זיהוי החלבונים המחייבים של ליגנדים קטנים עם הפעולה הרדיאלית הרדיאלית הדיפרנציאלית של ליגנד אסאי (DRaCALA)

מולקולות איתות קטנות מכוונות לחלבונים משפיעים שונים כדי לשלוט בנדיפות החיידקים ובביולוגיה האנושית. עם זאת, חלבונים משפיעים אלה מאתגרים לזיהוי. ככלי ביולוגי של מערכות, DRaCALA מאפשר זיהוי ריאלי, מהיר ורגיש מאוד של חלבונים משפיעים לא ידועים באמצעות ספריית OVium.

DRaCALA יכול לשמש כדי ללמוד כל מולקולת איתות קטנה כל עוד זה יכול להיות מתויג עם איזוטופ רדיואקטיבי או צבעים פלואורסצנטיים. התחל על ידי חנק E.coli לתוך 1.5 מיליליטר של LB בתוספת עם 25 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול בכל באר של 96 היטב צלחות באר עמוקה עבור דגירה לילה ב 30 מעלות צלזיוס ו 160 סיבובים לדקה. למחרת בבוקר, לטפל בתרביות הלילה עם 500 IPTG מיקרומולרי במשך שש שעות ב 30 מעלות צלזיוס כדי לגרום ביטוי חלבון.

בסוף הדגירה, גלולה את התאים על ידי centrifugation, להסיר את supernatant, ולהקפיא את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי ליזום תמוגה, resuspend הכדורים ב 150 microliters של חוצץ תמוגה אחד לכל באר עבור דגירה של 30 דקות במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני הפשרת התאים במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן יש לאחסן את ה- lysate במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

כדי להשלים את התמוגה של תאים עם חלבונים בלחץ יתר, resuspened הדגימות ב 40 מיליליטר של חיץ תמוגה קר קרח שני sonicate הדגימות ב 60% משרעת בשתי שניות על ארבע שניות את במשך שמונה דקות, ולאחר מכן לנקות את lysates על ידי צנטריפוגה. בזמן שהדגימות נמצאות בצנטריפוגה, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של שרף ניקל-NTA הומוגני לעמודה עומדת של כרומטוגרפיה פוליפרופילן. לאחר 15 דקות, לשטוף את השרף מיושב פעמיים עם 15 מיליליטר של מים אולטרה-תותים ופעם אחת עם 15 מיליליטר של חיץ תמיס שני.

בסוף המאה, טען את הסופר-נט המנוקה על העמוד. כאשר כל lysate זרם דרך העמודה, לשטוף את העמודה עם 30 מיליליטר של חוצץ כביסה. כדי לחמוק מהחלבונים, הוסיפו לטור נפח של 400 מיקרוליטר של חיץ אלוטיון וחזרו על ההבחנה שלוש פעמים.

עוד 300 נפח מיקרוליטר של מאגר האלוטיון כדי לחזור על ההעפרה שלוש פעמים ולשלב את החלבונים הנבהרים בנפח סופי של 700 מיקרוליטרים. לסינון ג'ל של הדגימה הנבהרת, לאחר שטיפת עמודת אי-הכללה בגודל עם 25 מיליליטר של מאגר סינון ג'ל שהוכן זה עתה, העמיסו את כל הנפח של חלבון מלוטש על העמוד באמצעות לולאת מיקרוליטר של 500. הפעל ב 500 microliters לדקה ולאסוף שניים עד שלושה שברי נפח microliter 500 של החלבונים המתאימים.

לאחר מכן השתמש בעמודי ספין בודדים כדי לרכז כל חלבון ולהשתמש בערכת ההסתה של ברדפורד כדי למדוד את ריכוזי החלבון על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. כדי לסנתז את הזרחן 32 שכותרתו גואנוסין פנטפוספט, להרכיב תגובת Relseq בקנה מידה קטן בצינור כתר בורג כפי שמתואר בטבלה ודגרה התגובה ThermoMixer במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס וחמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ואחריו חמש דקות על קרח. בסוף הדגירה, לסובב את החלבון זירוז על ידי צנטריפוגה ולהעביר את זרחן מסונתז 32 שכותרתו גואנוסין פנטפוספט המכיל supernatant לצינור בורג חדש capped.

עבור זרחן 32 גואנוסין טטרפוספט סינתזה, להוסיף GppA מיקרומולר אחד למחצית של זרחן 32 מסומן גואנוסין פנטפוספט המוצר בצינור בורג חדש כתרים לדגור את התגובה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס, וחמש דקות על קרח. בסוף הדגירה, לסובב את המשקעים על ידי צנטריפוגה ולהעביר את הזרחן 32 שכותרתו גואנוסין טטרפוספט המכיל supernatant לצינור חדש. כדי לנתח את חלבוני היעד המבודדים, הפעל מיקרוליטר אחד של כל דגימה על צלחת כרומטוגרפיה שכבה דקה באמצעות 1.5 מונפוטסיום פוספט טוחנת כשלב הנייד.

