של מעבר הצבע.
הרבה הבנתנו מכניסטית כימוטקסיס התאפשרה בשל התפתחות מתויג fluorescently ביולוגיים עבור רכיבים שונים של רשתות רגולטוריות. הרגולטורים כימוטקסיס רבים יש של התפלגות סימטרית של המולקולה הרגולציה עצמה או הפעילות שלה. לדוגמה, ביולוגיים מזהה הופעלה גרסאות GTPases ראס קטן ולא Rap1 – ראס מחייב תחומים של Raf1 (המכונה "rbd" כאן), RalGDS, בהתאמה – בתרגום כדי בחוד החנית של2,תא chemotaxing3. באופן דומה, PI3K ו phosphatidylinositol המוצר שלה (3,4,5)-טריפוספט (PIP3), המוכר על ידי תחום הומולוגיה (PH) pleckstrin, גם להראות לוקליזציה בחזית תא4,5. לעומת זאת, PTEN 3-פוספטאז, אשר ממירה PIP3 בחזרה אל phosphatidylinositol (4.5)-bisphosphate, רגישה לקצה לקרטע תא6. חשוב, ביולוגיים אלה לשנות שלהם לוקליזציה בתגובה גירוי גלובלית עם chemoattractant. הקצה המוביל סמנים, אשר cytosolic או על קצות בליטות בתא resting, relocalize אל קליפת המוח, ואילו מפגרות סמני קצה, אשר לוקליזציה קורטיקלית נעדרים מכל קצות בליטות בתא resting, הופכים cytosolic לאחר גירוי. ניתוח של התפלגות ביוסנסור בתגובה גירוי גלובלית עם chemoattractant ממזער את התרומה של תנועתיות, קוטביות, אשר פעמים רבות וחיסול התצפיות. גירוי גלובלי או אחיד של השעיה תא עם chemoattractant משמש גם ככלי להערכת שינויים ברמת האוכלוסייה בהפעלת חלבון, לעיתים קרובות זוהה על ידי חלבון זרחון7,8,9 . Assay הביוכימי זה משמש בעיקר כדי להשיג מידע זמני, ואילו מיקרוסקופ משמש לאיסוף מידע זמני והן מרחבי על התנהגותם של רכיבים שונים של רשתות רגולטוריות.
התמרה חושית אות הרשת משלבת תכונות של מערכת טמפרמנט10,11. תגובות לגירויים chemotactic העל-סף "all-or-none", להציג תקופות עקשן. תגובות מופעלות גם stochastically, יכול להראות התנהגות מתנדנדות. האות התמרה חושית אירועים הם נקודתיים לאזורים של קליפת המופצות גלים12,13,14,15. קדימה או אחורה, סמני את הנישה, או מביצועם מתוך, האזורים הפעילים של הגלים כציוד. בשל האזור עקשן נגררים אזור פעיל, הגלים מכוון הפוך להשמיד כאשר הם נפגשים. הגלים התמרה חושית אות כציוד ביסוד בליטות הסלולר המתווכות תא העברה10.
חלק גדול מהמידע הנ על כימוטקסיס הופיע במחקרים אמבה חברתית Dictyostelium discoideum, למרות מנגנונים רגולטוריים דומים חלים גם נויטרופילים, אחרים בתרבית של תאים סוגים16 . Dictyostelium הוא אורגניזם מודל ומבוססת שיש תגובה chemotactic חזקים במהלך רעב, כאשר אלפי תאים בודדים נודדים לכיוון מרכז צבירה, בסופו של דבר יוצרים גוף fruiting multicellular המכיל נבגי. כימוטקסיס חיוני גם בשלב הצמיחה תא בודד של האורגניזם לאיתור מקורות המזון חיידקי. חשוב, נדידה של תאים בודדים Dictyostelium דומה להפליא ההעברה. בתרבית של נויטרופילים או תאי סרטן גרורתי, אשר כולם עוברים העברה מסוג amoeboid מהירה מאוד. למעשה, שני הטופולוגיה הכוללת של רשתות רגולטוריות, כמו גם רבים מן המסלולים התמרה חושית אות בודדת מעורב כימוטקסיס נשמרים בין Dictyostelium בתרבית של לויקוציטים17. יתר על כן, תאים אחרים, כגון fibroblasts, להשתמש קולטן טירוזין kinases (RTK) במקום GPCRs; עם זאת, RTKs עשויים להאכיל לתוך רשתות דומות.
בניגוד כימוטקסיס, הבנה מעמיקה של המנגנונים איתות כי הכונן מצבי שונים של הגירה מכוון לוקה בחסר. בדומה לתאים בהעברה של מעבר הדרגתי chemoattractant מספר מחקרים דיווחו על הפעלה ו/או לוקליזציה של סמנים הקצה המוביל טיפוסי, כולל פלמור אקטין, PIP3 ו/או חוץ-תאית מוסדר אות קינאז (טיפשה) 1/2, ב הקדמי של תאים שעברו ביים ההעברה בתגובה להטיה זרימה או שינוי שדות חשמליים18,19,20,21. עם זאת, במחקרים אלה חשיפה מתמשכת הגירוי הביאה גם נדידת תאים, להשאיר פתוחה את השאלה אם, לדוגמה, הסימונים הקצה המוביל לשפה במיוחד בתגובה לגירוי, או אם הם פשוט להתאים לשפה בחוד בשל עלייה במספר pseudopods בחזית תא נודדים.
