פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

שלום, שמי דורטה ממכון Thea Hands באוניברסיטה הטכנולוגית, Reen Laser. מיקרודיסקציה היא טכניקה המאפשרת להשיג אוכלוסיית תאים מיוחדת מכמויות קטנות מאוד של גידול הורה. התאים המנותחים יכולים לשמש למחקרים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים, הערכת DNA או ניתוח כרומוזומים.

כאן אנו מספקים את הפרוטוקול שלנו לרכישת תאי מטא לבלב אנושיים מדגימות כירורגיות שישמשו למחקרים טרנסקריפטומיים. חותכים את רקמת הלבלב לחתיכות קטנות. מניחים חתיכה אחת במרכז תבנית קריו ומכסים אותה בתרכובת הטבעה צוננת.

הקפיאו את הרקמה מיד עם שני חומרים צוננים בהוטן ומאוחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס. חתך תווית 40 שקופיות דבק ומקרר אותן מראש בתוך החדר המשיח. תקן את הרקמה הקפואה על מחזיק הדגימה עם תרכובת ה-OCT לאחר חיתוך בלוק הקריו.

חותכים 40 חלקים בעובי 10 מיקרומטר. העבירו קטע אחד לשקופית אחת על ידי נגיעה בצד האחורי של המגלשה עם האצבע כדי לחמם רק את המיקום להנחת החלק עליו.נסו את החלקים שתיים-שלוש דקות בתוך הקריוס המתים ואחסנו אותם לאחר מכן במינוס 80 מעלות צלזיוס, הכינו את ריאגנטים של Ation וצננו את כל הנוזלים למעט סלין על קרח. זה יגדיל את האוטופלואורסצנטיות הפנימית של תאי PET לפני המיקרו-דיסקציה.

ארבעה חלקים יורדו בכל פעם. טפל בשני חלקים בבת אחת. תקן אותם תחילה ב-70% אתנול למשך 30 שניות.

לאחר מכן שוטפים את החלקים בחמישה עד שישה מטבלים מהירים. ב-DPC מים מטופלים להלן. יבשו את הרקמה דקה אחת באתנול 100% וחזרו על שלב זה, דגרו את השקופיות בסלין למשך ארבע דקות.

בינתיים, התחל בהתייבשות של זוג חלקים נוסף. לבסוף, יבש את המגלשות באוויר במשך שלוש עד חמש דקות בחושך. הגן על הרקמה מפני לחות ועל האוטו-פלואורסצנטי מפני הלבנה על ידי הנחת שתי השקופיות גב אל גב לתוך נייר כסף עטוף צינור 50 מ"ל לפני הקטע, נקה את המיקרוסקופ עם RNA הרחק והדק את מכסה הדבק לתוך המניע הרובו.

הכנס את השקופית לתוך הבמה והזיז את הכובע מקרוב מעל החלק מבלי לגעת בו. מקם את הלולאות על ידי זיהוי אזורי התאים האוטו-פלואורסצנטיים הטובים יותר. האוטופלואורסצנציה הפנימית של תאים אנושיים טובים יותר נראית צהובה במערך, בעוד שצינורות הלבלב מראים אוטופלואורסצנציה ירוקה בהירה.

בחר את אזורי התאים הטובים יותר עם כלי בחירת היד החופשית ונתח אותם במיקרו על ידי הפעלת הלייזר. נתח את הלולאות של ארבעה חלקי קריו לתוך מכסה דבק אחד תוך 40 עד 60 דקות. אם תרצה, בדוק את הרקמה שנלכדה על ידי הזזת המכסה למחסום המיקרוסקופ.

הסר את המכסה החוצה ממוביל הרובו וצנר אותו. מאגר מיצוי של 10 מיקרוליטר לתוך המכסה של המכסה לשיבוש תאים. דגרו את הפקק הפוך בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

סובב את הליזאט, סמן את הצינור ואחסן אותו במינוס 80 צלזיוס מופחת עד למיצוי ה-RNA. בצע את לייזר Ation, מיקרו דיסקציה וליזה עם כל 40 ניתוחי הקריו. לאחר מכן, אחדו את 10 הליזטים והמשיכו בבידוד ה-RNA באמצעות ערכת הבידוד UR PU RNA בהתאם לפרוטוקול שסופק להשגת 11 מיקרוליטר RNA.

באופן כללי, לא מצאנו קשר ישיר בין כמות רקמת המיקרו-דיסקט לבין תפוקת ה-RNA הבדלים במרווח הזמן בין הקציר על ידי המנתחים לבין הקפאת דגימת הלבלב לאחר בדיקתה על ידי הפתולוג, יכולים להסביר בחלקם את האיכות והכמות של ה-RNA המשוחזר. גורמי מפתח נוספים שיש לקחת בחשבון הם אנרגיית הלייזר המיושמת עבור מיקרו דיסקציה עם האנרגיה הנמוכה יותר, תוך שימוש בשלמות ה-RNA הגבוהה יותר, כמו גם מיקוד הלייזר והמרחק של נקודות ההצבעה של חותך לחץ הלייזר. בנוסף, ניתן למטב את כמות ה-RNA על ידי שמירה על המרחק בין מכסה הדבק לנמוך ככל האפשר.

הימנע מאובדן של רקמה מיקרו מנותחת במהלך תהליך הלכידה, בתנאי שמיקרוסקופ מיקרו דיסקציה בלייזר זמין. הליך זה יכול להיות מיושם בכל מוסדות מחקר המבצעים כריתת לבלב חלקית, ובכך להגדיל את הגישה לחומר עפעפיים אנושיים מנבדקים שאינם סוכרתיים וסוכרתיים כאחד.