קרינה פלואורסצנטית Live-תא הדמיה של שלמה וגטטיבי תא מחזור של חיידק חברתית גידול איטי Myxococcus xanthus

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תא חיידקים, כמו למשל כיצד תאים משכפלים את הדנ"א שלהם, כיצד הם גדלים וכיצד הם מתחלקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנטר תאי חיידקים חיים לפחות 24 שעות תחת המיקרוסקופ והטכניקה אינה דורשת ציוד מיוחד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הצמיחה והחלוקה של Myxococcus xanthus, ניתן ליישם אותה בקלות גם על חיידקים אחרים שגדלים לאט.

כדי להתחיל, יש להשעות מחדש מושבת M.xanthus בודדת ב-500 מיקרוליטר של 1% CTT, בתוספת אנטיביוטיקה, בצינור סטרילי ולהעביר את כל התרחיף לבקבוק ארלנמאייר של 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של 1% CTT. הכן תמיסת מיקרוסקופיה של 1% אגרוז המכילה 0.2% CTT על ידי ערבוב גרם אחד של אגרוז עם 80 מיליליטר של מאגר TPM ו-20 מיליליטר של 1% מדיום CTT. מיקרוגל את התמיסה עד שהאגרוז נמס.

ממלאים צלחת פטרי בכ -60 מיליליטר אגרוז מותך ונותנים לה להתקרר לטמפרטורת החדר. יש לחמם מראש את פד האגרוז בחום של 32 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות לפני השימוש. לאחר מכן, הנח כיסוי זכוכית סטרילית על מסגרת פלסטיק או מתכת שיש לה חור באמצע, ולאחר מכן השתמש בסרט כדי לקבע את הכיסוי למסגרת.

הוסף 10 עד 20 מיקרוליטר של תאי M.xanthus שגדלו באופן אקספוננציאלי על הכיסוי. כדי להוסיף מיקרוספירות פלואורסצנטיות כסמנים נאמנים של התאים, השתמש במאגר TPM כדי לדלל את המיקרוספירות ל-1:100. יש לנער היטב את תרחיף החרוזים ולהוסיף חמישה עד 10 מיקרוליטר לתאים.

מכרית האגרוז הגדולה והמחוממת מראש, גזרו כרית קטנה בערך בגודל החלקת הכיסוי והניחו אותה על גבי התאים. לאחר מכן הנח החלקת כיסוי על גבי הכרית כדי למנוע אידוי ולשמור על תאים בסביבה לחה. דגרו את דגימת המיקרוסקופיה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד לתחתית כרית האגרוז לפני הקלטות מיקרוסקופיה בזמן-lapse.

כדי לבצע מיקרוסקופיה של זמן-lapse, הפעל את המיקרוסקופ והפעל את תוכנת בקרת המיקרוסקופ. בחר את המטרה הנכונה ואת המראות והמסנן הנכונים כדי לרכוש תמונות ניגודיות פאזה וכן תמונות של חלבונים ירוקים-פלואורסצנטיים, אדומים-פלואורסצנטיים או צהובים-פלואורסצנטיים. הוסף טיפה של שמן טבילה איכותי על עדשת המטרה ולתחתית הדגימה שהודגרה מראש ב-32 מעלות צלזיוס.

כשצד החור פונה למטרה, הנח את מסגרת המתכת עם הדגימה על המיקרוסקופ stage, ולאחר מכן הדק את הדגימה היטב במחזיק הבמה. התמקדו בתאים על ידי הזזת הבמה בכיוון Z קרוב יותר למטרה. כאשר השמן על המטרה והדגימה יוצרים מגע, הזז את ה-stage בכיוון X/Y.

עבור לתוכנת Metamorph ופתח את הכלי Acquire. בחר ניגודיות פאזה ברשימה הנפתחת הגדרה והגדר את זמן החשיפה ל-100 אלפיות השנייה. לחץ על הצג בשידור חי, הכנס את התא למישור המוקד והזז את הבמה בכיוון X/Y עד שמספר תאים בודדים נראים בשדה הראייה.