פיתחנו מבחני ומאפשרים לנו להתבונן התגובה של התאים חריפה ההפרעות מכני נמסר הטיה זרימה הן ברמת האוכלוסייה וכן תאים בודדים22. דומה גירוי גלובלית עם chemoattractant, stimula חריפהtion בתזרים הטיה מאפשר חקר תגובה תאית גירוי מכני ללא התרומה מבלבלים תנועתיות או קוטביות. שילוב של מבחני הביוכימי, מיקרוסקופית אלו עם לפליטת גנטית או תרופתי מאפשר לנו ללמוד על גירויים מכניים איך נתפסים משודר. יתר על כן, גישה זו מספק גם שיטה עבור הקשה לתוך המערכת במורד הזרם של הקולטן chemoattractant בהיעדר chemoattractant, ובכך לבודד את האות התמרה חושית אקטין שלד התא ורשתות מ הקולטן/G רשת חלבון.
תוך שימוש בטכניקות המתוארות להלן אנו לאחרונה הפגינו שגזירה חריפה הזה מוביל הפעלה של רכיבים מרובים של chemotactic האות התמרה חושית ואני אקטין שלד התא רשתות22. על-ידי החלת את הגירוי המכני חריפה במרווחי זמן שונים, להדגים, באופן דומה כדי chemoattractants, תגובה לגירויים מכני מפגין גם תכונות של מערכת טמפרמנט, כולל ההתנהגות all-or-none של התגובה תחת קולח תנאים ואת נוכחותם של תקופה עקשן. בסופו של דבר, על ידי שילוב של גירוי מכאני וכימי הראינו כי שני הגירויים לשתף האות התמרה חושית אקטין שלד התא ורשתות, המאפשרים סביר לשילוב של גירויים מרובים כדי נדידת תאים הסטייה.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>פישר</td><td>D16-1</td><td>השתמש להכנת מדיה HL-5 וצלחות SM (שלבים 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>פפטון פרוטאוז</td><td>פישר</td><td>DF0120-17-6</td><td>השתמש להכנת מדיה HL-5 (שלב 1.1)</td></tr> <tr><td>תמצית שמרים</td><td>פישר</td><td>50-550-445</td><td>השתמש להכנת מדיה HL-5 וצלחות SM (שלבים 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td><td>השתמש להכנת מדיה HL-5, ומאגר פוספט 10X (שלבים 1.1, 1.3)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>השתמש להכנת מדיה HL-5, לוחות SM ומאגר פוספט 10X (שלבים 1.1-1.3)</td></tr> <tr><td>סטרפטומיצין (דיהידרוסטרפטומיצין סולפט)</td><td>פישר</td><td>ICN10040525</td><td>השתמש להכנת מדיה HL-5 (שלב 1.1)</td></tr><tr><td>פפטון (Bacto)</td><td>Fisher</td><td>DF0118-17-0</td><td>השתמש להכנת צלחות SM (שלב 1.2)</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>השתמש להכנת צלחות SM (שלב 1.2)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>השתמש להכנת צלחות SM (שלב 1.2)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>השתמש להכנת DB Buffer (שלב 1.4)</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>השתמש להכנת DB Buffer (שלב 1.4)</td></tr><tr><td>קפאין</td><td>פישר</td><td>O1728-500</td><td>השתמש להכנת קפאין (שלב 1.5)</td></tr><tr><td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 רגל, 5 רגל-מונופוספט מחזורי, מלח נתרן)</td><td>פישר</td><td>11-680-1100MG</td><td>השתמש להכנת cAMP (שלב 1.6)</td></tr><tr><td>חומצה פולית</td><td>Sigma</td><td>F7876</td><td>השתמש להכנת פוליק חומצה (שלב 1.7)</td></tr><tr><td>בסיס טריס</td><td>פישר</td><td>BP152-500</td><td>השתמש להכנת מאגר דגימה 3X (שלב 1.8)</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>פישר</td><td>BP166-500</td><td>השתמש להכנת מאגר דגימה 3X (שלב 1.8)</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר</td><td>G33-500</td><td>השתמש להכנת מאגר דגימה 3X (שלב 1.8)</td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>השתמש