כימות סימולטני של CD8 וקטור נגד ו- Anti-transgene-ספציפי+ T תאים דרך MHC אני Tetramer מכתים לאחר החיסון עם וקטור ויראלי
28 בנובמבר 2018
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשם זיהוי איכותי vivo של אנטיגן ספציפי CD8+ T תאים. ניתוח אפשרי עם המתלים תא בודד איברים או כמויות קטנות של דם. מגוון רחב של מחקרים דורשות הניתוח של תגובות תא T ציטוטוקסי (חיסון, מחקרים חיסוני סרטן).
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום אימונולוגיה של תאי T ופיתוח חיסונים וקטוריים ויראליים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי רק כמויות קטנות של דם נדרשים, אשר מאפשר מדידות חוזרות ונשנות מאותו עכבר. בנוסף, ניתן לזהות CTLs ספציפיים לווירוסים ולטרנדים מאותה דגימה.
הדגימו את ההליך יהיו יסמין רינופנר, טכנאית, ואניקה רוסלר, סטודנטית לתואר שני. מדידה וניתוח הדגימות יהיה זולטן בנקי, פוסט-דוק. כדי להתחיל, לרסן בבטחה עכבר על פי פרוטוקול הטקסט.
לאסוף 20 microliters של דם בצינור מצופה EDTA מוריד הזנב של עכבר. כאשר עובדים עם טחול, לבודד את הטחול ולהשתמש הבוכנה של מזרק ללחוץ על הרקמה דרך מסננת התא. לאחר ביצוע תזה על אריתרוקיטים, לספור את התאים ולהתאים את הריכוז של המדגם.
הכינו ותייגו צינור Facs אחד עבור כל דגימה, והעברת 100 מיקרוליטרים של השעיית איברים, או 20 מיקרוליטרים של דם לצינור. כאשר עובדים עם טחול, צנטריפוגה השעיית האיבר במשך חמש דקות, ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, מערבולת הצינור כדי resuspend גלולת התא.
לשימוש בכל ערוץ, הכינו גם צינור Facs לדגימה של פיצוי. הכן דוגמה נוספת אחת כפקד לא מזוהם. הכינו צינור עם מאגרי פאקס עם ת'רמרים בדילול האופטימלי שלהם, ומערבולת לערבב.
לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של דילול הטטרמר לכל דגימה, ומערבולת לערבב. הוסף מאגר Facs ללא tetramers לפקדי הפיצוי ולדגימה שאינה מוכתמת. לאחר מכן, הדגירה את הדגימות בתנאים כהים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
בעוד הדגימות דגירה, להוסיף חיץ Facs לצינור. לאחר מכן, הוסף את הנוגדנים למאגר בהתאם לדילולים שצוינו בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט, ומערבולת הפתרון. תלויים ועומדים בשאלה המדעית ניתן להשתמש בשילובי הסמן, מלבד זה המתואר כאן.
הקפד תמיד לכלול נוגדנים נגד CD3 ו- CD8 בלוח. עבור כל ערוץ, להכין צינור עם 200 microliters של חיץ Facs, ולהוסיף microliters אחד של דילול נוגדנים נגד CD8 בצבע שלהם, ומערבולת לערבב. לאחר מכן, אחסן את דילול הנוגדנים כפי שצוין בפרוטוקול הטקסט.
כדי לשטוף את הדגימות, להוסיף מיליטר אחד של מאגר Facs לדגימות וצנטריפוגה. לאחר מכן, להשליך את supernatant, ולנקות כל נוזל שנותר עם מגבות נייר. כאשר עובדים עם דם, להיות זהיר בעת ניקוז את הנוזל שנותר.
לפני תזה של אריתרוציטים, הדם לא ידבק לתחתית הצינור. לחלופין, אתה יכול לספירה על טבעי. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תותר הנוגדנים לכל גלולת תא, ומערבולת בעדינות.
הוסף 50 מיקרוליטרים של כל תערובת פיצוי לבקרת הפיצויים המתאימה, ו- 50 מיקרוליטרים של מאגר Facs לכדור התא של הפקד הבלתי נגוע, ומערבולת בעדינות. כאשר עובדים עם טחול, לשטוף את הדגימות לאחר כתמי נוגדן ישירות עם אחד עד שני מיליליטר של חיץ Facs, וצנטריפוגה במשך חמש דקות. לאחר מכן, השלך את העל-טבעי ורוקן את הנוזל הנותר על מגבות נייר.
הוסף 500 מיקרוליטרים של חיץ ACK לכל דגימת דם, ומערבולת בעדינות. לאחר מכן, הדגירה את הדגימות בחושך במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסף מיליליטר אחד של מאגר Facs לדגימות, וצנטריפוגה.
לאחר מכן, השלך את העל-טבעי ורוקן כל נוזל שנותר במגבות נייר. תזה נכונה של אריתרוקיטים היא צעד מכריע כדי להקל על מדידת Facs, ולכן, כאשר גלולה הוא רטוב למדי, לחזור על תזה של אריתרוקיטים. לשטוף את הדגימות שוב כפי שתואר קודם לכן.
