כימות סימולטני של CD8 וקטור נגד ו- Anti-transgene-ספציפי+ T תאים דרך MHC אני Tetramer מכתים לאחר החיסון עם וקטור ויראלי
November 28th, 2018
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשם זיהוי איכותי vivo של אנטיגן ספציפי CD8+ T תאים. ניתוח אפשרי עם המתלים תא בודד איברים או כמויות קטנות של דם. מגוון רחב של מחקרים דורשות הניתוח של תגובות תא T ציטוטוקסי (חיסון, מחקרים חיסוני סרטן).
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום אימונולוגיה של תאי T ופיתוח חיסונים וקטוריים ויראליים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי רק כמויות קטנות של דם נדרשים, אשר מאפשר מדידות חוזרות ונשנות מאותו עכבר. בנוסף, ניתן לזהות CTLs ספציפיים לווירוסים ולטרנדים מאותה דגימה.
הדגימו את ההליך יהיו יסמין רינופנר, טכנאית, ואניקה רוסלר, סטודנטית לתואר שני. מדידה וניתוח הדגימות יהיה זולטן בנקי, פוסט-דוק. כדי להתחיל, לרסן בבטחה עכבר על פי פרוטוקול הטקסט.
לאסוף 20 microliters של דם בצינור מצופה EDTA מוריד הזנב של עכבר. כאשר עובדים עם טחול, לבודד את הטחול ולהשתמש הבוכנה של מזרק ללחוץ על הרקמה דרך מסננת התא. לאחר ביצוע תזה על אריתרוקיטים, לספור את התאים ולהתאים את הריכוז של המדגם.
הכינו ותייגו צינור Facs אחד עבור כל דגימה, והעברת 100 מיקרוליטרים של השעיית איברים, או 20 מיקרוליטרים של דם לצינור. כאשר עובדים עם טחול, צנטריפוגה השעיית האיבר במשך חמש דקות, ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, מערבולת הצינור כדי resuspend גלולת התא.
לשימוש בכל ערוץ, הכינו גם צינור Facs לדגימה של פיצוי. הכן דוגמה נוספת אחת כפקד לא מזוהם. הכינו צינור עם מאגרי פאקס עם ת'רמרים בדילול האופטימלי שלהם, ומערבולת לערבב.
לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של דילול הטטרמר לכל דגימה, ומערבולת לערבב. הוסף מאגר Facs ללא tetramers לפקדי הפיצוי ולדגימה שאינה מוכתמת. לאחר מכן, הדגירה את הדגימות בתנאים כהים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
בעוד הדגימות דגירה, להוסיף חיץ Facs לצינור. לאחר מכן, הוסף את הנוגדנים למאגר בהתאם לדילולים שצוינו בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט, ומערבולת הפתרון. תלויים ועומדים בשאלה המדעית ניתן להשתמש בשילובי הסמן, מלבד זה המתואר כאן.
הקפד תמיד לכלול נוגדנים נגד CD3 ו- CD8 בלוח. עבור כל ערוץ, להכין צינור עם 200 microliters של חיץ Facs, ולהוסיף microliters אחד של דילול נוגדנים נגד CD8 בצבע שלהם, ומערבולת לערבב. לאחר מכן, אחסן את דילול הנוגדנים כפי שצוין בפרוטוקול הטקסט.
כדי לשטוף את הדגימות, להוסיף מיליטר אחד של מאגר Facs לדגימות וצנטריפוגה. לאחר מכן, להשליך את supernatant, ולנקות כל נוזל שנותר עם מגבות נייר. כאשר עובדים עם דם, להיות זהיר בעת ניקוז את הנוזל שנותר.
לפני תזה של אריתרוציטים, הדם לא ידבק לתחתית הצינור. לחלופין, אתה יכול לספירה על טבעי. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תותר הנוגדנים לכל גלולת תא, ומערבולת בעדינות.
הוסף 50 מיקרוליטרים של כל תערובת פיצוי לבקרת הפיצויים המתאימה, ו- 50 מיקרוליטרים של מאגר Facs לכדור התא של הפקד הבלתי נגוע, ומערבולת בעדינות. כאשר עובדים עם טחול, לשטוף את הדגימות לאחר כתמי נוגדן ישירות עם אחד עד שני מיליליטר של חיץ Facs, וצנטריפוגה במשך חמש דקות. לאחר מכן, השלך את העל-טבעי ורוקן את הנוזל הנותר על מגבות נייר.
