Name: שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: למדו פרוטוקול אמין לבידוד פריציטים מוחיים מעכברים C57BL/6 ללא אנטיביוטיקה. השיטה מספקת טוהר גבוה ותפוקת תאים מיטבית למחקר מחלות נוירולוגיות ותפקוד מוחי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LT ו-FG ניתנו על ידי סוכנות הידיעות הלאומית דה לה רצ'רצ'ה (ANR, ANR-15-JPWG-0010) במסגרת התוכנית המשותפת של האיחוד האירופי – מחקר מחלת ניווניות (JPWG) עבור פרויקט כדור שלג.

כל הניסויים נערכו בעקבות הנחיות המכון לשימוש וטיפול בבעלי חיים. בהתאם לחקיקה הצרפתית, אושרה מתקן בעלי החיים באוניברסיטת Artois על ידי הרשויות המקומיות (התייחסות: B62-498-5). בהתאם לחקיקה של האיחוד האירופי (הוראה 2010/63/האיחוד האירופי), כל ההליכים אושרו על-ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים והשימוש (קומיא ד'אתאן, הכוונה: C2EA 75) ומשרד המחקר הצרפתי (התייחסות: 2015090115412152).
1. הכנת פתרונות
<ol><li>להכין 500 mL של מאגר כביסה A (WBA): 10 מ"מ פתרון HEPES בתמיסה מלח מאוזן של האנק (HBSS). חנות ב -4 ° c.</li>
	<li>הכינו 500 מ ל של מאגר כביסה B (WBB): 0.1% בסרום שיבמין (BSA) עם פתרון של 10 מ"מ HEPES ב HBSS. חנות ב -4 ° c.</li>
	<li>הכינו 300 mL של 30% הפתרון תוספי ב wba על ידי ערבוב את הפתרון לילה בטמפרטורת החדר. אוטוקלב את הפתרון ב 110 ° c עבור 30 דקות לפני השימוש. לאחר אוטוקלינג, תן את הפתרון לנוח בטמפרטורת החדר עבור 2-3 h. אחסן את הפתרון ב-4 ° c.</li>
	<li>הכינו 100 mL של 0.1% bsa פתרון בפתרון תוספי קר. טלטל במרץ עבור 3-4 דקות ולאחסן ב -4 ° c.</li>
	<li>הכינו מדיה מלאה של הנשר השונה ביותר של Dulbecco (DMEM) על ידי המסת 20% סרום עגל, 2 מ"מ גלוטמין, 50 μg/mL בג, 1% ויטמינים, 2% חומצות אמינו בסיס הנשר הבזאלי (BME) במדיה DMEM בסיס וחנות ב 4 ° c. להוסיף 1 ng/mL בסיסי הצמיחה פיברוהפיצוץ גורם (bFGF) לפני השימוש.</li>
	<li>הכנת מדיית כלציט מלאה על-ידי הוספת תוספי גדילה (בתנאי מדיה לכליים) ו -20% סרום לעגל עוברי (FCS) בתוך התקשורת הבזכית והחנות ב -4 ° c.</li>
</ol>2. התאוששות מרקמת המוח והסרת מניגס
<ol><li>לעקביות, להשתמש בעכברים של גיל דומה ומגדר זהה בכל קבוצה של חילוץ. השתמש במקלט לבעלי חיים נטול הפתוגן ומספק גישה למים מבית מודעות. כדי להבטיח יעילות ושימוש מינימלי של בעלי חיים, להימנע מאובדן של חומר רקמה.</li>
	<li>המתת חסד C57BL/6J, בת 4-6 שבועות, עכברים זכרים (מעבדות יאנייה, לה ג'נסט-סאינט-האי, צרפת).</li>
	<li>הבלו במהירות את רקמת המוח בתנאים סטריליים, למנוע כל נזק לרקמות. בזהירות מניחים את הרקמה ב 40 mL של תמיסת מלח קר פוספט מאגור (PBS).</li>
	<li>העבר את רקמת המוח ב-PBS הקרה לצלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ).</li>
	<li>מניחים את רקמת המוח על מנגב סטרילי נטול-סיבים יבשים עם מלקחיים תשר מעוקל, להסיר את המוח החצי, הסטריאטום ואת העצבים העורף.<ol>
<li>להסיר את כל משחת הקרום הגלויים עם מספוגית כותנה. מניחים את רקמת המוח הפוך ולפתוח את האונות עם ספוגית כותנה באמצעות משיכות אור כלפי חוץ. להסיר את כל כלי הדם הגלויים.</li>
		<li>מניחים את רקמת המוח חינם בצלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) עם 15 מ ל של WBB קר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הומוגון
<ol><li>העבר את הרקמה לצינור מרגמה מטחנת רקמות Dounce ולהוסיף 3-4 mL של WBB עם מלקחיים.</li>
	<li>החמול את הרקמה עם ' משוחרר ' כתש 55 פעמים. שטפו את הפסל הרופף באמצעות WBB. עכשיו, הגבר את הבשלה. "</li>
	<li>לחלק את התערובת באופן שווה לתוך 2 50 מ"ל צינורות ולהוסיף 1.5 x נפח של קר 30% BSA-dextran, במרץ לטלטל את צינורות לערבב את השקר.</li>
</ol>4. בידוד של שבר כלי הדם
<ol><li>לאחר לטלטל במרץ את הצינורות, צנטריפוגה את הצינורות עבור 25 דקות ב 3,000 x g ו 4 ° c.</li>
	<li>להעביר את supernatant (יחד עם שכבת המיאלין העליון) כדי 2 צינורות חדשים, ו צנטריפוגה את הצינורות עבור 25 דקות ב 3,000 x g ו 4 ° c. לשמר את כדורי מצנטריפוגה הראשון על ידי הוספת 3 מ ל של WBB קר (לשמור את הגלולה ב 4 ° c).</li>
	<li>חזור על שלב 4.2 ושמור בזהירות את כדורי מ 2nd צנטריפוגה.</li>
	<li>להיפטר תוספי ואת המיאלין עם פסולת רקמות מן הצינורות משלב 4.3. שמור על כדורי ב-WBB קר.</li>
	<li>הבריכה את התוכן של צינור 1 ו-tube 2 משלב 4.1 ולפצות על הנפח הסופי של 10 mL עם קר WBB.</li>
	<li>חזור על שלב זה עבור צינורות משלב 4.2 וצעד 4.3. הערה: לבסוף, יש 3 צינורות מ 3 centrifugations.</li>
	<li>הנתק את הגלולה עם 6 למעלה ולמטה משיכות באמצעות הצינורות 10 מ"ל, עד לא הגושים הגלויים של כדורי נותרים.</li>
	<li>בעזרת מסנן ואקום מסנן רשת שינוי ניילון, לסנן את השעיות התא של כל צינור. הערה: שלב סינון זה חשוב כדי להסיר כלי זמן ארוכים יותר/גדולים יותר דרך מסנן רשת השינוי.</li>
	<li>לשחזר ולהשעות מחדש את נימי ידי גירוד המסנן בעזרת מלקחיים עצה שטוחה או מגרד ב WBB בטמפרטורת החדר. לסנן את ההשעיה עם מסנן טרי כדי לשחזר נימים יותר</li>
	<li>לחלק את פילטרט באופן שווה לשתי שפופרות ו צנטריפוגה עבור 7 דקות ב 1,000 x g ו RT. הערה: במהלך צעד צנטריפוגה זה, הכן את הפתרון האנזימטי. קבע את עוצמת ה-WBB הדרושה בהתאם למספר בעלי החיים בהם נעשה שימוש (ראה טבלת חומרים). להוסיף 1x של DNase 1 ו-1x של טוסיל-L-לייסיל-כלורמתאן הידרוכלוריד (TLCK) (ראה טבלת חומרים) ב wbb ו-לחמם מראש עד 37 ° c.</li>
	<li>לאסוף את כדורי משלב 4.10 בצינור אחד עם WBB מראש מחומם עם אנזימים. הוסף/י/י/י/י מחמם מחומם מראש. מניחים את הצינור באמבט מים שולחן לרעוד ב 37 ° c עבור בדיוק 33 דקות.</li>
	<li>הפסיקו את תגובת האנזים על ידי הוספת 30 מ ל של WBB קר. צנטריפוגה את ההשעיה עבור 7 דקות ב 1,000 x ו RT.</li>
	<li>להיפטר supernatant בזהירות לנתק את הגלולה ב-WBB עם 6 למעלה ולמטה משיכות באמצעות צינורות 10 מ"ל. שלב זה צריך להיות קפדני פחות יחסית מהר יותר.</li>
	<li>צנטריפוגה את ההשעיה עבור 7 דקות ב 1,000 x ו RT. הערה: במהלך שלב זה, להשליך את הציפוי מתוך מנות התרבות ולשטוף אותם פעם אחת עם DMEM בטמפרטורת החדר. מנות תרבות תא המעיל עבור לפחות 1 h ב RT.</li>
	<li>להיפטר supernatant מן הצינור שהושג בשלב 4.14, ו הנתק את הגלולה במדיה חדשה DMEM הצלחת התאים (יום 0, P0) ב 9 בארות של 6-היטב צלחות (1 גם של 9.6 ס"מ2 כל).</li>
</ol>5. התפשטות קרום הלב המוחית
<ol><li>שמרו על תרביות תאים ב-37 ° c ו -5% CO2 באינקובטור סטרילי. החלף את מדיית התרבות לאחר 24 שעות (יום 1) של ציפוי התאים על ידי הסרת הפסולת בזהירות. לאחר יום 1, לשנות את מדיית התרבות בכל 48 h.</li>
	<li>צפו בתרבית התאים לפחות 7-8 ימים. בשלב זה, גידולים סלולריים על החלק העליון של unilayer אנדותל צריך להיות נצפה.</li>
	<li>העבר את התאים ביום 8-10 (בהתאם לשטף) בתווך תרבות קרום המוח למעבר 1 (P1) על לוחות תרבות מצופים ג'לטין. . לשנות את מדיית התרבות בכל יומיים שימו לב לתאים במשך 6-7 ימים. תאים מפוצלים ברציפות שוב למעבר 2 (P2) ביום 17 [ומעבר 3 (P3) ביום 24 רק אם נדרש], גדל במדיום כלציט בצלחות מצופה ג'לטין. הערה: התאים יהיו מוכנים לניסויים/התבוננות בכמעט 80-90% שליטה.</li>
</ol>