ודא שלפחות מיקרוספירה פלואורסצנטית אחת נמצאת באזור הראייה כדי ליישר מאוחר יותר את התמונות שנרכשו. לאחר מכן, פתח את אשף הרכישה הרב-ממדית של תוכנת בקרת המיקרוסקופ כדי להגדיר ניסוי זמן-lapse המאפשר למיקרוסקופ לרכוש תמונות במספר אורכי גל ומיקומי במה במידת הצורך. בכרטיסייה ראשי, הפעל זמן-lapse ואורכי גל מרובים.

כרטיסיות נוספות יופיעו בצד הימני של החלון. לחץ על הכרטיסייה שמירה ובחר ספרייה כדי לבחור תיקיה ריקה בכונן הקשיח של המחשב לשמירת התמונות שנרכשו, ולאחר מכן הפעל את שם הבסיס הקבוע אם הקובץ קיים כדי לוודא שמערכי הנתונים הרצופים אינם מחליפים את הקודמים. תנו לניסוי שם עם תאריך ושם הזן או כותרת הניסוי.

לחץ על הכרטיסייה זמן-lapse כדי להתאים את פרמטרי הזמן-lapse, ולאחר מכן הגדר את מרווח הזמן ל-20 דקות והגדר את משך הזמן ל-24 שעות. מספר נקודות הזמן ישתנה באופן אוטומטי. כעת, לחץ על הכרטיסייה אורכי גל.

בחר את מספר אורכי הגל שיש להשיג עבור כל תמונה בכל נקודת זמן על-ידי שינוי המספר. בחר אפשר מיקום נפרד של מיקוד אוטומטי שנזכר בחומרה עבור כל אורך גל. לחץ על אורך גל ראשון הכרטיסייה מלמעלה.

ברשימה הנפתחת תאורה, בחר ניגודיות פאזה. בחר 100 אלפיות שנייה לחשיפה וברשימה הנפתחת רכישה, בחר בכל נקודת זמן. השבת את החשיפה האוטומטית ברשימה הנפתחת על-ידי בחירה באפשרות אף פעם ובחר כל רכישה ברשימה הנפתחת עבור פוקוס אוטומטי.

הגדר את החשיפה לכל אורך גל כפי שהודגם זה עתה באמצעות הפרמטרים הבאים. לאחר מכן, כדי להשיג תמונות ממספר עמדות במה, בכרטיסייה הראשית הפעל עמדות במה מרובות. לחץ על הכרטיסייה במה ולחץ על כפתור חי כדי להסתכל על שדה הראייה.

הזז את הבמה בכיוון X/Y עד שהחזר ROI יהיה בשדה הראייה. שמור את קואורדינטות X ו- Y בכרטיסיה שלב על-ידי לחיצה על סימן החיבור. הזז את הבמה שוב בכיוון X/Y עד למציאת החזר ROI חדש ושמור שוב את הקואורדינטות על ידי לחיצה על סימן הפלוס.

המשך עד לשמירת מספר האזורים הרצוי. בדוק פעם נוספת שהתאים נמצאים בפוקוס על ידי לחיצה על מיקומי ה-X וה-Y השונים שנשמרו והתחל את המיקוד האוטומטי של החומרה על ידי לחיצה על AFC hold כדי לשמור על מיקום Z שנשמר קבוע במהלך הניסוי. התחל את הקלטת זמן-lapse באשף הרכישה הרב-ממדית של תוכנת בקרת המיקרוסקופ על ידי לחיצה על רכוש.

בדוק שהתאים עדיין ממוקדים לאחר נקודות הזמן הראשונות בהקלטות דולג הזמן כדי למקסם את איכות התמונות ולהתמקד מחדש במידת הצורך. כדי ליצור סרטוני זמן-lapse ולבצע יישור תמונה, הפעל את תוכנת ניתוח ועיבוד התמונה. פתח/י את התמונות כערימה על-ידי לחיצה על ״סקירת נתונים רב-ממדיים״, ״בחר/י קובץ בסיס״, ״בחר/י ספריה״ ולאחר מכן פתח/י את התיקייה עם הנתונים הרב-ממדיים.