לאחר הניתוח, מניחים את הצלחת היבשה בתיקיית פלסטיק שקופה וחושפים את הצלחת למסך זרחן אחסון למשך חמש דקות לפני שהם מדמים ומכומתים את הנתונים על צלם זרחן. להקרנת DRaCALA של חלבוני היעד, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של ליסאטים סיטונאיים מופשרים לבארות בודדות של צלחת מיקרוטיטר V-תחתון 95 טובה והוסיפו 2.5 יחידות של Serratia marcescens אנדונוצ'לאז לכל באר. לאחר 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, מניחים את lysates על קרח במשך 20 דקות.

לאחר מכן, מערבבים כמויות שוות של זרחן 32 שכותרתו גואנוסין פנטפוספט וגואנוסין טטרפוספט ולהוסיף 1X תמוגה חוצץ אחד לתערובת כדי לקבל פתרון פנטפוספט גואנוסין ארבעה ננומולר. בעזרת פיפטה רב-ערוצית וטיפים מסוננים של פיפטה, מערבבים 10 מיקרוליטרים של תערובת הגואנוסין פנטפוספט עם התא ליסייט לדגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף כלי פין 96X שלוש פעמים בתמיסה 0.01%של חומר ניקוי לא יוני במשך 30 שניות, ואחריו 30 שניות של ייבוש על מגבת נייר לכל לשטוף לפני הצבת כלי הסיכה בצלחת מדגם 96 היטב.

לאחר 30 שניות, הרם את כלי הסיכה ישר למעלה והנח אותו ישר למטה על קרום ניטרוצלולוז במשך 30 שניות. לאחר חמש דקות של ייבוש, מניחים את קרום הניטרוצלולוז בתיקיית פלסטיק שקופה לחשיפה למסך זרחן לאחסון והדמיה על ידי הדמיית זרחן כפי שהודגם. כדי לכמת ולזהות חלבוני יעד פוטנציאליים, בתוכנת הניתוח המשויכת לדימוי הזרחן, פתח את קובץ הג'ל של הלוחות החזותיים.

כדי להגדיר את הכתמים שיש לנתח, השתמש בפונקציית ניתוח המערך כדי להגדיר רשת שורות של 12 עמודות בשמונה. כדי להגביל את הקצה החיצוני של נקודות החור, הגדר עיגולים גדולים, יצא את עוצמת הקול ואת האזור של העיגולים הגדולים המוגדרים לגיליון אלקטרוני. כדי להגביל את הנקודות הפנימיות הקטנות, הגדל את העיגולים המוגדרים, יצא את אמצעי האחסון ואת האזור של העיגולים הקטנים המוגדרים ושמור את כל הנתונים בגיליון האלקטרוני.

מקם עיגולים לחפיפה עם כתמים לפי הצורך, שינוי גודל של כתמים מעט גדולים יותר מאשר כתמים בפועל. השתמש במשוואה כדי לחשב את שברי האיגוד בגיליון האלקטרוני ולתוות את הנתונים. לאחר מכן לזהות את החלבונים הכרוכים הפוטנציאליים בבארות המציגים שברים מחייבים גבוהים בהשוואה לרוב בארות אחרות.

בניתוח מייצג זה, צלחת עם אותות כריכה רקע נמוך יחסית ברוב בארות ניתן לראות. אות הכריכה החיובי ב- H3 הציג שבר מחייב שהיה גבוה בהרבה מזה שנצפה עבור בארות אחרות עקב ביטוי יתר של חלבון מחייב גואנוסין פנטפוספט Hpt. בלוחות הייצוגיים, מספר בארות הראו אותות כריכה גבוהים יחסית ברקע כפי שצוין על ידי הנקודות הפנימיות החזקות יחסית שנצפו בבארות רבות, כמו גם את שברי הכריכה הגבוהים בעקביות שנצפו לאחר הכימות.

ראוי לציין כי חלק מהיעדים גם נתנו שברי איגוד משתנים, כגון תוצאות חיוביות שגויות. כדי להבהיר עוד יותר, החוקרים השתמשו חלבונים מטוהרים כדי לבדוק את הכריכה שוב. ברגע שחלבוני היעד מזוהים, אפשר לטהר אותם להומוגניות ולאשר כוח וספציפיות אינטראקציה באמצעות DRaCALA, קלורימטריה איזותרמית או שיטות אחרות.

זיהוי חלבוני היעד של מולקולות איתות קטנות סולל את הדרך להבנה מעמיקה של התפקידים העולים מארס חיידקים לביולוגיה אנושית.