<ol><li>Azevedo, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+modulate+myelination+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pericytes modulate myelination in the central nervous system.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (8), 5523-5529 (2018).</li>
<li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+pericytes+regulate+cerebral+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li>
<li>Gianni-Barrera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-BB+regulates+splitting+angiogenesis+in+skeletal+muscle+by+limiting+VEGF-induced+endothelial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 883-900 (2018).</li>
<li>Teichert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte-expressed+Tie2+controls+angiogenesis+and+vessel+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pericyte-expressed Tie2 controls angiogenesis and vessel maturation.</a> Nature Communications. 8, 16106(2017).</li>
<li>Dave, J. M., Mirabella, T., Weatherbee, S. D., Greif, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+ALK5%2FTIMP3+Axis+Contributes+to+Endothelial+Morphogenesis+in+the+Developing+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericyte ALK5/TIMP3 Axis Contributes to Endothelial Morphogenesis in the Developing Brain.</a> Developmental Cell. 44 (6), 665-678 (2018).</li>
<li>Franco, M., Roswall, P., Cortez, E., Hanahan, D., Pietras, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+promote+endothelial+cell+survival+through+induction+of+autocrine+VEGF-A+signaling+and+Bcl-w+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Pericytes promote endothelial cell survival through induction of autocrine VEGF-A signaling and Bcl-w expression.</a> Blood. 118 (10), 2906-2917 (2011).</li>
<li>Saint-Pol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+Pericytes+ABCA1+Expression+Mediates+Cholesterol+Efflux+but+not+Cellular+Amyloid-beta+Peptide+Accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Brain Pericytes ABCA1 Expression Mediates Cholesterol Efflux but not Cellular Amyloid-beta Peptide Accumulation.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 30 (3), 489-503 (2012).</li>
<li>Sagare, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+loss+influences+Alzheimer-like+neurodegeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pericyte loss influences Alzheimer-like neurodegeneration in mice.</a> Nature Communications. 4, 2932(2013).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+degeneration+causes+white+matter+dysfunction+in+the+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system.</a> Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).</li>
<li>Claudio, L., Raine, C. S., Brosnan, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+persistent+blood-brain+barrier+abnormalities+in+chronic-progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Evidence of persistent blood-brain barrier abnormalities in chronic-progressive multiple sclerosis.</a> Acta Neuropathologica. 90 (3), 228-238 (1995).</li>
<li>Nishioku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+of+brain+pericytes+from+the+basal+lamina+is+involved+in+disruption+of+the+blood-brain+barrier+caused+by+lipopolysaccharide-induced+sepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Functions+and+Mechanisms+of+Pericytes+in+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Diverse Functions and Mechanisms of Pericytes in Ischemic Stroke.</a> Current Neuropharmacology. 15 (6), 892-905 (2017).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PDGF-BB-SOX7+axis-modulated+IL-33+in+pericytes+and+stromal+cells+promotes+metastasis+through+tumour-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The PDGF-BB-SOX7 axis-modulated IL-33 in pericytes and stromal cells promotes metastasis through tumour-associated macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11385(2016).</li>
<li>Hesp, Z. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+NG2-Cell-Dependent+Angiogenesis+and+Scar+Formation+Alter+Axon+Growth+and+Functional+Recovery+After+Spinal+Cord+Injury+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Proliferating NG2-Cell-Dependent Angiogenesis and Scar Formation Alter Axon Growth and Functional Recovery After Spinal Cord Injury in Mice.</a> Journal of Neuroscience. 38 (6), 1366-1382 (2018).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor-B+enhances+glioma+angiogenesis+by+stimulating+vascular+endothelial+growth+factor+expression+in+tumor+endothelia+and+by+promoting+pericyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment.</a> American Journal of Pathology. 162 (4), 1083-1093 (2003).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+pericytes+for+therapeutic+approaches+to+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders.</a> Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).</li>
<li>Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146+coordinates+brain+endothelial+cell-pericyte+communication+for+blood-brain+barrier+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (36), 7622-7631 (2017).</li>
<li>Thomsen, M. S., Birkelund, S., Burkhart, A., Stensballe, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+deposition+of+basement+membrane+proteins+by+primary+brain+capillary+endothelial+cells+in+a+murine+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and deposition of basement membrane proteins by primary brain capillary endothelial cells in a murine model of the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (5), 741-754 (2017).</li>
<li>Yamazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Cell+Senescence+Contributes+to+Blood-Brain+Barrier+Breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Vascular Cell Senescence Contributes to Blood-Brain Barrier Breakdown.</a> Stroke. 47 (4), 1068-1077 (2016).</li>
<li>Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+isolation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+mouse+brain+microregions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions.</a> Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).</li>
<li>Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+proteoglycan+is+expressed+exclusively+by+mural+cells+during+vascular+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis.</a> Developmental Dynamics. 222 (2), 218-227 (2001).</li>
<li>Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+Proteoglycan-Dependent+Contributions+of+Pericytes+and+Macrophages+to+Brain+Tumor+Vascularization+and+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression.</a> Microcirculation. 23 (2), 122-133 (2016).</li>
<li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

