הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את פעילותם של רכיבים שונים ברשת העברת האותות התוך תאית לאחר הפרעה מכנית קצרה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום נדידת התאים כגון כיצד תאים חשים ונודדים בכיוון לעבר רמזים סביבתיים מגוונים כולל גירויים מכניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת בחינה של התגובה הראשונית לגירוי מכני ללא התרומה המבלבלת של תנועתיות או קוטביות לתגובה.

הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר בדקנו את התגובה של תאים דבקים לחומר כימואטרקטיבי שהועבר בתסיסה קלה והבחנו בתגובה חזקה של תאים מגורים עם בקרת רכב. כדי להתחיל, הכינו את Klebsiella aerogenes על ידי חיסון מספר קטן של תאים ממלאי קפוא למדיום HL5 ללא אנטיביוטיקה ודגירת התרבית למשך הלילה. גידול של Dictyostelium בנוכחות חיידקי Klebsiella aerogenes יפחית את מספר המקרופינוזומים אשר ישפר את תגובת התאים לגירויים חיצוניים.

תזמנו את הניסוי כך שכאשר החיידקים יהיו מוכנים, יהיו דיקטיוסטליום שגדלים באופן אקספוננציאלי. אסוף את תאי הדיקטיוסטליום הללו וספור אותם באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, מורחים 260 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים המכיל 100,000 תאי דיקטיוסטליום על צלחת SM.

גם לביטוח, הכינו צלחות עם פי שניים וחצי תאי דיקטיוסטליום. לאחר יום אחד של גידול בטמפרטורת החדר, הפוך את הצלחת והמשך בתרבית הצלחת עד שתאי הדיקטיוסטליום מתחילים לנקות את הדשא החיידקי אך עדיין לא התחילו להצטבר. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של מאגר DB לצלחת וגרד את הדיקטיוסטליום באמצעות מפזר זכוכית.

העבירו את התאים והתמיסה לצינור פוליפרופילן של 50 מיליליטר, ואז שטפו את הצלחת בחמישה מיליליטר נוספים של DB והוסיפו גם את זה לצינור של 50 מיליליטר. חזור על הפעולה במידת הצורך. כדי לשטוף את הדיקטיוסטליום, יש למלא את הצינור עד 50 מיליליטר עם DB, לגלול את התאים ואז לשאוב ולהשליך את הסופרנטנט.

שטפו את התאים שוב ושוב עד שהסופרנטנט צלול. לבסוף, השעו מחדש את הדיקטיוסטליום במאגר DB לכחמישה מיליון תאים למיליליטר. כדי להתחיל, צלח שני מיליון דיקטיוסטליום בעל יכולת צבירה על צלחות של 35 מילימטר עם שני מיליליטר DB. הכן צלחת אחת לכל נקודת זמן וביקורת ללא גירוי.

בטמפרטורת החדר, אפשר לתאים 10 דקות להיצמד לצלחת. לאחר מכן, שטפו את התאים הלא מחוברים מהצלחת באמצעות שתי שטיפות עם מיליליטר אחד של DB. לאחר ניקוי הצלחות מדיקטיוסטליום לא מחובר, דגרו את התאים המחוברים במאגר הבזולציה למשך 30 דקות מבלי להפריע לצלחות. חשוב מאוד להימנע מכל תזוזה של הצלחות במהלך הדגירה של חצי שעה כדי למנוע גירוי מוקדם של התאים.

כעת, כדי להפעיל כמות מבוקרת של גירוי מכני, העבירו בנפרד צלחת לשייקר מסלולי והפעילו את השייקר ב-150 סל"ד למשך חמש שניות. לאחר מכן, לאחר הזמן הרצוי, שאפו את המאגר והניחו מיד את הצלחת על קרח. הוסף מיד 100 מיקרוליטר של מאגר דגימה עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז וגרד את התאים.

אוספים את הליזאט לצינורות של 1.5 מיליליטר ומחממים אותם מיד בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. המשך בניתוח הליזאט או העבר אותם למינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון. לאחר ביצוע תרחיפים של תאים צמחיים או בעלי יכולת צבירה, טען כ-600 מיקרוליטר לתוך מגלשת התא המיקרופלואידית.

יש למלא את הכניסות לחלוטין אז מלאו אותם במאגר במידת הצורך. אפשר לתאים להתחבר למשך 10 דקות. חבר קו קלט למכשיר למשאבה אלקטרונית עם מאגר של 15 מיליליטר.

באמצעות בקרת תוכנה למשאבה, סגור את השסתום ולאחר מכן מלא את המאגר ב- DB. כעת, הגדר את הלחץ ל 50 מיליבר והפעל את המשאבה. מלאו ושטפו את הקו עם DB על ידי לחיצה על השסתום כדי לפתוח אותו. לאחר שטיפה של כ -30 שניות, סובב את הלחץ בחזרה לאפס ולאחר מכן סגור את השסתום.

לאחר מכן, חבר את הקו לאחד משלושת הכניסות בצד אחד של השקופית. אין ללכוד בועות אוויר ולאחר יצירת החיבור, כסה את שני הכניסות האחרות בצד זה של המגלשה. כעת, השלם את ההתקנה על ידי חיבור הקו מהניקוז לשקע היחיד בצד הנגדי של המגלשה.

