לכידת את האינטראקציה קינטיקה החלבון תעלת יונים עם מולקולות קטנות על ידי וזמינותו אינטרפרומטריה ביו-שכבה

המטרה הכוללת של אינטרפרומטריה ביו-שכבתית זו או בדיקת BLI, היא למדוד את האינטראקציה הפוטנציאלית בין חלבון תעלת יונים hEAG1 מטוהר לליפידים של מולקולות קטנות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפרמקולוגיה של תעלות יונים, כגון האם המולקולה הקטנה המעניינת יכולה לקיים אינטראקציה ישירה עם תעלת היונים הזו ומהן הקינטיקה של האינטראקציה? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בשיטה נטולת עבודה ותפוקה גבוהה.

יש צורך רק בכמות קטנה של חלבון משותק. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שבדיקה מוצלחת כוללת מספר שלבים, כולל ביטוי חלבון, טיהור, תיוג, חיישן מכוון במדויק וניתוח נתונים. לאחר תרבית תאי HEK293 T המייצבים את hEAG1 במשך יומיים-שלושה, קצרו את התאים על ידי הסרת מצע הגידול, והשתמשו בארבעה מיליליטר של PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים.

השליכו את ה-PBS. הפכו את התאים לשני מיליליטר PBS לכל צלחת, והשתמשו בפיפטה של מיליליטר אחד כדי להעביר לתאים לתוך צינור של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את תרחיף התא בכוח הכבידה פי 420 וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר מכן, שפכו את הסופרנטנט והשתמשו בארבעה מיליליטר של מאגר ליזיס כדי להשעות מחדש את הגלולה. דגרו את המתלה על קרח למשך 30 דקות, תוך מערבולת יסודית של הליזאט כל 10 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה של התא בכוח הכבידה פי 12,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לשפופרת של חמישה מיליליטר ושמרו אותו על קרח לשימוש מיידי. כדי להכין את שרף הזיקה נגד FLAG M2, השעו היטב את השרף על ידי היפוך עדין כדי לוודא שהבקבוק של ג'ל אנטי-FLAG M2 הוא מתלה אחיד של חרוזי ג'ל. העבירו מיד 400 מיקרוליטר מתלים לצינור צונן של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן, צנטריפוגה את המתלים בכוח הכבידה פי 8,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והשליכו בזהירות את הסופרנטנט כדי לשטוף את מאגר האחסון. כדי להשעות מחדש את גלולת השרף, הוסף 500 מיקרוליטר של תמצית חלבון סופרנטנט לשרף, והעביר את התרחיף לצינור חדש, צונן, של חמישה מיליליטר. הכניסו 500 מיקרוליטר נוספים של תמצית חלבון לתוך הצינור המקורי כדי לאסוף את כל החרוזים שנותרו, והעבירו את התמצית לשפופרת של חמישה מיליליטר.

דגרו את התערובת על שייקר בשמונה סל"ד וארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לקשור את חלבון ההיתוך FLAG לשרף. לאחר מכן, צנטריפוגה את התערובת בכוח הכבידה פי 1, 000 בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של אחד x PBS.

שמור אותו על קרח לשימוש מיידי. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת פליטה של שלושה x FLAG ל-390 מיקרוליטר PBS לריכוז סופי של 200 ננוגרם למיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף 400 מיקרוליטר של תמיסת פליטה של שלושה x FLAG לחרוזי הג'ל שהוכנו בעבר.

דגרו את הדגימה על אינקובטור רועד בשמונה סל"ד וארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן, צנטריפוגה את השרף בכוח הכבידה פי 8000 למשך 30 שניות. העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי של 1.5 מיליליטר, ואחסנו אותו בארבע מעלות צלזיוס לשימוש מיידי.

השתמש בבדיקת חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן כדי לקבוע את ריכוז החלבון המטוהר. לאחר מכן, השתמש בדגימה של 30 מיקרוליטר לניתוח Western Blot עם נוגדן נגד Flag כדי לאשר שהחלבון המעניין טוהר. כדי לתייג את החלבון המטוהר בביוטין, הכינו חמישה מיליגרם למיליליטר של תמיסת מלאי ביוטין ב-PBS.

עבור כל בדיקה של שני חיישנים ביולוגיים, הוסף עודף מולרי פי שלושה של ביוטין ל-20 מיקרוגרם של חלבון מטוהר כדי להשיג ביוטינילציה עדיפה של N-terminal של החלבון המטוהר ב-PBS. דגרו את הדגימה בחושך על קרח למשך 30 דקות לפחות. כדי להסיר את הביוטין והמאגר הלא קשורים, החלף את החלבון למאגר SD.