קרום הלב מוחין הוא חלק אינטגרלי של NVU ולשחק תפקיד פעיל אינדוקציה ותחזוקה של BBB24. באופן דומה, התפקיד של תאים אלה בהפרעות ניווניות שונים הפתווגיות כלי דם הוא מסקרן. מכאן, מודל תא מרכזי להפקת פלט יעיל יספק פלטפורמה יעילה למחקרים בעלי מבחנה.
ישנם פרוטוקולים שונים שהוצעו לבידוד של קרום הלב העיקרי (איור 4). טיגס ואח '17 הציע שיטה כולל רקמה קורטיקלית עם מניגס. גישה זו היא הטפיקציה של רקמות מ 6 עכברים (37 ° c, 70 דקות העיכול עם אנזימים papain/DNase) ואחריו צעד התפוררות באמצעות 21 G ו 18 G מחטים. פרוטוקול זה מציע הפרדה של צעד אחד (צנטריפוגה בתוך 22% BSA/ערוץ PBS) התשואות לפחות 2 קולגן אני מצופה בארות של צלחת 6-היטב. התאים מתוחזקים במדיום צמיחת התאים האנדותל (ECGM) עד מעבר 3 ומאוחר יותר באמצעי גדילה (PGM) עבור תאי המעבר כדי לקדם התפשטות כריתת קרום המוח. בגישה דומה אחרת, צ'ן ואח '18 הדיסוציאציה של רקמת העור על ידי קוצצת את הרקמה עם להב תער מעוקר ואת העיכול רקמות עם קולגן וכלי/dnase עבור 90 דקות ב 37 ° c. בעקבות הפרדה של צעד אחד (צנטריפוגה ב -22% BSA) של התאים, שכבת המיאלין מוסרת והגלולה נשטפה פעמיים ב-ECGM. כלי המיקרו מצופים ב -3 בארות של קולגן שאני מכוסה בצלחות בנות 6. לאחר שהגיעו למפגש, התאים מגיעים פעמיים ומאוחר יותר מתוחזקים PGM. בסופו של דבר, אם התאים מועברים ביחס של 3, אנחנו יכולים להשיג 27 וולס של לוחיות 6-טוב רק בשימוש של 10 עכברים בתחילת הפרוטוקול.
בתומסן ואח ', המחברים ממליצים על בידוד קרום הלב של המוח באמצעות העיכול האנזים בעל שני השלבים19. . ודגימות מוח נחתכו לחתיכות קטנות החלקים רקמה לעבור את תגובת האנזים הראשון ב-כלקולאז/DNase I עבור 75 דקות ב 37 ° c, בעקבות צעד אחד של הפרדה 20% BSA. הגלולה נאסף ועוד מתעכל ב-קולגן/dispase/DNase I עבור 50 דקות ב 37 ° c. שלב זה מלווה בהפרדה של 33% חלחול ושטף עוד פעם אחת. כלי המיקרו מצופים במנות מצופות 35 מ"מ בקולגן הרביעי/fibronectin. התפשטות קרום הלב היא המועדף על 10% FCS ו gentamicin סולפט ב DMEM עבור 10 ימים. בגישה נוספת לעיכול של שני צעדים, יאמאצאקי ואח '. מראים מחדש את הרקמההמחפירהב-dmem הקרה. בתגובת האנזים הראשון, הדגימות מטופלות עם הקולאז/DNase I עבור 75 דקות ב 37 ° c. בעקבות צעד אחד צנטריפוגה, את הגלולה הוא שטף שוב פעם אחת תגובת האנזים השני הוא יזם בשנת הקולגן/dispase עבור 60 דקות ב 37 ° c. בעקבות הפרדה של צעד אחד, הגלולה הוא מושעה מחדש ו centrifuged בפתרון BSA 22%. לבסוף, הגלולה מיקרוכלי דם מושהה. ומצופה בצלחת של 6 מטרים עבור 5 מוחות העכבר, 1 טוב של צלחת 6-באר יכול להיות מצופה. כדי להשיג את קרום הלב, תרבויות אנדותל הם החוצה שלוש פעמים בזמן שנשמר במוח העכבר תא אנדותל (mBEC) בינונית II. קראוץ ' ו Doetsch20 מציעים שיטת טיהור כלציט על ידי facs. דגימות רקמה מקליפת המוח-אזור תת-חדרית של מוחי העכבר הם מיקרו-גזור ובטחון ביסודיות עם אזמל. לאחר הקולגן/הדגירה האנזים במשך 30 דקות ב 37 ° c, הרקמה מתעכל מופרד מאלין ופסולת centrifuged ב 22% v/v הפתרון חלחול. השעיית התא הוא לאחר מכן מודענב נוגדנים מצובזות בשנת פלואורוסקופים ניתוח ומיון של FACS. התאים ממוינים מצופה קולגן מצופה בארות של 24 צלחת הבאר. הוא הציע כי קליפת אחד מניב מספיק תאים עבור ציפוי אחד ב 1 היטב של צלחת 24.
גם אם פרודוקטיבי, שיטות אלה מגיעות עם מספר מגבלות, מן השימוש של מספר רב של בעלי חיים עבור בידוד אצווה אחת כמות מוגבלת מאוד של פלט.
במהלך הפיתוח של הפרוטוקול המוצע, הצלחנו להשיג תפוקה גבוהה: 9 בארות של צלחת 6-היטב מתוך מעטים כמו 10 עכברים. למטרה זו, הסרת הקרום מבטיח את ההסרה צעד אחד של כלי גדול מן הרקמה. מטחנת הרקמה של הדיאונקיה מתאימה יותר לרקמות רכות כגון המוח. הוא גם מבטיח הפחתת דגימה עם הפילינג הרופף, הומוגון עם הפסל הצמוד, ומונע נזקים סלולאריים מיותרים. אחת המטרות העיקריות בפרוטוקולי תרבות התא הראשוני היא בזבוז מינימלי של רקמות ושליפה מורחבת של ואצלב המוח. בפרוטוקול המוצג, זה מושגת על ידי צנטריפוגה חוזרים של dextran-BSA רקמה המרקמת העור אכל. גישה שלושה שלבים צנטריפוגה מסייעת לשחזר כמויות גדולות של ואצלב מן רקמת המגון ate. זה מספק 3x התאוששות משופרת של כלי מיקרו. בעקבות הפרדה, סינון הוא הצעד החיוני הבא, אשר מעדיף את החרגה של תא שריר חלק הקשורים כלי גדול. כפי שהוזכר לפני שילוב של אנזימים שונים הוצע לעיכול אנזימטי. בעוד DNase ו הקולגן/dispase משמשים כדי להפחית את הגושים של תאים ולבודד תאים יחיד בהתאמה, חשוב מאוד למנוע מוות של תאים בסביבה פולשנית כגון זה מונע על ידי TLCK, אשר ובכך מגביר את התשואה הסופית. בתחילה, המעבר הראשון מותר לגדל מונאולייר אנדותל, שמאוחר יותר תומך בצמיחת קרום הלב הצמוד בunilayer. כיוון שהישרדותה של תאי האנדותל הראשוניים מופחתת על-ידי הפסחתה, היא מגבירה את ההסתברות לאיחזור כדוריות דם. כמו-כן, פרוטוקול זה מעסיק מעבר נוסף המבטיח הימנעות מזיהום תאי האנדותל. יש לציין כי עם מספר גבוה יותר של תאים מ P2, את התלות בהמשך ההתיישנות של התאים מופחת. בנוסף, הוא מפחית את האפשרות של צמיחה קרום המוח שהוא השיג בתאי שריר חלקה, אשר מתרבים בקצב גבוה בהרבה.
על מנת להשיג תפוקה גבוהה יותר, ישנם מספר שלבים קריטיים ויש לבצע אותם באופן מדויק ביחס לטמפרטורה וזמן. ערבוב של רקמת הומוזה לתוך BSA-dextran צריך להיות מהיר. הדיסוציאציה גלולה לאחר השלבים צנטריפוגה צריך להיות מהיר כדי למנוע מוות תאים. יתר על כן, 33 מינימום של עיכול אנזימטי צריך להיעשות בדיוק ובטיפול. אחת המגבלות עבור פרוטוקול זה היא המשך היום 7-8 שunilayer אנדותל מותר לצמוח ולהקל עוד יותר את התפתחותם של קרום המוח. ככל הנראה, הבידוד של כלי הדם הוא btter, הצמיחה של unilayer הוא מהיר יותר, ולכן יש מספר מוגבר של קרום הלב. מומלץ לא להשתמש פחות מ 10 עכברים בכל חילוץ כדי להבטיח מספר הולם של שברים microvascular כדי לתמוך בצמיחה קרום הלב עוד. אם הנקודות הנ ל מעקב בזהירות, צפיפות התא הרצויה עבור תרבות קרום המוח ניתן להשיג בקלות.
במודלים של חוץ גופית מספקים פלטפורמה אפשרית לפיתוח מודלים נגזרים לקבלת מידע נוסף על הרלוונטיות הפתופסולוגית ותקשורת בין התאים האחרים של NVU במהלך הפרעות נוירולוגיות. ניתן לשלב בין כדוריות הקרום הבודדות בתרבות דו-תאית (עם תאי אנתל או גליאל) ובתרבות תלת-תאית (תאי האנדותל וגליאל). התפתחות מודלים אלה לא נדונה כאן. לסיכום, פרוטוקול זה מספק גישה אחת לבידוד של תאים ראשוניים עם תפוקה גבוהה יותר ופלטפורמה טובה יותר למחקר מתורבת הקשור לביולוגיה מוחית קרום הלב.