להכנת מאגר דגימה 3X (שלב 1.8)</td></tr><tr><td>1610404 Bio-Rad</td><td></td> <td>כחול ברומופנול</td><td>השתמש להכנת מאגר דגימה 3X (שלב 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>השתמש להכנת מאגר דגימה עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז (שלב 1.8)</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>השתמש להכנת מאגר דגימה עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז (שלב 1.8)</td></tr><tr><td>נתרן פירופוספט דקהידראט</td><td>פישר</td><td>S390-500</td><td>השתמש להכנת מאגר דגימה עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז (שלב 1.8)</td></tr> <tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז שלם ללא EDTA (Roche)</td><td>Sigma</td><td>11873580001</td><td>השתמש להכנת מאגר דגימה עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז (שלב 1.8)</td></tr><tr><td>Latrunculin A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td>השתמש להכנת Latrunculin A (שלב 1.9)</td></tr><tr><td>4-15% Tris-HCl פוליאקרילאמיד ג'ל</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>3450029 שימוש לאימונובלטינג (שלב 3.3)</td></tr> <tr><td>ממברנת פלואוריד פוליווינילידן</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>1620177 שימוש לאימונובלוטינג (שלב 3.3)</td></tr> <tr><td>פוספו-PKC (פאן) (zeta Thr410) (190D10) נוגדן ארנב</td><td>איתות תאים</td><td>2060</td><td>נוגדן ראשוני לשימוש באימונובלטינג (שלב 3.3)</td></tr> <tr><td>פוספו-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) נוגדן XP</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>נוגדן ראשוני לשימוש באימונובלטינג (שלב 3.3)</td></tr> <tr><td>ארנב IgG HRP מקושר לכל הבטן (מחמור)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>נוגדן משני לשימוש באימונובלטינג (שלב 3.3)</td></tr> <tr><td>מצע כימילומינסנציה משופר (Clarity Western ECL Substrate)</td> <td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>לשימוש לאימונובלטינג (שלב 3.3)</td></tr><tr><td>מאגר הפשטה (שחזור פלוס מאגר הפשטת כתמים מערביים)</td><td>פירס</td><td>PI46430</td><td>שימוש לאימונובלטינג (שלב 3.3)</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Fisher</td><td>PI20278</td><td>שימוש לאימונובלטינג (שלב 3.3)</td></tr><tr><td>K. aerogenes strain (לא פתוגני)</td><td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שם<</td><td>strong>חברה</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materials and Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker (דגם G-33, או חלופה דומה)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Use כדי לגדל K. aerogenes (שלב 2.1.1), ולבזל ולעורר תאי D. discoideum (שלב 3). רדיוס הסיבוב של שייקר זה הוא 9.5 מ"מ.</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 10 ס"מ</td><td>פישר</td><td></td><td>FB0875712 השתמש להכנת צלחות SM (שלב 1.2)</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>פישר</td><td>02-671-51B</td><td>השתמש לספירת תאים D. discoideum תאים (שלב 2.1.2)</td></tr><tr><td>צלחת 35 מ"מ (צלחת תרבית רקמות Corning Falcon Easy-Grip)</td><td>פישר</td><td>08-772A</td><td>השתמש בצלחת D. discoideumתאים לגירוי מכני ואחריו ליזה של תאים (שלב 3.1.1)</td></tr><tr><td>פוליסטירן (5 מ"ל)</td><td>VWR</td><td>13915-985</td><td>השתמש כדי לעורר D. discoideum תרחיף תאים עם חומר כימואטרקטיבי (שלב 