בדוק את מערך הנתונים ולחץ על תצוגה. מערך הנתונים יוצג כתמונות בודדות מנקודת הזמן הראשונה ועד הסוף. הפעילו את אורך הגל ליצירת אוסף, ולאחר מכן בחרו את כל התמונות שאמורות להיכלל באוסף ולחצו על 'טען תמונות'.

חזור על שלב זה עבור כל אורכי הגל ושמור ערימות שהושלמו. הפעל את ערימת התמונות שצריך לתקן עבור סחיפה. פתח את כלי היישור באמצעות אפליקציות, יישור אוטומטי.

סמנו את 'אוסף' כמקור לתמונות ואת 'מישור ראשון/נקודת זמן' כמישור הייחוס, ולאחר מכן בחרו באוסף בעזרת הלחצן 'אוסף מקור' ולחצו על 'החל'. לאחר השלמת היישור האוטומטי, שמור את הערימה המיושרת. כדי ליצור סרט בפורמטים MOV או AVI, פתח את צור סרט פונקציה באמצעות מחסנית, עשה סרט.

בחר את הקלטות קיטועי הזמן עם הלחצן ערימת מקור, ולאחר מכן בחר את פורמט הפלט, קצב הפריימים, מספר הפריימים ולחץ על שמור. בניסוי זמן-lapse זה עם תאים מסוג DK1622 ניידים, תמונות ניגודיות פאזה נרכשו כל חמש דקות למשך 24 שעות. כצפוי, התאים היו תנועתיים והוזזו בעיקר בקבוצות.

בהדמיית תאים חיים בניגוד פאזה עם תאי דלתא-mgIA שאינם נעים, עקבו אחר הצמיחה והחלוקה של תאים בודדים במהלך היווצרות מיקרו-מושבה. כאשר התמונות נרכשו כל חמש דקות במשך 24 שעות, ניתן היה לכמת את זמן החלוקה של 235 פלוס מינוס 50 דקות ברזולוציה של תא בודד. כדי לחקור אם תאים גדלים כרגיל תוך מעקב אחר חלבונים המסומנים ב-yfp לאורך תקופות ארוכות, עקבו אחר תאי M.xanthus המבטאים ParB-YFP.

ParB-YFP יצר בתחילה אשכול יחיד באזור התאים התת-קוטבי. זמן קצר לפני או אחרי חלוקת התא, האשכול השתכפל, כאשר אשכול אחד נשאר בקוטב התא הישן והשני עבר לקוטב התא החדש. בניסוי זה, תאים לא ניידים המבטאים FtsZ-gfp הראו הצטברות חזקה של FtsZ-gfp בתא האמצעי, מה שמכתיב את מיקום חלוקת התאים.

FtsZ-gfp יצר אשכול בתא האמצעי, בעיקר בתאים ארוכים יותר. שעתיים לאחר חלוקת התאים, FtsZ-gfp הצטבר באמצע התא בתאי הבת. לאחר שליטה בטכניקה זו ניתן לבצע באופן שגרתי על Myxococcus xanthus כמו גם על כל חיידק אחר הגדל לאט.

בעת הגדרת הליך זה עבור חיידק, חשוב להתאים את הרכב מצע הגידול בצלחת האגר כדי לעמוד בדרישות הגידול הספציפיות של אותו חיידק. עבור כל חיידק, חשוב לקבוע את תנאי ההדמיה האופטימליים כגון זמן חשיפה, עוצמת אור ותדירות הדמיה כדי למנוע פוטוטוקסיות. כמו כן, עבור כל חלבון עם תווית פלואורסצנטית, יש להתאים את תנאי ההדמיה כדי למנוע פוטוטוקסיות וגם פוטו-הלבנה.