קרום הלב הם מרכיב חיוני של היחידה נוירונימי (NVU), אשר כוללת יחידה תפקודית עם תאי המוח מוחין של מכשול המוח בדם (BBB), תאי גליה, מטריקס מטריתאי ונוירונים. כולציטים הם חלק חיוני בתפקוד מוסדר של מערכת העצבים המרכזית (CN) כפי שהם משמשים כאחד הממשקים עבור חילופי מידע מולקולרי ותאי.
קרום המוח מוטבע בצד האבלומיאלי של כלי המיקרו-כלים, והם חיוניים להקמת1 ולשמירה על2 הפיזיולוגיה של bbb. מספר יצירות האחרונות הדגישו גם את תפקידה של קרום הלב המוח באנגיוגנזה3 והתבגרות הספינה4, אנדותל מורבגנזה5 והישרדות6, ובשליטה על מטבוליזם המוח כולסטרול7. וחשוב מכך, הדיסרגולציה בכל אחד מהתהליכים הללו מהווה הסימנים ההיכר של מחלות ניווניות.
אכן, קרום הלב הם הכרח פונקציונלי לתפקוד BBB נורמלי והגנה שלה מפני ההתקדמות של מחלות נוירולוגיות מספר. הפיזיולוגיה וההפסד של קרום המוח הם המכנה המשותף של מחלת האלצהיימר8, אובדן עצבי במהלך בתפקוד החומר הלבן9, טרשת נפוצה10, ספיגה אנצפלופתיה11, בשלב אקוטי שבץ מוחי12 ובהפרעות נוירולוגיות אחרות. קרום הלב הם גם אינסטרומנטלי הגידול גרורות13. מעניין, קרום הלב הוכחו גם להפגין תפקיד החילוץ לאחר טראומה והפרעות נוירולוגיות: ב reמיאלונציה במוח1, משיחת איסכמי, פגיעה בחוט השדרה14 וקידום אנגיוגנזה15. הרגישות של קרום הלב כדי לחזק את הביטוי הפתופסולוגי של טראומה נוירולוגית והפרעות הופך אותם מטרה טיפולית פוטנציאלית16.
במודלים של מחקר בתחום הפריולוציטים בבית BBB הם כלים חשובים לניהול מחקרים נרחבים. מודלים אלה מספקים פלטפורמה למחקרים משוכללים יותר על ידי ייצוג דגמי העבודה של BBB ועוד. לדוגמה, ניתן להשתמש במודלים אלה כדי להבין את הפיזיולוגיה התאית בתוך קרום הלב ובין סוגי תאים אחרים של NVU. כמו כן, במודלים של חוץ גופית הם כלי חקירה ממקור ראשון לבדיקת ההשפעה הפרמקולוגית של תרופות חדשות ומולקולות על כלציטים. מודלים אלה יכולים לשמש גם כדי להבין את התפקיד הפתופסולוגי של קרום הלב ביחס להפרעות נוירולוגיות. למרות זאת, התפתחות במודלים של מבחנה דורשת תפוקה מוגברת כדי לאפשר חופש ניסיוני. מודלים אלה אמורים להיות קלים ומהירים, ולהקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות. בנוסף, היכולת לפתח מודלים כאלה לתוך מודלים של תרבות תא כפול ומשולש רצוי.
קיימים פרוטוקולים רבים שפותחו. הפרוטוקולים המוצעים על ידי תיגבור ואח '17, חן ואח '18, תומסן ואח '19, יאצאקי ואח '20, ו קראוץ ' ו doetsch21 הם גישות ראוי לספק את רוב הצרכים. כל השיטות הללו מפיקות תוצאות אפקטיביות, אך התלות במספר רב של בעלי חיים ניסיוניים נותרה מכנה משותף לפרוטוקולים אלה. לכן, זה הופך להיות הכרחי כדי לפתח שיטת פלט גבוהה שיכולה לבודד ולטהר את קרום הלב עם היעילות המירבית האפשרית. בפרוטוקול זה, טוהר התאים שהתקבלו לאחר מעבר שני מאומת עם מספר סמנים לקרום הלב. בדקנו עבור טסיות נגזר מקדם הצמיחה קולטן-β (PDGFR-β), אשר משמש כסמן קלאסי של קרום הלב17, ועבור NG2 (תא העצב-glial אנטיגן 2), שהוא סמן של כריתת קרום המוח בתיווך מורפולגנזה22 ו vascularization23. בדקנו גם עבור אשכול של בידול 146 (CD 146), אשר דווחה כאחת המולקולות מבוטא בקרום הלב17,18.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת קרום הלב העיקרי מעכברים (סוג פראי או transgenics) כי יספק את כל הדרישות הנ ל עם תפוקה גבוהה. אנו מעסיקים אנטיביוטיקה וimmunopanning שיטה מבוססת בחירה חינם של התפשטות עבור קרום הלב הראשי המוח, אשר יוכיח את עצמו מודל יעיל לניהול לימודי מבחנה.