3.2.2)</td></tr><tr><td>יחידה נוזלית עם משאבה (מערכת משאבת ibidi)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td>השתמש כדי לספק גירוי מכני לתאי D. discoideum בתעלה (שלבים 4.1, 4.2 ו-5)</td></tr><tr><td>שקופית עם תעלה (&mu;-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 כיסוי פולימר, תרבית רקמות מטופלת, מעוקרת)</td><td>Ibidi</td><td>80316</td><td>השתמש לצלחת D. discoideum תאים לגירוי מכני המועבר על ידי מכשיר נוזלי (שלבים 4.1, 4.2 ו-5)</td></tr><tr><td>מאגרי 50 מ"ל (מחזיק מאגר איבידי ליחידה נוזלית)</td><td>Ibidi</td><td>10978</td><td>השתמש כדי להגדיר את המכשיר הנוזלי להעברת גירוי מכני לתאי D. discoideum בתעלה (שלבים 4.1, 4.2 ו-5)</td></tr><tr><td>קווים ליחידת הנוזל (סט זלוף צהוב וירוק)</td><td>Ibidi</td><td>10964</td><td>השתמש כדי להגדיר את המכשיר הנוזלי להעברת גירוי מכני לתאי D. discoideum בתעלה (שלבים 4.1, 4.2 ו-5). הערה: ניתן לחתוך את שני הקווים גם מצינור 1.6 מ"מ (מספר קטלוגי 10842).</td></tr><tr><td>קו לניקוז (צינורות ID 1.6 מ"מ)</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td>השתמש כדי להגדיר את המכשיר הנוזלי להעברת גירוי מכני לתאי D. discoideum בתעלה (שלבים 4.1, 4.2 ו-5).</td></tr><tr><td>Zeiss Observer.Z1 מיקרוסקופ הפוך המצויד במטרת שמן 40X/1.3 ומטרת אוויר 20X/0.3 (או חלופה דומה)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>משמש להדמיית תאים D. discoideum עם ניגודיות פאזה או תאורה פלואורסצנטית (שלבים 4 ו-5)</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב UltraView מצויד ב-40&/1.25&ndash; 0.75 מטרת שמן (או חלופה דומה)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>DM 16000</td><td>חלופה המשמשת להדמיית תאי D. discoideum (שלב 4.1.4)</td></tr><tr><td>FemtoJet Microinjector (Eppendorf; דגם 5247, או חלופה דומה) עם Eppendorf InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021D ו-5192000027</td><td>השתמש כדי לספק גירוי מכני לתאי D. discoideum על ידי מיקרופיפטה (שלב 4.3). הערה: המספר הקטלוגי הוא עבור הגרסה החדשה ביותר של הציוד (4i).</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה (פמטוטיפ; 1 &mu; קוטר חיצוני מ', 0.5 &mu; m קוטר פנימי )</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td>השתמש כדי לספק גירוי מכני לתאי D. discoideum על ידי מיקרופיפטה (שלב 4.3)</td></tr> <tr><td>קצות מיקרו-מעמיס (טיפים של Eppendorf Femtotips Microloader עבור Femtojet Microinjector)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>השתמש למילוי המיקרופיפטה (femtotip) במאגר (שלב 4.3.1)</td></tr><tr><td>תא 1-באר (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td><td>פישר</td><td>12-565-472</td><td>השתמש בצלחת תאי D. discoideum לגירוי מכני המועבר על ידי מיקרופיפטה (שלב 4.3.2)</td></tr><tr><td>תא 8 בארות (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)פישר</td><td></td> <td>12-565-338</td><td>השתמש בצלחת תאי D. discoideum לגירוי מכני המסופק על ידי הוספת מאגר בתפזורת (שלב 4.4.1)</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis Software (Fiji)</td><td>NIH</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>השתמש כדי לכמת תגובה לגירוי מכני (שלב 4.5)</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח הגירה (Tracking Tool PRO)</td><td>Gradientech</td><td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td> <td>השתמש כדי לכמת את מהירות התא וההתמדה (שלב 5.4)</td></tr></tbody></table>

