פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים
6 בינואר 2013
microdissection הליזר הוא טכניקה המאפשרת התאוששות של תאים נבחרים מכמויות זעירות של parenchyma. כאן אנו מתארים פרוטוקול לרכישת איי לבלב אנושיים מדגימות ניתוחיות שתשמש למחקרי transcriptomic. הפרוטוקול שלנו משפר את autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם, ובכך להקל האוסף שלהם.
שלום, שמי דורטה ממכון Thea Hands באוניברסיטה לטכנולוגיה, Reen Laser. מיקרודיסקציה היא טכניקה המאפשרת להשיג אוכלוסיית תאים מיוחדת מכמויות קטנות מאוד של גידול אם. ניתן להשתמש בתאים שחולצו למחקרים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים, להערכת DNA או לניתוח כרומוזומים.
כאן אנו מציגים את הפרוטוקול שלנו להשגת תאי מטה של הלבלב האנושי מדגימות כירורגיות לשימוש במחקרי טרנסקריפטומיקה. חתכו את רקמת הלבלב לחתיכות קטנות. הניחו חתיכה אחת במרכז תבנית קירורית (cryo mold) וכסו אותה בתרכובת הטמעה מקוררת.
הקפיאו את הרקמה באופן מיידי באמצעות חומר קירור וסננו במקפיא של 80°C-. סמנו 40 שקפיות דביקות להכנת חתכים קררו אותן מראש בתוך תא הקירור. קבעו את הרקמה הקפואה על תומך הדגימות באמצעות תרכובת OCT לאחר קיצוץ של בלוק הקריו.
חתוך 40 חתכים בעובי 10 µm. העבר חתך אחד לשريחה על ידי נגיעה של האצבע בגב השריחה כדי לחמם רק את המיקום שבו יונח החתך. ייבש את החתכים במשך שתי עד שלוש דקות בתוך הקריוסטט ואחשראן אחסן אותם בטמפרטורה של 80°C-. הכן את ריאגנטים לצביעה וקרר את כל הנוזלים, למעט סליין, על קרח. פעולה זו תגביר את האוטופלואורסצנציה הפנימית של תאי PET לפני המיקרו-דיסקציה.
ארבעה חתכים יעברו דה-ווקסינג (derating) בכל פעם. יש לטפל בשני חתכים בו-זמנית. קבעו אותם תחילה ב-70% ethanol למשך 30 שניות.
לאחר מכן, שטפו את החתכים באמצעות חמש עד שש טבילות מהירות במים שעובדו ב-DPC.בצעו דהידרטציה לרקמה למשך דקה אחת ב-100% ethanol וחזרו על שלב זה, ואז הדגירו את השקופיות ב-seline למשך ארבע דקות.
במקביל, התחילו את תהליך התוך של זוג נתחים נוסף. לבסוף, ייבשו את השקופיות באוויר במשך שלוש עד חמש דקות בחושך. הגנו על הרקמה מפני לחות ועל האוטופלואורסצנציה מפני הבהרה על ידי הנחת השתי השקופיות גב אל גב בתוך מבחנה של 50 ml עטופה בנייר אלומיניום. לפני הנתח, נקו את המיקרוסקופ באמצעות RNAs away והדקם את מכסה ההדבקה לתוך ה-robo Mover.
הכנס את השקופית לבמה והזז את המכסה קרוב אל החיתוך מבלי לגעת בו. אתר את הנחירים על ידי זיהוי אזורים של תאי בטא בעלי אוטופלורסצנציה. האוטופלורסצנציה העצמית של תאי בטא אנושיים נראית צהובה בהגדרות המערכת, בעוד שצינורות הלבלב מראים אוטופלורסצנציה ירוקה בהירה.
בחרו את אזורי התאים המיטביים באמצעות כלי הבחירה החופשית ובצעו להם מיקרו-דיסקציה על ידי הפעלת הלייזר. בצעו דיסקציה של ה-eyelets מארבעה חתוכי קריו מדורגים אל תוך מכסה דביק אחד בתוך 40 עד 60 דקות. במידת הצורך, בדקו את הרקמה שנלכדה על ידי העברת המכסה לנקודת הבקרה של המיקרוסקופ.