<table><tbody><tr><td>חומצות אמינו BME</td><td>Sigma</td><td>B-6766</td><td>יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>Basal DMEM media</td><td>Invitrogen</td><td>316000083</td><td>Store ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי</td><td>Sigma</td><td>F-0291</td><td>חנות ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>חנות BSA</td><td>Sigma</td><td>A-8412</td><td>ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>קולגנאז dispase</td><td>Sigma</td><td>10269638001</td><td>הכן תמיסת מלאי פי 10 ב-PBS-CMF סטרילי. סנן את התמיסה עם 0.22 &mu; מסנן מזרק m ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. הערה: לשלב עיכול האנזים של הפרוטוקול, עבור כל סט של 10 עכברים למיצוי, 300 ומיקרו; נדרש L של 10x קולגנאז דיספאז.</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma</td><td>31398</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>11284932001</td><td>הכינו תמיסת מלאי 1000X על ידי המסת 100 מ"ג ב-10 מ"ל מים סטריליים ואחסנו בטמפרטורה של -20&0 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא</td><td>G-2500</td><td>הכן את ציפוי העבודה על ידי הכנת תמיסת ג'לטין 0.2% ב-PBS-CMF סטרילי (8 גרם/ליטר NaCl, 0.2 גרם/ליטר KCl, 0.2 גרם/ליטר KH2PO4, 2.86 גרם/ליטר NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). חיטוי התמיסה למשך 20 דקות לפחות ב-120 מעלות; C ושומרים בטמפרטורת החדר. כלי תרבות לציפוי לפחות 4 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>חנות Gentamycin</td><td>Biochrom AG</td><td>A-2712</td><td>ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>חנות גלוטמין</td><td>Merck</td><td>I.00289</td><td>ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>חנות HBSS</td><td>Sigma</td><td>H-8264</td><td>ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>חנות HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-0887</td><td>בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biocoat</td><td>354230</td><td>הכן תמיסת ציפוי עובדת של Matrigel על ידי דילול מלאי ב-DMEM קר ביחס של 1:48 כאשר הריכוז הסופי שלו יהיה 85 ומיקרו; גרם/סמ"ר. יש לצפות כלי תרבית תאים לפחות למשך שעה בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>מעבדות המחקר</td> של <td>Pericyte Medium-mouse</td> Sciencell <td>1231</td><td>חנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone</td><td>Sigma</td><td>T-7254</td><td>הכן תמיסת מלאי 1000X ב-WBA על ידי המסה של 16 מ"ג ב-10.88 מ"ל של WBA ליצירת תמיסה של 4 מ"מ ואחסון ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>ויטמינים</td><td>סיגמא</td><td>B-6891</td><td>חנות ב -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td><דרישות ציוד >חזקות</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלי סינון</td><td>ספר, רשת ניילון, נקבוביות</td><td></td><td></td>60 מיקרון</tr><tr><td>ציוד מעבדה</td><td>צנטריפוגת</td><td></td><td></td>רוטור דלי נדנדה</tr><tr><td>אמבט מים עם תסיסה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים למינרי: BSL2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלי זכוכית (כל הרכיבים יהיו חום מעוקר)</td> <td>מטחנת רקמות Dounce עם עלי זכוכית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עלי I: 0.0035 - 0.0065 אינץ'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עלי II: 0.0010 - 0.0030 אינץ'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכלול מסנן ואקום עם בסיס</td><td></td><td></td><td></td>תמיכה במסנן זכוכית מחוספסת נקבוביות גסה</tr><tr><td>כלי חיתוך כירורגיים (כל הרכיבים לעיקור בחום)</td> <td>מלקחיים, מספריים, מבער בונסן כותנה ספוגיות, מד</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