הערכה של dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

כימוטקסיס, או העברה את הדרגה של chemoattractant, הוא מצב הבין בצורה הטובה ביותר של ההעברה מכוונת. מחקרים באמצעות אמבה חברתית Dictyostelium discoideum גילה כי מורכבות האות התמרה חושית רשת של מסלולים מקבילים מגביר את התגובה chemoattractants, מוביל פלמור אקטין משוחד בליטה של פסאודופוד ב הכיוון של מעבר צבע. לעומת זאת, המנגנונים המולקולריים נהיגה סוגים אחרים של ההעברה מכוונת, לדוגמה, עקב חשיפה להטיית זרימה או שדות חשמליים, לא ידועים. הרגולטורים רבים כימוטקסיס התערוכה לוקליזציה המובילים או לקרטע קצה תא נודדים, כמו גם להציג שינויים חולף לוקליזציה או הפעלת בעקבות גירוי גלובלית עם chemoattractant. כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של סוגים אחרים של ההעברה מכוונת פיתחנו שיטה המאפשרת בחינת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני המבוסס על חשיפה קצר (2-5 s) להטיית זרימה. יכול להיות מועברת לגירוי הזה בערוץ תוך הדמיה תאים המבטאים שכותרתו fluorescently ביולוגיים לבחון התנהגות תא בודד. בנוסף, האוכלוסייה התא יכול להיות מגורה צלחת, lysed, ו immunoblotted באמצעות נוגדנים לזהות גירסאות פעיל של חלבונים עניין. על ידי שילוב שני מבחני, ניתן לבחון מגוון רחב של מולקולות מופעל על ידי שינויים לוקליזציה subcellular ו/או זירחון. בשיטה זו אנו נקבע כי גירוי מכני חריפה מפעיל הפעלה של התמרה חושית האות chemotactic ורשתות שלד התא אקטין. היכולת לבחון תגובות תאית חריפה גירוי מכני חשוב להבנת האירועים ייזום הכרחי עבור גזירה זרימה-induced תנועתיות. גישה זו מספקת גם כלי לימוד chemotactic האות התמרה חושית הרשת ללא השפעת מבלבלים הקולטן chemoattractant.

זמני תגובה של הרגולטורים כימוטקסיס גירוי מכני חריפה
כדי להעריך את התגובה של תאי discoideum ד כדי גירוי מכני, תאים מצבור המוסמכים חסיד נחשפו דופק קצרה של זרימה הטיה. צבירת-כשיר ד discoideum תאים מפרישים מחנה, אשר יכול להיות חש על ידי תאים שכנים. כדי להתגבר על התרומה של איתות התא-התא, תאים טופלו קפאין, אשר מעכב cyclase adenylyl ב discoideum ד , וכך מונע את הפרשת המחנה28. אכן, תאים טר...