הוסף 500 מיקרוליטרים של חיץ ACK לכל דגימת דם, ומערבולת בעדינות. לאחר מכן, הדגירה את הדגימות בחושך במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסף מיליליטר אחד של מאגר Facs לדגימות, וצנטריפוגה.
לאחר מכן, השלך את העל-טבעי ורוקן כל נוזל שנותר במגבות נייר. תזה נכונה של אריתרוקיטים היא צעד מכריע כדי להקל על מדידת Facs, ולכן, כאשר גלולה הוא רטוב למדי, לחזור על תזה של אריתרוקיטים. לשטוף את הדגימות שוב כפי שתואר קודם לכן.
לאחר מכן, השלך את העל-טבעי ורוקן את כל הנוזלים הנותרים על מגבת נייר. לפני קיבעון, ודא כי התאים הם resuspended היטב על מנת למנוע היווצרות של גושים. הוסף 150 עד 300 מיקרוליטרים של מאגר תיקון Facs לכל צינור, ומערבולת לערבב.
לאחר מכן, המשך עם מדידה ציטומטרית זרימה מהר ככל האפשר. ראשית, למדוד את פקדי הפיצוי ולתקן עבור כל חפיפות ספקטרליות. לאחר מכן, הגדר שערים רציפים לבחירה עבור תאים חיוביים ל- CD3 ותאי CD8 חיוביים.
שער על הלימפוציטים באמצעות אזור פיזור קדימה וצד. לאחר מכן, בתוך אוכלוסיית הלימפוציטים, שער על תאים בודדים באמצעות רוחב פיזור קדימה לעומת שטח. השתמש בערוצי CD3 ו- CD8 כדי להתוות לימפוציטים חד-תאיים.
זהה תאי T חיוביים ל- CD8, על-ידי הפעלה בתאים חיוביים ל- CD3 ו- CD8 חיוביים. ודא שתאים נמוכים ל- CD8 כלולים ב- gating. הפצה בתאים חיוביים ל- CD3/CD8 היא שלב קריטי בפרוטוקול זה.
מכיוון שהפעלת תאים מובילה לעתים קרובות לרגולציה נמוכה יותר של CD3 ו/או CD8, יש לכלול גם תאים נמוכים ב- CD3/CD8. לאחר מכן, התווה את התאים החיוביים ל- CD8 לעומת תאי הטטרמר, תוך גת על התאים החיוביים/טטרמר CD8. במידת האפשר, הקלט 20, 000 תאים בשער CD3 חיובי ו- CD8 חיובי עבור כל דגימה.
לבסוף, שמור את המידות כקובץ FCS. בפרוטוקול זה, תאי CD8+T ספציפיים לאנטיגן זוהו כמותית בדגימות דם ורקמות. לאחר אתחול התאים החיוביים ל-CD3 ותאי CD8 חיוביים, זוהו תאים חיוביים לטטמר.
שני tetramers שונים שולבו באותו צינור עבור כתמים, המאפשר כימות בו זמנית של שני ספציפיות CTL שונים. באמצעות פרוטוקול זה, תגובות תא T מאותו עכבר ניתן לעקוב לאורך זמן, כמו רק כמויות קטנות של דם נדרשים עבור כל מדידה. בנוסף, ניתן לנתח פנוטיפים של CTLs ספציפיים לאנטיגן.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב להימנע פעמים דגירה ממושכת, כמו זה יכול להוביל להפנמה של קולטני תא T. מאז גילוי טכנולוגיית הטטרמר, כתמי טטרמר הפכו לכלי חיוני לניתוח תאי T, ומגוון רחב של יישומים, הכוללים צבירת טטרמרים. עתיד מזהיר לתמרים בהירים.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי איכותי ex vivo של תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן באמצעות דגימות דם קטנות או השעיות תאים יחידים מאיברים. זה מועיל במיוחד במחקרים הקשורים לתגובות תאי T ציטוטוקסיים, כגון חיסון ואימונותרפיה לסרטן.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אימונולוגיה של תאי T
- אימונותרפיה לסרטן
- חיסוני וקטורים ויראליים
רקע
- תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן ממלאים תפקיד מכריע בתגובות חיסוניות.
- דגימות דם קטנות מאפשרות מדידות חוזרות מהאותו נבדק.
- זיהוי של CTLs ספציפיים לנגיף וטרנסגן יכול להיעשות בו זמנית.