לאחר מכן, תחת תאורת שדה בהיר או פאזה במיקרוסקופ פלורסנט, צפה בתעלה עם מטרת אוויר פי 20 ושטוף את התעלה. לאחר מכן, הגדר את הלחץ לכ- 50 מיליבר ופתח את השסתום. לאחר שהנוזל יוצא מהניקוז, הפחיתו את הלחץ החיצוני לאפס, המתינו כ-30 שניות וסגרו את השסתום.

לאחר מכן, עבור למטרת השמן 40X, התמקד בחלק הרחב ביותר של הערוץ והכן את התוכנה לאיסוף תמונות כל שלוש שניות עם תאורת RFP או GFP. כשהשסתום סגור, הגדר את הלחץ לערך הרצוי. לאחר מכן, רכשו חמש תמונות לפני הגירוי במרווחים של שלוש שניות.

לאחר מכן, פתח לזמן קצר את השסתום כדי לספק את הגירוי. כעת, אסוף לפחות 15 פריימים נוספים של נתונים במשך 45 שניות. כמת את התגובה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

ראשית, טען שקופית מיקרופלואידית עם דיקטיוסטליום כמתואר בסעיף הקודם. עבור ניסוי זה, הכינו שני קווי קלט. כדי לסגור את הקווים, השתמש במהדק פיזי על הקו הנושא את תמיסת הטיפול ובשסתום הנשלט על ידי תוכנה כדי לסגור את הקו הנושא את תמיסת DB עם הרכב.

כעת, מלאו את שני הקווים בתמיסה המתאימה, בופר פלוס רכב בלבד או חוצץ עם טיפול כגון מעכב. לאחר שטיפת הקווים, חבר אותם לשני כניסות בצד המגלשה עם התעלה וכסה את הכניסה שאינה בשימוש. לאחר מכן, חבר את קו הניקוז לשקע בצד הנגדי.

כעת, שטפו את המגלשה באמצעות רכב המאגר פלוס כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, מלאו את התעלה בטיפול. ראשית, צמצם את הזרימה לאפס מיליבר.

לאחר מכן, החלף את השסתומים, הזרם את הטיפול למשך כ-15 שניות והתחל לתזמן את הדגירה. כל 10 דקות בערך, הזרימו תמיסת טיפול טרייה על התאים למשך כ-15 שניות כדי לחדש את רמות החמצן בתא. תאים בעלי יכולת צבירה נצמדת נחשפו לחמש שניות של זרימת גזירה באמצעות שייקר מסלולי.

הדיקטיוסטליום טופלו מראש בקפאין כדי להפחית את פעילותם הבסיסית. כתוצאה מכך, הייתה פעילות בסיסית נמוכה מאוד של PKBR1 ו-ERK2 ועלייה חזקה בזרחון של שאריות המפתח של קינאזות אלה עם הגירוי. בתאים בעלי יכולת צבירה המבטאים חיישנים ביולוגיים שונים בעלי תווית פלואורסצנטית, שני סמני קצה מובילים, PHcrac ו-LimE, שגויסו על ידי PIP3 או אקטין מפולימר חדש, שניהם הראו בעיקר לוקליזציה ציטוזולית בתאים במנוחה.

לאחר חמש שניות של זרימת גזירה, החיישנים הביולוגיים הללו התמקמו במהירות בקליפת המוח וחזרו לציטוזול. ההשפעות של תרופה לדה-פולימריזציה של אקטין Latrunculin A נבדקו באמצעות ניסוי כוח גזירה דומה. במקרה זה, תאים צמחיים נחשפו תחילה לתנאי בקרה ולאחר מכן עברו למאגר שהכיל את חומר הבדיקה הרצוי.

טיפול בלטרונקולין A חסם את הלוקליזציה מחדש של סמני הקצה המובילים לקליפת המוח. באופן מעניין, אם הזרימה לא הופסקה לאחר שתי שניות אלא נשארה דולקת למשך הניסוי, עדיין נצפתה תגובה גלובלית חולפת. בעקבות התגובה הגלובלית, תאים צמחיים נדדו נגד הזרם.

הכנה נכונה של תאים חשובה ביותר להצלחת הבדיקות הללו. יש לגדל תאים וגטטיביים בשיתוף עם חיידקים כדי להבטיח את תגובתם לגירוי מכני. עבור תאים בעלי יכולת צבירה, תאים שאינם מפותחים או מפותחים יתר על המידה, נוטים להגיב בצורה גרועה.

גישות ביוכימיות ומיקרוסקופיות משלימות זו את זו וזה איפשר לנו להעריך מספר רב של מתווכי העברת אותות לתגובתם לגירוי מכני. על ידי הוספת הפרעות פרמקולוגיות כמו גם גנטיות, אנו יכולים ללמוד כיצד גירויים מכניים נתפסים ומועברים. זה חשוב להבנת נדידת תאים מכוונת המונחית על ידי גירויים פיזיים כגון זרימת גזירה.

מכיוון שגירוי מכני מפעיל הפעלה של אותה רשת העברת אותות כמו כימותרפיה, אנו יכולים כעת לבחון את האינטגרציה של גירויים שונים בתאים. בסופו של דבר, מחקרים אלה יעזרו לנו להבין כיצד תאים נודדים כמו תאי החיסון שלנו ותאי סרטן גרורתיים מנווטים בגוף.