כאן נתאר שיטות להערכת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני. ב וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה, אנו בוחנים לוקליזציה של ביולוגיים שכותרתו fluorescently בעקבות גירוי קצרה עם הטיה זרימה. אנחנו גם בדיקת ההפעלה של חלבונים שונים עניין בתגובה חריפה גירוי מכני מבחינה ביוכימית.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את פעילותם של רכיבים שונים ברשת העברת האותות התוך תאית לאחר הפרעה מכנית קצרה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום נדידת התאים כגון כיצד תאים חשים ונודדים בכיוון לעבר רמזים סביבתיים מגוונים כולל גירויים מכניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת בחינה של התגובה הראשונית לגירוי מכני ללא התרומה המבלבלת של תנועתיות או קוטביות לתגובה.הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר בדקנו את התגובה של תאים דבקים לחומר כימואטרקטיבי שהועבר בתסיסה קלה והבחנו בתגובה חזקה של תאים מגורים עם בקרת רכב. כדי להתחיל, הכינו את Klebsiella aerogenes על ידי חיסון מספר קטן של תאים ממלאי קפוא למדיום HL5 ללא אנטיביוטיקה ודגירת התרבית למשך הלילה. גידול של Dictyostelium בנוכחות חיידקי Klebsiella aerogenes יפחית את מספר המקרופינוזומים אשר ישפר את תגובת התאים לגירויים חיצוניים.תזמנו את הניסוי כך שכאשר החיידקים יהיו מוכנים, יהיו דיקטיוסטליום שגדלים באופן אקספוננציאלי. אסוף את תאי הדיקטיוסטליום הללו וספור אותם באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, מורחים 260 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים המכיל 100,000 תאי דיקטיוסטליום על צלחת SM.גם לביטוח, הכינו צלחות עם פי שניים וחצי תאי דיקטיוסטליום. לאחר יום אחד של גידול בטמפרטורת החדר, הפוך את הצלחת והמשך בתרבית הצלחת עד שתאי הדיקטיוסטליום מתחילים לנקות את הדשא החיידקי אך עדיין לא התחילו להצטבר. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של מאגר DB לצלחת וגרד את הדיקטיוסטליום באמצעות מפזר זכוכית.העבירו את התאים והתמיסה לצינור פוליפרופילן של 50 מיליליטר, ואז שטפו את הצלחת בחמישה מיליליטר נוספים של DB והוסיפו גם את זה לצינור של 50 מיליליטר. חזור על הפעולה במידת הצורך. כדי לשטוף את הדיקטיוסטליום, יש למלא את הצינור עד 50 מיליליטר עם DB, לגלול את התאים ואז לשאוב ולהשליך את הסופרנטנט.שטפו את התאים שוב ושוב עד שהסופרנטנט צלול. לבסוף, השעו מחדש את הדיקטיוסטליום במאגר DB לכחמישה מיליון תאים למיליליטר. כדי להתחיל, צלח שני מיליון דיקטיוסטליום בעל יכולת צבירה על צלחות של 35 מילימטר עם שני מיליליטר DB. הכן צלחת אחת לכל נקודת זמן וביקורת ללא גירוי.בטמפרטורת החדר, אפשר לתאים 10 דקות להיצמד לצלחת. לאחר מכן, שטפו את התאים הלא מחוברים מהצלחת באמצעות שתי שטיפות עם מיליליטר אחד של DB. לאחר ניקוי הצלחות מדיקטיוסטליום לא מחובר, דגרו את התאים המחוברים במאגר הבזולציה למשך 30 דקות מבלי להפריע לצלחות. חשוב מאוד להימנע מכל תזוזה של הצלחות במהלך הדגירה של חצי שעה כדי למנוע גירוי מוקדם של התאים.כעת, כדי להפעיל כמות מבוקרת של גירוי מכני, העבירו בנפרד צלחת לשייקר מסלולי והפעילו את השייקר ב-150 סל"ד למשך חמש שניות. לאחר מכן, לאחר הזמן הרצוי, שאפו את המאגר והניחו מיד את הצלחת על קרח. הוסף מיד 100 מיקרוליטר של מאגר דגימה עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז וגרד את התאים.אוספים את הליזאט לצינורות של 1.5 מיליליטר ומחממים אותם מיד בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. המשך בניתוח הליזאט או העבר אותם למינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון. לאחר ביצוע תרחיפים של תאים צמחיים או בעלי יכולת צבירה, טען כ-600 מיקרוליטר לתוך מגלשת התא המיקרופלואידית.יש למלא את הכניסות לחלוטין אז מלאו אותם במאגר במידת הצורך. אפשר לתאים להתחבר למשך 10 דקות. חבר קו קלט למכשיר למשאבה אלקטרונית עם מאגר של 15 מיליליטר.