לאחר מכן, השלך את העל-טבעי ורוקן את כל הנוזלים הנותרים על מגבת נייר. לפני קיבעון, ודא כי התאים הם resuspended היטב על מנת למנוע היווצרות של גושים. הוסף 150 עד 300 מיקרוליטרים של מאגר תיקון Facs לכל צינור, ומערבולת לערבב.
לאחר מכן, המשך עם מדידה ציטומטרית זרימה מהר ככל האפשר. ראשית, למדוד את פקדי הפיצוי ולתקן עבור כל חפיפות ספקטרליות. לאחר מכן, הגדר שערים רציפים לבחירה עבור תאים חיוביים ל- CD3 ותאי CD8 חיוביים.
שער על הלימפוציטים באמצעות אזור פיזור קדימה וצד. לאחר מכן, בתוך אוכלוסיית הלימפוציטים, שער על תאים בודדים באמצעות רוחב פיזור קדימה לעומת שטח. השתמש בערוצי CD3 ו- CD8 כדי להתוות לימפוציטים חד-תאיים.
זהה תאי T חיוביים ל- CD8, על-ידי הפעלה בתאים חיוביים ל- CD3 ו- CD8 חיוביים. ודא שתאים נמוכים ל- CD8 כלולים ב- gating. הפצה בתאים חיוביים ל- CD3/CD8 היא שלב קריטי בפרוטוקול זה.
מכיוון שהפעלת תאים מובילה לעתים קרובות לרגולציה נמוכה יותר של CD3 ו/או CD8, יש לכלול גם תאים נמוכים ב- CD3/CD8. לאחר מכן, התווה את התאים החיוביים ל- CD8 לעומת תאי הטטרמר, תוך גת על התאים החיוביים/טטרמר CD8. במידת האפשר, הקלט 20, 000 תאים בשער CD3 חיובי ו- CD8 חיובי עבור כל דגימה.
לבסוף, שמור את המידות כקובץ FCS. בפרוטוקול זה, תאי CD8+T ספציפיים לאנטיגן זוהו כמותית בדגימות דם ורקמות. לאחר אתחול התאים החיוביים ל-CD3 ותאי CD8 חיוביים, זוהו תאים חיוביים לטטמר.
שני tetramers שונים שולבו באותו צינור עבור כתמים, המאפשר כימות בו זמנית של שני ספציפיות CTL שונים. באמצעות פרוטוקול זה, תגובות תא T מאותו עכבר ניתן לעקוב לאורך זמן, כמו רק כמויות קטנות של דם נדרשים עבור כל מדידה. בנוסף, ניתן לנתח פנוטיפים של CTLs ספציפיים לאנטיגן.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב להימנע פעמים דגירה ממושכת, כמו זה יכול להוביל להפנמה של קולטני תא T. מאז גילוי טכנולוגיית הטטרמר, כתמי טטרמר הפכו לכלי חיוני לניתוח תאי T, ומגוון רחב של יישומים, הכוללים צבירת טטרמרים. עתיד מזהיר לתמרים בהירים.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לזיהוי איכותני ex vivo של תאי CD8 + T ספציפיים לאנטיגן באמצעות דגימות דם קטנות או תרחיפי תאים בודדים מאיברים. שיטה זו שימושית במיוחד במחקרים הקשורים לתגובות של תאי T ציטוטוקסיים, כגון חיסונים ואימונותרפיה לסרטן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה של תאי T
- אימונותרפיה של סרטן
- חיסונים מבוססי וקטורים ויראליים
רקע
- תאי T מסוג CD8+ ספציפיים לאנטיגן ממלאים תפקיד מכריע בתגובות חיסוניות.
- דגימות דם קטנות מאפשרות מדידות חוזרות מאותו נסיין.
- ניתן לבצע זיהוי של תאי CTL ספציפיים לנגיף ולטרנסגן באופן סימולטני.
- טכנולוגיית הטטראמר משפרת את הניתוח של אוכלוסיות תאי T.
מטרת המחקר
- מתן שיטה מהימנה לזיהוי תאי CD8 + T ספציפיים לאנטיגן.
- הקלה על חקר תגובות תאי T לאורך זמן.
- מתן אפשרות לכימות סימולטני של ספציפיות שונות של CTL.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף דגימות דם מעכברים ובידוד ספלנוציטים (תאי טחול).
- הכנת דגימות עם טטרמרים ונוגדנים עבור ציטומטריה זרימה.
- שלבי אינקובציה ושטיפה להבטחת צביעה וליזיס תקינים.
- מדידה בציטומטריה זרימה לזיהוי וכימות של תאי T חיוביים ל-CD8.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של תאי CD8 + T ספציפיים לאנטיגן בדגימות דם ורקמה.
- זיהוי תאים חיוביים ל-CD3 וחיוביים ל-CD8 באמצעות צביעת טטרמר.
- יכולת מעקב אחר תגובות של תאי T לאורך זמן עם נפח דם מינימלי.
- הושגה אנליזה סימולטנית של מספר ספציפיות של CTL.
מסקנות
- פרוטוקול זה יעיל לבחינת תגובות של תאי T בהקשרים אימונולוגיים שונים.