הסיר את הפקק מה-robo mover והעבר לתוכו 10 µL של תמיסת חילוץ (extraction buffer) אל מכסה הפקק לצורך פירוק התאים. דגרי את הפקק כשהוא הפוך בטמפרטורה של 42 °C למשך 30 דקות.
סובב את הליזאט במ centrifuge, סמן את המבחנה ואחסן אותה במינוס 80 °C עד לביצוע השליפה של ה-RNA. בצע את ה-Ation laser, המיקרו-דיסקציה (micro dissection) והליזיס עם כל 40 ה-cryo dissects. לאחר מכן, איחד את 10 הליזאטים והמשך בבידוד ה-RNA באמצעות ערכת UR PU RNA isolation בהתאם לפרוטוקול המצורף כדי להשיג 11 µL של RNA.
באופן כללי, לא מצאנו קשר ישיר בין כמות הרקמה שעברה מיקרו-דיסקציה לבין תפוקת ה-RNA. הבדלים במרווח הזמן שבין הדגימה על ידי המנתחים לבין הקפאת דגימת הלבלב לאחר בדיקתה על ידי הפתולוג, עשויים להסביר חלקית את האיכות והכמות של ה-RNA שהופק. גורמי מפתח נוספים שיש לקחת בחשבון הם אנרגיית הלייזר שיושמה למיקרו-דיסקציה, כאשר אנרגיה נמוכה יותר שומרת על שלמות (integrity) גבוהה יותר של ה-RNA, וכן מיקוד הלייזר והמרחק של נקודות הסימון של חיתוך לחץ הלייזר. בנוסף, ניתן למקסם את כמות ה-RNA על ידי שמירה על מרחק נמוך ככל האפשר בין המכסה הדביקה לבין הדגימה.
יש למנוע איבוד של רקמה שעברה מיקרו-דיסקציה במהלך תהליך הלכידה, בתנאי שמיקרוסקופ למיקרו-דיסקציה בלייזר זמין. ניתן ליישם הליך זה בכל מוסד מחקר המבצע כריתות חלקיות של הלבלב, ובכך להגדיל את הגישה לחומרים מעפעפיים של בני אדם, הן מנבדקים שאינם סוכרתיים והן מנבדקים סוכרתיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול למיקרודיסקציה בלייזר לשחזור איים הלבלביים אנושיים מדגימות כירורגיות. הטכניקה משפרת את איסוף תאי הבטא למחקרים טרנסקריפטומיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טרנסקריפטומיקה
רקע
- מיקרו-דיסקציה בלייזר מאפשרת בידוד של אוכלוסיות תאים ספציפיות.
- זה שימושי במיוחד עבור דגימות רקמה קטנות.
- ניתן ליישם את הטכניקה במגוון מחקרים, כולל אנליזות טרנסקריפטומיות ופרוטאומיות.
- שיפור האוטופלורסצנציה מסייע באיסוף תאים ממוקדים.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול מפורט להשגת איים לבלב אנושיים.
- סיוע בחקר תאי בטא במחקרי טרנסקריפטומיקה.
- שיפור היעילות של איסוף תאים מדגימות כירורגיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקת מיקרו-דיסקציה בלייזר המיושמת על רקמת לבלב.
- הכנת דגימות רקמה על ידי חיתוך לחתיכות קטנות.
- הטמעה של הרקמה בתרכובת מקוררת לצורך דיסקציה אופטימלית.
- איסוף תאי בטא להמשך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של איים הלבלב אנושיים.
- נצפתה אוטופלואורסצנציה משופרת של תאי בטא.
- הפרוטוקול הוכיח יעילות עבור מחקרי טרנסקריפטומיקה.
- אפשר איסוף של אוכלוסיות תאים ממוקדות מדגימות קטנות.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את התשואה של איים הלבלב אנושיים.
- מיקרו-דיסקציה בלייזר היא כלי בעל ערך לניתוח תאי.