- טכנולוגיית טטרמרים משפרת את ניתוח אוכלוסיות תאי T.
מטרת המחקר
- לספק שיטה אמינה לזיהוי תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן.
- להקל על חקר תגובות תאי T לאורך זמן.
- לאפשר כימות בו זמני של מגוון ספציפיות CTL.
שיטות ששימשו
- איסוף דגימות דם מעכברים ובידוד ספלנוציטים.
- הכנת דגימות עם טטרמרים ונוגדנים לציטומטריית זרימה.
- שלבי דגירה ושטיפה להבטחת צביעה וליזה נכונים.
- מדידה ציטומטרית בזרימה לזיהוי וכימות תאי T CD8-חיוביים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן בדגימות דם ורקמות.
- זיהוי תאים CD3-חיוביים ו-CD8-חיוביים באמצעות צביעת טטרמר.
- יכולת לעקוב אחר תגובות תאי T לאורך זמן עם נפח דם מינימלי.
- ניתוח בו זמני של מספר ספציפיות CTL הושג.
מסקנות
- פרוטוקול זה יעיל לחקר תגובות תאי T בהקשרים אימונולוגיים שונים.
- הוא מאפשר ניתוח מפורט של אוכלוסיות תאי T ספציפיים לאנטיגן.
- יישומים עתידיים עשויים להרחיב את השימוש בטכנולוגיית הטטרמר במחקר אימונולוגי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables simultaneous quantification of anti-vector and anti-transgene-specific CD8+ T cells from minimal blood samples, supporting iterative monitoring of immune responses in vaccine development. By allowing repeated measurements from the same animal, it reduces animal usage and increases data density in preclinical immunogenicity studies. The method directly informs go/no-go decisions by de-risking target antigen selection and vector construct efficacy early in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying T-cell responses against both vector and transgene antigens in parallel.
- Operational Value: Uses only 20 microliters of blood per measurement, facilitating longitudinal tracking in the same mouse model.
- Predictive Value: Supports predictive confidence in antigen selection by distinguishing immune responses to the antigen of interest from anti-vector immunity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative flow cytometry outputs for antigen-specific CD8+ T-cell frequencies.
- Reproducibility: Includes compensation controls and unstained samples to ensure spectral overlap correction and assay consistency.
- Scalability: Compatible with high-throughput screening of multiple tetramer specificities in a single tube.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase T-cell profiling to preclinical validation by enabling phenotype analysis (e.g., activation status via CD43/CD44/CD62L).
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed immunogenicity stems from the transgene or vector components, informing construct optimization.
- Preclinical Model Relevance: Works with blood or spleen-derived single-cell suspensions, supporting flexible use across anatomical compartments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, specifically supporting early immune profiling after vaccination and prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct ex vivo quantification of antigen-specific TCR engagement without functional stimulation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts that allow comparison of immune responses across different vaccine constructs.
- Analytics: Provides tetramer-positive cell frequencies as a key metric for comparing conditions and tracking responses over time.
- Translational Research: Connects to preclinical work by permitting phenotypic characterization of antigen-specific CD8+ T cells to assess differentiation state.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunological profiling platform applicable across viral vector vaccine and immunotherapy programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by decoupling anti-vector from anti-transgene T-cell responses.
- Operational Value: Ensures standardization through defined tetramer dilutions, antibody panels, and erythrocyte lysis steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of immunogenic liabilities or suboptimal antigen expression.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying immune responses that may compromise vaccine efficacy or safety.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, compensation, and gating strategies for lymphocyte and T-cell subsets.
- Dependent on access to MHC I tetramers specific to viral vector and transgene epitopes, and compatible flow cytometer configuration.
- Necessitates standardized SOPs for blood collection, erythrocyte lysis, and antibody staining to maintain inter-experiment consistency.
- Must account for potential TCR internalization by avoiding prolonged tetramer incubation beyond 20 minutes at 37°C.
- Limited to murine models in the current protocol; adaptation to other species would require validation of cross-reactive reagents.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Sample Collection
1:21
Staining Set-up
1:59
Tetramer Staining and Preparation of Antibodies
3:17
Staining of Samples
4:24
Lysis of Erythrocytes
5:09
Flow Cytometric Measurement and Analysis
6:53
Results: Quantification of Antigen-specific CD8+ T Cells in Mouse Blood of Lymphoid Organs
7:36
Conclusion