באמצעות בקרת תוכנה למשאבה, סגור את השסתום ולאחר מכן מלא את המאגר ב- DB. כעת, הגדר את הלחץ ל 50 מיליבר והפעל את המשאבה. מלאו ושטפו את הקו עם DB על ידי לחיצה על השסתום כדי לפתוח אותו. לאחר שטיפה של כ -30 שניות, סובב את הלחץ בחזרה לאפס ולאחר מכן סגור את השסתום.לאחר מכן, חבר את הקו לאחד משלושת הכניסות בצד אחד של השקופית. אין ללכוד בועות אוויר ולאחר יצירת החיבור, כסה את שני הכניסות האחרות בצד זה של המגלשה. כעת, השלם את ההתקנה על ידי חיבור הקו מהניקוז לשקע היחיד בצד הנגדי של המגלשה.לאחר מכן, תחת תאורת שדה בהיר או פאזה במיקרוסקופ פלורסנט, צפה בתעלה עם מטרת אוויר פי 20 ושטוף את התעלה. לאחר מכן, הגדר את הלחץ לכ- 50 מיליבר ופתח את השסתום. לאחר שהנוזל יוצא מהניקוז, הפחיתו את הלחץ החיצוני לאפס, המתינו כ-30 שניות וסגרו את השסתום.לאחר מכן, עבור למטרת השמן 40X, התמקד בחלק הרחב ביותר של הערוץ והכן את התוכנה לאיסוף תמונות כל שלוש שניות עם תאורת RFP או GFP. כשהשסתום סגור, הגדר את הלחץ לערך הרצוי. לאחר מכן, רכשו חמש תמונות לפני הגירוי במרווחים של שלוש שניות.לאחר מכן, פתח לזמן קצר את השסתום כדי לספק את הגירוי. כעת, אסוף לפחות 15 פריימים נוספים של נתונים במשך 45 שניות. כמת את התגובה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.ראשית, טען שקופית מיקרופלואידית עם דיקטיוסטליום כמתואר בסעיף הקודם. עבור ניסוי זה, הכינו שני קווי קלט. כדי לסגור את הקווים, השתמש במהדק פיזי על הקו הנושא את תמיסת הטיפול ובשסתום הנשלט על ידי תוכנה כדי לסגור את הקו הנושא את תמיסת DB עם הרכב.כעת, מלאו את שני הקווים בתמיסה המתאימה, בופר פלוס רכב בלבד או חוצץ עם טיפול כגון מעכב. לאחר שטיפת הקווים, חבר אותם לשני כניסות בצד המגלשה עם התעלה וכסה את הכניסה שאינה בשימוש. לאחר מכן, חבר את קו הניקוז לשקע בצד הנגדי.כעת, שטפו את המגלשה באמצעות רכב המאגר פלוס כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, מלאו את התעלה בטיפול. ראשית, צמצם את הזרימה לאפס מיליבר.לאחר מכן, החלף את השסתומים, הזרם את הטיפול למשך כ-15 שניות והתחל לתזמן את הדגירה. כל 10 דקות בערך, הזרימו תמיסת טיפול טרייה על התאים למשך כ-15 שניות כדי לחדש את רמות החמצן בתא. תאים בעלי יכולת צבירה נצמדת נחשפו לחמש שניות של זרימת גזירה באמצעות שייקר מסלולי.הדיקטיוסטליום טופלו מראש בקפאין כדי להפחית את פעילותם הבסיסית. כתוצאה מכך, הייתה פעילות בסיסית נמוכה מאוד של PKBR1 ו-ERK2 ועלייה חזקה בזרחון של שאריות המפתח של קינאזות אלה עם הגירוי. בתאים בעלי יכולת צבירה המבטאים חיישנים ביולוגיים שונים בעלי תווית פלואורסצנטית, שני סמני קצה מובילים, PHcrac ו-LimE, שגויסו על ידי PIP3 או אקטין מפולימר חדש, שניהם הראו בעיקר לוקליזציה ציטוזולית בתאים במנוחה.לאחר חמש שניות של זרימת גזירה, החיישנים הביולוגיים הללו התמקמו במהירות בקליפת המוח וחזרו לציטוזול. ההשפעות של תרופה לדה-פולימריזציה של אקטין Latrunculin A נבדקו באמצעות ניסוי כוח גזירה דומה. במקרה זה, תאים צמחיים נחשפו תחילה לתנאי בקרה ולאחר מכן עברו למאגר שהכיל את חומר הבדיקה הרצוי.טיפול בלטרונקולין A חסם את הלוקליזציה מחדש של סמני הקצה המובילים לקליפת המוח. באופן מעניין, אם הזרימה לא הופסקה לאחר שתי שניות אלא נשארה דולקת למשך הניסוי, עדיין נצפתה תגובה גלובלית חולפת. בעקבות התגובה הגלובלית, תאים צמחיים נדדו נגד הזרם.הכנה נכונה של תאים חשובה ביותר להצלחת הבדיקות הללו. יש לגדל תאים וגטטיביים בשיתוף עם חיידקים כדי להבטיח את תגובתם לגירוי מכני. עבור תאים בעלי יכולת צבירה, תאים שאינם מפותחים או מפותחים יתר על המידה, נוטים להגיב בצורה גרועה.גישות ביוכימיות ומיקרוסקופיות משלימות זו את זו וזה איפשר לנו להעריך מספר רב של מתווכי העברת אותות לתגובתם לגירוי מכני. על ידי הוספת הפרעות פרמקולוגיות כמו גם גנטיות, אנו יכולים ללמוד כיצד גירויים מכניים נתפסים ומועברים. זה חשוב להבנת נדידת תאים מכוונת המונחית על ידי גירויים פיזיים כגון זרימת גזירה.מכיוון שגירוי מכני מפעיל הפעלה של אותה רשת העברת אותות כמו כימותרפיה, אנו יכולים כעת לבחון את האינטגרציה של גירויים שונים בתאים. בסופו של דבר, מחקרים אלה יעזרו לנו להבין כיצד תאים נודדים כמו תאי החיסון שלנו ותאי סרטן גרורתיים מנווטים בגוף.

