שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר

לאחרונה, התפקיד של pericytes מוחית הפך ניכר הפרעות נוירולוגיות ותפקוד המוח. לכן, הפיתוח של שיטת תרבות אמינה עבור תאים אלה הוא הכרחי. הפרוטוקול שלנו להפקת pericytes מוחי מורין מייצג כלי אמין עבור מחקרים במבחנה ולספק pericytes עם טוהר גבוה ותפוקת תאים.

הדגימה של ההליך עם אנופרייה מהרה תהיה לוסי דהוק, טכנאית מהמעבדה שלי. התחל על ידי הצבת המוח מעכבר C57BL/6 זכר מסוים ללא פתוגן על גבי מגבון סטרילי יבש ללא מוך ושימוש במטלות קצה מעוגלים להסרת העצבים המוח הקטן, הסטריאטום והעורפי. השתמש ספוגית כותנה כדי להסיר את כל קרום המוח גלוי ולהפוך את רקמת המוח במהופך.

פתח את האונות עם משיכות אור כלפי חוץ ולהסיר את כל כלי הדם הנראים לעין. לאחר מכן מניחים את רקמת המוח ללא קרום המוח בצלחת פטרי 100 מילימטר המכיל 15 מיליליטר של חיץ כביסה קר B.To הומוגניזציה של הרקמה, להעביר את דגימת המוח לתוך צינור מרגמה מטחנת רקמות Dounce ולהוסיף שלושה עד ארבעה מיליליטר של חיץ כביסה B לצינור. השתמש עלה רופף כדי לטחון את הרקמה 55 פעמים, ולאחר מכן לשטוף את העלי עם חיץ כביסה B טחון תרחיף הרקמה עם עלה הדוק 25 פעמים.

בסוף ההומוגניזציה, באותה מידה aliquot תרחיף בין שני צינורות 50 מיליליטר ולהוסיף 1.5 פעמים את הנפח של קר 30% בסרום בסרום dextran. ואז במרץ לנער את הצינורות כדי לערבב את תרחיף. כדי לבודד את שבר כלי הדם, מסיסים את התאים על ידי צנטריפוגה ומעבירים את העל-טבעיים לשני צינורות חדשים.

אחסן את גלולה במאגר כביסה B על קרח. תן את הכדורים בשלושה מיליליטר של חיץ כביסה קר B על קרח. צנטריפוגה supernatants שנקטפו ולחזור על צעד זה עוד פעם אחת.

להשליך את supernatants ו resuspend את כדורי בשלושה מיליליטר של חיץ כביסה B.Then בריכה כדורי resuspended ולהביא את הנפח הסופי של ההשעיה תא במאגר ל 10 מיליליטר עם מאגר כביסה קרה טרי B.עוד לנטרל את התאים עם פיפט 10 מילימטר שש פעמים עד גושים שנותרו של כדורי גלויים ולהשתמש הרכבה מסנן ואקום ו זן רשת ניילון כדי לסנן את התא מניחים את מסננת בצלחת פטרי ולנקה את רשת עם חיץ כביסה טרי B וגירוד כדי לשחזר את כל נימים. לאחר מכן בצע סינון שני עם מסנן טרי.

מחלקים את הסינון באופן שווה בין שני צינורות ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר השלכת supernatants, בריכת כדורי לתוך צינור יחיד המכיל מאגר כביסה מראש המלחמה B עם אנזימים ולהוסיף קולגנס / Dispase מראש לצינור. מניחים את הצינור באמבט מים שולחן רועד בדיוק 33 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני עצירת התגובה עם 30 מיליליטר של חיץ כביסה קר B.Collect התאים על ידי צנטריפוגה בזהירות להשליך את supernatant.

במהירות אך בזהירות resuspend את גלולה במאגר כביסה B שש פעמים צנטריפוגה ההשעיה שוב. לאחר השלכת supernatant, resuspend את גלולה ב 18 מיליליטר של מדיום DMEM מלא וזרע שני מיליליטר של השעיה התא ב DMEM מלא בתשע בארות של שלוש צלחות מטריגל מצופה שש בארות. מניחים את תרבות התאים באינקובטור סטרילי של 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות לפני הסרת הפסולת בזהירות מכל באר ומוסיפים מדיית DMEM טרייה.

לאחר 48 שעות, לשנות את המדיום בכל באר כל 48 שעות. ביום שמונים עד עשר, כשהתאים מגיעים ל-100%, מעבר התאים במדיום תרבות פריסייט אל ג'לטין חדש מצופה שש בארות ולהחזיר את התאים לאממה לתרבות התאים למשך שישה עד שבעה ימים נוספים עם ניטור. ואז לפצל את התאים שוב ביום 17 במדיום pericyte לתוך צלחות מצופות ג'לטין חדש.

ממעבר אפס למעבר 2, ישנם מאפיינים מורפולוגיים ספציפיים שבהם ניתן לזהות את תאי ה אנדותל ואת העלייה ההדרגתית הבאה של pericytes. בתרבות אפס קטע, תאים אנדותל מוארכים המתפתחים ממיקרו-אווסל נמצאים בשפע. שפע זה מצטמצם לאחר מעבר אחד ונעדר לאחר מעבר 2.

להיפך, pericytes מופיעים כתאים מרובעים נדירים בתרבויות מוקדמות ולהיות בשפע על ידי מעבר שני. הערכה של הביטוי של NG2, CD146, ו PDGFR בטא ניתן להשתמש כדי להעריך את הטוהר של תרבות pericyte על ידי PCR כמותי, אימונוציטוכימיה, כתם מערבי. עיכול האנזים הוא צעד קריטי להצלחת הפרוטוקול.

הקפד לעקוב בקפדנות אחר ריכוזי האנזימים ותזמן הדגירה.