- שיטות משופרות יכולות להוביל לתובנות טובות יותר במחקר טרנסקריפטומי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מיקרו-דיסקציה בלייזר (Laser microdissection) מאפשרת בידוד מדויק של תאי בטא של הלבלב אנושי מדגימות כירורגיות מוגבלות, ובכך פותרת צוואר בקבוק קריטי במחקרי טרנסקריפטומיקה של רקמות הרלוונטיות לסוכרת. באמצעות הגברת האוטופלורסצנציה האינטרינסית באמצעות עיבוד ריאגנטים קרים מאוד (ice-cold), הפרוטוקול מקצר את זמן הטיפול ברקמה ומשפר את שימור ה-RNA, ובכך תומך באופן ישיר בתיקוף מטרות במחקר של מחלות מטבוליות. גישה זו מחזקת את הפחתת הסיכונים המכניסטיים (mechanistic de-risking) על ידי אספקת אוכלוסיות תאים מטוהרות ליישומי אומיקה (omics) במורד הזרם בתהליכי גילוי מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד אוכלוסיות טהורות של תאי בטא לצורך ניתוח מסלולים במודלים של סוכרת מסוג 2.
- ערך תפעולי: מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות זיהוי מהיר ומדויק של תאי מטרה באמצעות פלואורסצנציה עצמית מוגברת, ובכך מפחית את כמות התוצאות החיוביות השגויות בבחירת המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו ולידציה לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות, על ידי אספקת תשומות RNA עקביות ובעלות שלמות גבוהה מאיים שבוצע להם מיקרו-דיסקציה.
- ערך תפעולי: תומך בתוצרים כמותיים הניתנים לשחזור, החיוניים למוכנות לסריקה ולשימוש חוזר בפלטפורמה במסלולי גילוי של סמנים ביולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על הרלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות לניתוח טרנסקריפטומי של איים לבלב אנושיים הקשורים ישירות לפתופיזיולוגיה של סוכרת.
- ערך תפעולי: מבטיח המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות אספקת אוכלוסיות תאים מוגדרות למחקרי מעקב מכניסטיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות בשלבים מוקדמים של הביולוגיה, תמיכה בפיתוח בדיקות באמצעות תשומות סטנדרטיות, וסיוע בקבלת החלטות תרגומיות באמצעות פרופיל מולקולרי כמותי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד תאי בטא לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות במודלים של מחלות מטבוליות.
- סריקה: מספקת דגימות מוכנות לבדיקה עם תנובת RNA ניתנת לשחזור, דבר קריטי לסריקת השפעות של תרכובות על איים מבודדים.
- אנליטיקה: מייצרת תוצאות טרנסקריפטומיות כמותיות המאפשרות השוואה בין מצבים סוכרתיים לבלתי-סוכרתיים כדי לסייע בזיהוי מועמדים מובילים.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי אספקת דגימות רלוונטיות לבני אדם המגשרות בין ממצאים in vitro למנגנוני מחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת ניתנת לשימוש חוזר לגישה לאיי לבלב אנושיים ראשוניים במגוון פרויקטים, ובכך מפחיתה את התלות במקורות תורמים משתנים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את ביטחון התחזית על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במסלולי אותיות ספציפיים לתאי בטא.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות עיבוד רקמות מבוקר ופרמטרי ניתוח מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של מעורבות המטרה בתאים רלוונטיים לבני אדם, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של מטרות לסוכרת על בסיס פרופילים טרנסקריפטומיים מאומתים של איים בלבקר בני אדם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהיסטולוגיה, חיתוך קריוסטטי ותפעול מכשור למיקרודיסקציה בלייזר.
- תלוי בגישה למערכת PALM MicroBeam או לפלטפורמת LMD שוות ערך בעלת יכולת AutoLPC.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לטיפול בריאגנטים כדי לשמור על אוטופלואורסנציה ועל שלמות ה-RNA בין משתמשים שונים.
- כולל שיקולי התאמה לאיכות משתנה של דגימות לבלב ולזמן איסכמיה שבין האיסוף להקפאה.
- מוגבל על ידי אילוצי תנובת ה-RNA, מה שמחייב איחוד של מספר דגימות שעברו מיקרודיסקציה כדי להגיע לכמות קלט מספקת עבור ערכות המשך.