בשנים האחרונות הפכו כיום למרכז מחקר נרחב בביולוגיה ובפתולוגיה של כלי הדם. החשיבות של קרום הלב במבנה מחסום הדם והפיזיולוגיה מומחש כעת, אך הבסיס המולקולרי שלו נותר ברובו לא ידוע. כתפקיד הפתופסולוגי של קרום הלב המוחית בהפרעות נוירולוגיות מרתקת ובעלת חשיבות רבה, מודלים בלתי מתורבת לא רק מתאים מספיק אלא גם מסוגל לשלב טכניקות שונות למחקרים אלה. מספר שיטות הוצעו כמודלים של מבחנה להפקת קרום הלב, למרות שפרוטוקול ללא אנטיביוטיקה עם תפוקה גבוהה רצוי. החשוב ביותר, שיטה כי יש מוגברת תפוקה לכל החילוץ מפחית את השימוש של בעלי חיים נוספים.
כאן, אנו מציעים שיטה פשוטה ויעילה להפקת קרום הלב מוחין עם תפוקה גבוהה מספיק. רקמת המוח העכבר המגון מעורבב עם פתרון BSA-dextran להפרדה של פסולת רקמות וכלה מיקרונימי. אנו מציעים הפרדה של שלושה צעדים ולאחר מכן סינון כדי להשיג filtrate עשיר מיקרוכלי. עם שיטה זו, את כמות שברי מיקרוכלי דם שהתקבלו מ 10 עכברים מספיק זרעים 9 בארות (9.6 ס מ2 כל אחד) של צלחת 6-היטב. מעניין ביותר עם פרוטוקול זה, המשתמש יכול להשיג 27 בארות עשיר כלציט (9.6 ס מ2 כל אחד) במעבר 2. הטוהר של התרבויות לקרום הלב מאושרות עם ביטוי של סמנים לקרום הלב הקלאסי: NG2, PDGFR-β ו CD146. שיטה זו ממחישה את הכלי היעיל והריאלי לחקר החוץ של המחקרים הפיזיולוגיים והפתופיזילוגיים על כקרום הלב.