- הוא מאפשר ניתוח מפורט של אוכלוסיות תאי T ספציפיות לאנטיגן.
- יישומים עתידיים עשויים להרחיב את השימוש בטכנולוגיית טטראמרים במחקר אימונולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר כימות סימולטני של תאי CD8+ T ספציפיים לווקטור ולטרנסגן מדגימות דם מינימליות, ובכך תומך בניטור חוזר של תגובות חיסוניות בפיתוח חיסונים. על ידי מתן אפשרות למדידות חוזרות מאותו בעל חיים, הוא מפחית את מספר בעלי החיים בשימוש ומגדיל את צפיפות הנתונים במחקרי אימונוגניות פרה-קליניים. השיטה מספקת מידע ישיר לקבלת החלטות של go/no-go על ידי הפחתת הסיכון בבחירת אנטיגן המטרה ובבחינת יעילות מבנה הווקטור בשלבים מוקדמים של תהליך הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות תגובות של תאי T נגד אנטיגנים של הווקטור ושל הגן המועבר במקביל.
- ערך תפעולי: משתמש ב-20 µL בלבד של דם לכל מדידה, מה שמקל על מעקב לאורך זמן באותו מודל עכבר.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון ניבוי בבחירת האנטיגן על ידי הבחנה בין תגובות חיסוניות לאנטיגן המבוקש לבין חסינות אנטי-ווקטורית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת פלטים כמותיים וסטנדרטיים של ציטומטריית זרימה עבור תדרי תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן.
- שחזוריות: כוללת בקרות קומפנסיציה ודגימות לא צבועות כדי להבטיח תיקון של חפיפה ספקטרלית ועקביות של הבדיקה.
- סקלאביליות: תואם לסריקה בתופוק רב (high-throughput) של ספציפיות טטראמרים מרובות במבחנה אחת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין פרופיל תאי T בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח פנוטיפי (למשל, מצב אקטיבציה באמצעות CD43/CD44/CD62L).
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהירה האם אימונוגניות שנצפתה נובעת מהטרנס-גן או מרכיבי הווקטור, ובכך מסייעת באופטימיזציה של המבנה (construct).
- רלוונטיות למודלים פרה-קליניים: עובד עם תרחיפי תאים בודדים המופקים מדם או מטחול, מה שתומך בשימוש גמיש במדורים אנטומיים שונים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ותומכת באופן ספציפי באפיון חיסוני מוקדם לאחר חיסון ולפני אופטימיזציית המועמד המוביל.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות לכימות ישיר ex vivo של מעורבות TCR ספציפי לאנטיגן ללא גירוי פונקציונלי.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות מוכנות לבדיקה המאפשרות השוואה של תגובות חיסוניות בין מבני חיסונים שונים.
- אנליטיקה: מספק תדירויות של תאים חיוביים לטטראמר כמדד מרכזי להשוואת תנאים ומעקב אחר תגובות לאורך זמן.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לאפיון פנוטיפי של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן להערכת מצב הדיפרנציאציה.
- שימוש חוזר בארגון: מבסס פלטפורמה רב-שימוש לפרופיל אימונולוגי שניתן להחיל על תוכניות של חיסוני וקטורים ויראליים ואימונותרפיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מנגנונית על ידי הפרדה בין תגובות T-cell נגד הווקטור לבין תגובות נגד הטרנס-גן.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה באמצעות דילול טטראמרים מוגדר, פאנלים של נוגדנים ושלבי ליזיס של תאי דם אדומים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של חסרונות אימונוגניים או ביטוי אנטיגן סוב-אופטימלי.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק מידע לתעדוף מותאם סיכון על ידי כימות תגובות חיסוניות שעלולות לפגוע ביעילות או בבטיחות החיסון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהגדרת ציטומטריית זרימה, פיצוי (compensation) ואסטרטגיות gating עבור תת-אוכלוסיות של לימפוציטים ותאי T.
- תלוי בגישה לטטרמרים של MHC I הספציפיים לאפיטופים של הווקטור הוויראלי והטרנסגן, ובתצורה תואמת של ציטומטר הזרימה.
- מחייב נהלי עבודה סטנדרטיים (SOPs) לאיסוף דם, ליזיס של אריתרוציטים וצביעה בנוגדנים כדי לשמור על עקביות בין ניסויים.
- יש להתחשב בהפנמה פוטנציאלית של TCR על ידי הימנעות מדגירה ממושכת של הטטרמר מעבר ל-20 דקות ב-37°C.
- מוגבל למודלים של עכברים בפרוטוקול הנוכחי; התאמה למינים אחרים תדרוש תיקוף של ריאגנטים בעלי תגובתיות צולבת.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Sample Collection
1:21
Staining Set-up
1:59
Tetramer Staining and Preparation of Antibodies
3:17
Staining of Samples
4:24
Lysis of Erythrocytes
5:09
Flow Cytometric Measurement and Analysis
6:53
Results: Quantification of Antigen-specific CD8+ T Cells in Mouse Blood of Lymphoid Organs
7:36
Conclusion