assessment-dictyostelium-discoideum-response-to-acute-mechanical

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

יישום electrophysiology כדי סינפסות נגיש מספק מדד לכימות הפעילות הסינפטית, שימושי בניתוח מוטנטים הסינפטי. מאמר זה מתאר שיטה לנתיחה נהג לחשוף את בצמתים neuromuscular (NMJ)...

הביתור, הקלטה מ צומת C. elegans Neuromuscular

מאמר זה נועד להדריך את הקורא בפעולה של כוח אטומי משולב אופטי מיקרוסקופ הדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבות. פרוטוקול צעד אחר צעד מוצג. נתונים נציג קבוצה שמראה תא חי בתגובה לגירוי מכני מוצג.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

דלקת של הערמונית עלולה להיות גורם תורם בתיווך כאב באגן בערמונית כרונית. אנו מתארים את הליך ההכנה של בידוד חיידקים טופל, החדרה של חיידקים לתוך השופכה של עכברי זכרים ומתודולוגיה למדידת allodynia מישוש בעכברים לאורך זמן.

מדידה של Allodynia משושים בדגם Murine של ערמונית קטריאלי

פרוטוקול מתואר המשתמש אנוקסיה / רעב בג elegans למודל איסכמיה / reperfusion. תוצאות תפקודיות כוללות תמותה מוגברת, ליקויים גלויים בתהליכים עצביים-GFP שכותרתו, ותגובות התנהגותיות לקויים הדורשות תפקוד עצבי.

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

סרטון זה מדגים פרוטוקול לביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של סיב יחיד על הכנת עצב המעי הגס של עכבר במבחנה.

באפיון פונקציונלי מבחנה של עכבר המעי הגס מביא Endings

השימוש מותאם "צ'יפ חוש הריח" עבור ההדמיה סידן יעיל של C. elegans זכרים מתואר כאן. מחקרים של חשיפה זכר גליצרול פרומון מוצגים גם.

באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans

תפקוד חושי חריג ביסוד הקרביים כאב ותסמינים אחרים של מחלות מעיים דלקתיות פונקציונלי. פרוטוקול עבור ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות של העצבים מביא חוקן בהכנה ex-vivo עכברוש colorectum מוצג כאן.

במבחנה אפיון של המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של סיבי מביא שטיפת המעי הגס בחולדות

כלים חדשים למחקר mechanobiology יש צורך להבין כיצד מכאניים מפעילה מסלולים ביוכימיים, מעורר תגובות ביולוגיות. כאן, אנחנו ראווה שיטה חדשה עבור סלקטיבית גירוי מכני של חיות קיבוע עם מלכודת microfluidic ומאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תגובות הסלולר.

שימוש בהתקן מיקרופלואידיקה גירוי מכני, רזולוציה גבוהה הדמיה של C. elegans

פיתחנו assay מבוססי לזיהוי של עיצוב רב טוב עבור בודק את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד. Assay הזה הוא תואם cytometry זרימה immunostaining, מיקרוסקופ כוח המתיחה, המאפשרות מדידות כמותיים של אינטראקציות biomechanical בין תאים, מטריצה חוץ-תאית, לבין חיידקים פתוגניים.

Assay מבוססי לזיהוי עיצוב רב טוב ללמוד את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד

כוחות מכניים חשובים לשליטה בהעברת תאים. פרוטוקול זה מדגים את השימוש של הידרוג'לים אלסטיים שיכולים להיות מעוותים באמצעות מיקרופיפטה זכוכית מיקרומניפולציה כדי לגרות תאים עם מעבר קשיות מקומי כדי לעורר שינויים במבנה התא והגירה.

מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

מטרת פרוטוקול זה היא להראות כיצד לבצע בדיקה משופרת עבור nociception מכני בזחלים Drosophila. אנו משתמשים בהסמכה כאן כדי להדגים כי רגישות יתר מכנית (allodynia והיפרלגזיה) קיימת בזחלים דרוזופילה.

מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה

חקור תגובות תאיות לגירוי מכני חריף ב-Dictyostelium discoideum באמצעות מיקרוסקופיה וזרימת גזירה. השיטה מאפשרת בחינת תגובות ראשוניות ללא הפרעת ניידות תאית.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

גלה סרטונים נוספים