פרוטוקול זה (איור 1) מניב ביעילות 9 בארות (מתוך 6 צלחות) בזמן זריעה ב-P0 (איור 2א (P0: יום 1)).
מ P0 כדי P2, יש מאפיינים מורפולוגיים ספציפיים שבהם תאי האנדותל (מסומנים על ידי חיצים לבנים) ו-s עלייה הדרגתית בקרום הלב (מצוין על ידי חיצים שחורים) ניתן לצפות. ב P0, התאים האנדותל מוארך המתפתחים ממיקרוכלים הם בשפע (איור 2A, P0: יום 3), בעוד שפע של תאים מאורכים כאלה מופחת ב P1 ונעדר ב P2. להיפך, קרום הלב מופיעים כתאים מרובע אשר שופע P2 (איור 2A, P2: יום 18).
כדי לאשר את טוהר תרבות קרום הלב ב P2, בדקנו את הביטוי של NG2, CD146 ו pdgfr-beta כמו סמנים לקרום הלב באמצעות ה-PCR כמותי (איור 2B), אימונוציטוטוכימיה (איור 2ג), ואת הכתם המערבי (איור 3). קרום הלב ב P2 לבטא רמות גבוהות יותר של CD146, NG2 ו PDGFR-β בהשוואה לביטוי במוח העכבר הכולל (Ms Br) תמצית. כפקד, ביטוי של סמנים אנדותל הסגר CD31, האסטרוציטים לסמן glial fibrillary חלבון חומצי (gfap) ו מיקרוגלייה סמן CD11b נצפו גם נעדרים ב P2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig01.jpg"> איור 1: סיכום הפרוטוקול. חלוקה לרמות זו מייצגת צעדים קריטיים להפקת כלציט, המתחיל בהתפוררות רקמות עם מטחנת זכוכית ולאחריה הפרדה של 3 צעדים ב דקטרן וסינון. פרוטוקול זה מעסיק את שלב העיכול של 33 דקות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig1alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig2a.jpg"> איור 2: מורפולוגיה תאים וביטוי סמנים. (א) הניגודיות הפאזה תמונות של קרום הלב ב P0, P1 ו P2 בשלבים של התפשטות. תאים שופע אנדותל ב P0 מצוינים על ידי חיצים לבנים. המספר שלהם ירד ב P1 והם נעלמו ב P2. החיצים השחורים מציינים את קרום הלב. (ב) אנליזה של CD146, NG2 ו-PDGFR-β ביטוי על ידי PCR בקרום המוח ב P2 עם קרום הלב בתוך P1 ומוח העכבר (Ms Br) דגימות. (ג) דמויות מייצגות של קרום הלב ב P2 מציג חיסוני חיובי של CD146, PDGFR-β ו, NG2. סרגל קנה מידה: 50 יקרומטר (הגדלה 20x) ו-20 יקרומטר (הגדלה 40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig2alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig03.jpg"> איור 3: טוהר הנציגים של תרביות התא. ניתוח של CD146, PDGFR-β, NG2, סגר, GFAP, CD31, CD11b וביטוי טובולין על ידי בלוק המערבי בקרום הלב P2 והמוח העכבר (Ms Br) דגימות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig3alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig4a.jpg"> איור 4: השוואה מייצגת של שיטות שונות של התפוררות רקמות, טיהור, העשרה ועיכול אנזימטי. כל פרוטוקול שפורסם מסוכם באמצעות אינדיקציות על מספר בעלי החיים המשמשים עבור כל פרוטוקול. התפוקות מצוינות גם ביחס למספר הבארות שהתקבלו בעת זריעה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig4alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

אנחנו מציגים פרוטוקול להפקת. קרום המוח של מורציטים פרוטוקול זה הינו כלי רב ערך עבור מחקרים בלתי מתורבת המספקים טוהר גבוה ותשואה גבוהה, ובכך מקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות.

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

לאחרונה, התפקיד של pericytes מוחית הפך ניכר הפרעות נוירולוגיות ותפקוד המוח. לכן, הפיתוח של שיטת תרבות אמינה עבור תאים אלה הוא הכרחי. הפרוטוקול שלנו להפקת pericytes מוחי מורין מייצג כלי אמין עבור מחקרים במבחנה ולספק pericytes עם טוהר גבוה ותפוקת תאים.הדגימה של ההליך עם אנופרייה מהרה תהיה לוסי דהוק, טכנאית מהמעבדה שלי. התחל על ידי הצבת המוח מעכבר C57BL/6 זכר מסוים ללא פתוגן על גבי מגבון סטרילי יבש ללא מוך ושימוש במטלות קצה מעוגלים להסרת העצבים המוח הקטן, הסטריאטום והעורפי. השתמש ספוגית כותנה כדי להסיר את כל קרום המוח גלוי ולהפוך את רקמת המוח במהופך.פתח את האונות עם משיכות אור כלפי חוץ ולהסיר את כל כלי הדם הנראים לעין. לאחר מכן מניחים את רקמת המוח ללא קרום המוח בצלחת פטרי 100 מילימטר המכיל 15 מיליליטר של חיץ כביסה קר B.To הומוגניזציה של הרקמה, להעביר את דגימת המוח לתוך צינור מרגמה מטחנת רקמות Dounce ולהוסיף שלושה עד ארבעה מיליליטר של חיץ כביסה B לצינור. השתמש עלה רופף כדי לטחון את הרקמה 55 פעמים, ולאחר מכן לשטוף את העלי עם חיץ כביסה B טחון תרחיף הרקמה עם עלה הדוק 25 פעמים.בסוף ההומוגניזציה, באותה מידה aliquot תרחיף בין שני צינורות 50 מיליליטר ולהוסיף 1.5 פעמים את הנפח של קר 30% בסרום בסרום dextran. ואז במרץ לנער את הצינורות כדי לערבב את תרחיף. כדי לבודד את שבר כלי הדם, מסיסים את התאים על ידי צנטריפוגה ומעבירים את העל-טבעיים לשני צינורות חדשים.אחסן את גלולה במאגר כביסה B על קרח. תן את הכדורים בשלושה מיליליטר של חיץ כביסה קר B על קרח. צנטריפוגה supernatants שנקטפו ולחזור על צעד זה עוד פעם אחת.להשליך את supernatants ו resuspend את כדורי בשלושה מיליליטר של חיץ כביסה B.Then בריכה כדורי resuspended ולהביא את הנפח הסופי של ההשעיה תא במאגר ל 10 מיליליטר עם מאגר כביסה קרה טרי B.עוד לנטרל את התאים עם פיפט 10 מילימטר שש פעמים עד גושים שנותרו של כדורי גלויים ולהשתמש הרכבה מסנן ואקום ו זן רשת ניילון כדי לסנן את התא מניחים את מסננת בצלחת פטרי ולנקה את רשת עם חיץ כביסה טרי B וגירוד כדי לשחזר את כל נימים. לאחר מכן בצע סינון שני עם מסנן טרי.מחלקים את הסינון באופן שווה בין שני צינורות ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר השלכת supernatants, בריכת כדורי לתוך צינור יחיד המכיל מאגר כביסה מראש המלחמה B עם אנזימים ולהוסיף קולגנס / Dispase מראש לצינור. מניחים את הצינור באמבט מים שולחן רועד בדיוק 33 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני עצירת התגובה עם 30 מיליליטר של חיץ כביסה קר B.Collect התאים על ידי צנטריפוגה בזהירות להשליך את supernatant.במהירות אך בזהירות resuspend את גלולה במאגר כביסה B שש פעמים צנטריפוגה ההשעיה שוב. לאחר השלכת supernatant, resuspend את גלולה ב 18 מיליליטר של מדיום DMEM מלא וזרע שני מיליליטר של השעיה התא ב DMEM מלא בתשע בארות של שלוש צלחות מטריגל מצופה שש בארות. מניחים את תרבות התאים באינקובטור סטרילי של 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות לפני הסרת הפסולת בזהירות מכל באר ומוסיפים מדיית DMEM טרייה.לאחר 48 שעות, לשנות את המדיום בכל באר כל 48 שעות. ביום שמונים עד עשר, כשהתאים מגיעים ל-100%, מעבר התאים במדיום תרבות פריסייט אל ג'לטין חדש מצופה שש בארות ולהחזיר את התאים לאממה לתרבות התאים למשך שישה עד שבעה ימים נוספים עם ניטור. ואז לפצל את התאים שוב ביום 17 במדיום pericyte לתוך צלחות מצופות ג'לטין חדש.ממעבר אפס למעבר 2, ישנם מאפיינים מורפולוגיים ספציפיים שבהם ניתן לזהות את תאי ה אנדותל ואת העלייה ההדרגתית הבאה של pericytes. בתרבות אפס קטע, תאים אנדותל מוארכים המתפתחים ממיקרו-אווסל נמצאים בשפע. שפע זה מצטמצם לאחר מעבר אחד ונעדר לאחר מעבר 2.להיפך, pericytes מופיעים כתאים מרובעים נדירים בתרבויות מוקדמות ולהיות בשפע על ידי מעבר שני. הערכה של הביטוי של NG2, CD146, ו PDGFR בטא ניתן להשתמש כדי להעריך את הטוהר של תרבות pericyte על ידי PCR כמותי, אימונוציטוכימיה, כתם מערבי. עיכול האנזים הוא צעד קריטי להצלחת הפרוטוקול.הקפד לעקוב בקפדנות אחר ריכוזי האנזימים ותזמן הדגירה.