העבירו את החלבון למכשיר אולטרה-סינון עם חתך מולקולרי של 30 קילודלטון. לאחר מכן, הוסף מאגר SD וצנטריפוגה את הדגימה בכוח הכבידה פי 12, 000 וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר את האולטרה-פילטראט מצינור הצנטריפוגה.

הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר SD למכשיר המסנן וצנטריפוגה שוב את הדגימה. חזור על התהליך לפחות שלוש פעמים. אסוף את הדגימה שהוחלפה על ידי היפוך מכשיר הסינון והנח אותו בצינור של 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה את הדגימה בכוח הכבידה פי 2,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. שמור את הדגימה על קרח לשימוש מיידי. כדי לבצע את בדיקת BLI, 30 דקות לפני המחקר, יש לחמם את הציוד מראש על ידי הפעלת המכשיר.

בדוק את חלון מצב המכשיר כדי לוודא שהמכונה במצב מוכן לפני שתתחיל. ודא שדלת המכשיר סגורה לפני פתיחת תוכנת איסוף הנתונים ובאשף הניסוי, בחר בניסוי הקינטיקה החדש. הגדר את הבארות שישמשו בצלחת 96 הבארות על ידי לחיצה ימנית כדי לבחור את המאגר, העומס והדגימה.

עבור בארות מדגם, יש להזין את יחידת הריכוז של PIP2 כטוחנות. כדי להגדיר את שלבי הבדיקה, בחר שלב ולחץ פעמיים על העמודה המתאימה. עותק של הגדרת הבדיקה מוגדר עבור חיישני הבקרה.

הגדר את הסל"ד ל-1, 000. בחר דקה אחת עבור שלב הבסיס, וחמש עד 10 דקות עבור טעינה, שיוך ודיסוציאציה בהתאמה. בצע את הבדיקה בטמפרטורת החדר.

לחץ על העמודות המכילות את החיישנים ולחץ על מילוי כדי לציין את מיקום החיישנים במגש החיישן. סקור את כל השלבים המתוכננים כדי לבדוק אם יש טעויות וחזור לתקן אותן. בכל פעולת בדיקת BLI, השלב של סקירת כל הצעדים המתוכננים עלול להיות מוזנח על ידי החוקר.

עם זאת, חשוב מאוד לבדוק שכל השלבים המתוכננים נכונים. הגדר את המיקום של קבצי נתונים ולחץ על Go כדי להתחיל את הבדיקה. הפעל את הבדיקה ונתח את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

כפי שניתן לראות בניסוי מהדק תיקון זה בתא HEK293 T, המבטא ביציבות hEAG1, זרמי האשלגן החיצוניים התלויים במתח מרמזים על כך שתעלות hEAG1 פונקציונליות באות לידי ביטוי גבוה בתאים. שימוש בנוגדנים נגד FLAG כתם מערבי זה של hEAG1 מדגימות חלבון מטוהרות מצביע על האיכות והספציפיות של החלבון המטוהר. חלבון התעלה המטוהר עבר ביוטינילציה כדי לבצע בדיקת אינטראקציה עם השומן PIP2 על ידי שימוש בבדיקת BLI בזמן אמת.

עקומת קישור טיפוסית בין hEAG1 ל-PIP2 מוצגת כאן. hEAG1 קשור ל-PIP2 באופן תלוי ריכוז. הריכוזים המצטברים של PIP2 תואמים את עקבות הנתונים של החיישן הביולוגי.

בדיקה מייצגת זו מציגה את השינויים בהפרעות אופטיות בריכוזים שונים של PIP2. לבסוף, התקבלה התאמה עקומה למשוואת היל מערך השיא של אות ההפרעה האופטית שנמדד בריכוזים שונים של PIP2 וקבעה את קבועי הדיסוציאציה של שיווי המשקל בין hEAG1 ל-PIP2. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעה אם היא מבוצעת כראוי.

כאשר מנסים הליך זה, חשוב מאוד לזכור לסקור את כל השלבים המתוכננים, כדי לוודא שהליך זה נכון. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מהדק טלאי על מנת לענות על שאלות נוספות כמו זיהוי התפקוד של תעלת יונים זו לאחר קשירת המולקולה הקטנה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום סינון הליגנדים של תעלות יונים לחקור את הליגנדים החדשים בגילוי תרופות תעלות יונים.

אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין את חלבון תעלת היונים וכיצד לבחון את האינטראקציה שלו עם מולקולות קטנות, בשיטת BLI.