a-high-output-method-to-isolate-cerebral-pericytes-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מתארים את השיטה להשגת הכנה טהורה של אסטרוציטים מעכברים שזה עתה נולדו.

בידוד אסטרוציטים: שיטה להשגת הכנה טהורה של אסטרוציטים קורטיקליים של עכבר

בסרטון זה אנו מדגימים את ההליך לבידוד ותרבית פריציטים מנימי מוח בקר ללא זיהום תאי אנדותל.

בידוד ותרבית של פריציטים ראשוניים במוח: הליך לבידוד ותרבית פריציטים מנימי מוח בקר ללא זיהום בתאי אנדותל

הסרטון מדגים שיטה פשוטה לתרבית אסטרוציטים מורינים בבידוד מתאי מוח אחרים. במהלך התרבית, על ידי שימוש במדיה ספציפית לאסטרוציטים ועיכוב היצמדות של תאים שאינם אסטרוציטים, השיטה תרבית אסטרוציטים באופן סלקטיבי. אסטרוציטים מתורבתים אלה מציגים מורפולוגיה מהממת עם תהליכים עדינים.

טכניקה פשוטה לבידוד ותרבית אסטרוציטים מורינים

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד פריציטים מוחיים ממוח עכבר. התאים המבודדים מתורבתים במדיה ספציפית לפריציטים כדי לקדם את התפשטות הפריציטים.

בידוד וטיפוח פריציטים מוחיים של עכברים

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC) מחוברים זה לזה על ידי חלבוני צומת ספציפיים היוצרים מחסום מווסת מאוד המפריד בין הדם למערכת העצבים המרכזית (CNS), מה שנקרא מחסום דם-מוח (BBB). הבידוד של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח העכברים, כפי שנדון בפרוטוקול זה, מאפשר מחקרי מבחנה מפורטים של BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

אנו מתארים פרוטוקול המאפשר טיהור של תא כלי הדם של מוח העכבר. כלי מוח מבודדים כוללים תאי אנדותל המקושרים בצמתים הדוקים ומוקפים בלמינה בסיסית רציפה, פריציטים, תאי שריר חלק בכלי הדם, כמו גם ממברנות אסטרוגליאליות סביב כלי הדם.

טיהור של כלי מוח עכבר

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול מבוסס FACS המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד.

בידוד של סוג אני ו II סוג pericytes של עכבר שרירי השלד

על מנת לבודד ולטהר את קרום הלב למחקרים בסיסיים ולחקור את הפוטנציאל הטיפולי של הביולוגיה שלהם.

בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין

pericytes נימי המוח הם שחקנים חיוניים ברגולציה של תכונות מחסום דם - מוח וזרימת דם. פרוטוקול זה מתאר כיצד pericytes נימות המוח יכול להיות מבודד, תרבותי, מאופיין ביחס לסוג התא והגיש בקשה לחקירות של סידן תאי איתות עם בדיקות פלורסנט.

תרבות של פריציטים נומי מוח למדידות סידן ציטוסולית מחקרי הדמיית סידן

כדי להשיג פריציטים קורטיקליים במוח העכבר העומדים בדרישות scRNA-seq, אנו מציגים פרוטוקול FACS מותאם באופן קריטי המבוסס על בחירת CD13⁺/CD31⁻. השיפורים המרכזיים שלנו משפרים משמעותית את חיוניות התא ואת שלמות ה-RNA, ומאפשרים פרופיל טרנסקריפטומי אמין.

בידוד פריציטים מרקמת קורטיקת העכבר באמצעות FACS לצורך ריצוף תא יחיד

למדו פרוטוקול אמין לבידוד פריציטים מוחיים מעכברים C57BL/6 ללא אנטיביוטיקה. השיטה מספקת טוהר גבוה ותפוקת תאים מיטבית למחקר מחלות נוירולוגיות ותפקוד מוחי.

שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר

גלה סרטונים נוספים