Name: זיהוי הגנים המעורבים בהתפתחות סטומאטלית באמצעות ניקוד פנוטיפ אפידרמלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:05:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: למדו שיטות חדשניות לניתוח פנוטיפי של התפתחות סטומטות בצמחים באמצעות צביעת toluidine blue O בזרעי Arabidopsis. השיטות מאפשרות הערכה מדויקת של תכונות אפידרמליות ללא חומרים רעילים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן באמצעות תוכנית גילוי משאבי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) ואוניברסיטת קונקורדיה. K.B. נתמך על ידי המלגה הלאומית בחו"ל מהודו.

1. צביעת ארבידופסיס קוטילדונים עם TBO
<ol><li>עיקור זרעים ותנאי גידול<ol><li>יש לעקר ~30 זרעי Arabidopsis לכל גנוטיפ בצינור מיקרוצנטריפוגה על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת עיקור זרעים (33% אקונומיקה מסחרית, 0.1% Triton X-100), ולנענע בעדינות במשך 10-12 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הערה: יש לעקר ~30 זרעים של ה-Arabidopsis Columbia (Col-0) ו/או ~60 זרעים של צמחים טרנסגניים הנושאים גן כימי (לדוגמה, Est::EPF27) כדי להשתמש בשתילים טרנסגניים שגדלו על 1/2 לוחות Murashige ו-Skoog (MS) (2.16 גרם/ליטר המכילים 0.8% אגר [w/v]) ללא השראה (למשל, β-אסטרדיול) כביקורת (איור 1 ואיור 2).</li>
		<li>הסר את תמיסת העיקור, שטוף את הזרעים ארבע פעמים עם 1 מ"ל של מים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרית, והשהה אותם מחדש ב~ 200 מיקרוליטר של אגר סטרילי 0.1%.</li>
		<li>זרעו ~ 30 זרעים לכל גנוטיפ על 1/2 לוחות אגר MS או 1/2 לוחות אגר MS המכילים משרה (למשל, 10 מיקרומטר β-אסטרדיול) להשראות כימית של הטרנסגן (למשל, Est::EPF27) באמצעות פיפטה, ואטמו עם סרט מיקרו-נקבוביות. הערה: הזרעים צריכים להיות מפוזרים באופן שווה על הצלחת כדי למנוע הצבתם בקרבה, שכן זה ימנע מהשתילים לגדול באופן אחיד.</li>
		<li>לרבד את הזרעים על ידי הצבת הצלחות ב 4 ° C ללא אור במשך 3-5 ימים כדי לסנכרן את הנביטה.</li>
		<li>לאחר הריבוד, יש לדגור על הלוחות בתא גידול בטמפרטורה של 22°C מתחת ל-120 μmol·m−2·s−1 אור עם פוטו-תקופה של 16 שעות אור ו-8 שעות חושך למשך 10 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>דגימה וצביעת TBO של Arabidopsis cotyledons<ol><li>ב 10 ימים לאחר הנביטה, בזהירות לבחור ולחתוך אחד cotyledons מן שתילים בודדים כי הם גדלים באופן אחיד עם שתילים אחרים על הצלחת כדי להגביל את השונות. הערה: Cotyledons נדגמים שתילים בני 10 ימים כי אין להם טריכומות ותאי אפידרמיס לא בוגרים, אשר מפשט את הפרשנות של פנוטיפים האפידרמיס.</li>
		<li>הכניסו כל קוטילדון לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 1 מ"ל של תמיסת קיבוע (אתנול 9:1 לחומצה אצטית) באמצעות מלקחיים, והשאירו את הדגימה בתמיסת הקיבוע למשך הלילה, לכל הפחות ובטמפרטורת החדר. הערה: לאחר מכן ניתן לאחסן את הדגימות עד כמה שנים במצב זה. התמונה איור 2E נלקחה מדגימת קוטילדון שאוחסנה בתמיסת קיבוע במשך יותר מ-3 שנים. חשוב לשמור את הקוטילדון בתמיסת קיבוע מיד לאחר החיתוך ולהניח לא יותר מחמישה קוטילדונים בכל צינור מיקרוצנטריפוגה להכנת דגימה הומוגנית מאוחר יותר.</li>
		<li>הסר את פתרון הקיבוע, ולהוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול. לאחר היפוך הצינור כמה פעמים, השאר את הצינור המכיל את הדגימות ב- RT למשך ~ 30 דקות.</li>
		<li>חזור על שלב 1.2.3 באמצעות 1 מ"ל של 50% אתנול ולאחר מכן 20% אתנול.</li>
		<li>החלף את 1 מ"ל של אתנול 20% עם 1 מ"ל של מים מזוקקים, ולאחר מכן להשאיר את הצינור המכיל את דגימות cotyledon במשך ~ 30 דקות לאחר היפוך הצינור כמה פעמים. הערה: הדגימות עשויות להישאר במים מזוקקים במשך יותר מ -24 שעות, אך זה לא מומלץ לקבלת תמונות באיכות טובה (תמונות מוכתמות היטב עבור סוגים שונים של תאי אפידרמיס) לניתוח כמותי.</li>
		<li>מוציאים את כל המים המזוקקים מהצינור. לאחר מכן, הוסף מיד ~ 200 μL של תמיסת צביעת TBO (0.5% TBO ב- H2O, מסונן) למשך ~2 דקות. הערה: ודא שכל דגימת קוטילדון נחשפת באופן שווה לתמיסת TBO על ידי תנועה עדינה של הצינורות במהלך הדגירה. כדי למנוע הכתמת יתר עם TBO (תזמון הצביעה חיוני ויכול להיות משתנה עבור כל גנוטיפ), אין לעבד יותר משש מבחנות המכילות דגימות בכל פעם.</li>
		<li>הסר את תמיסת צביעת TBO ביסודיות ככל האפשר, ולאחר מכן מיד לשטוף את הדגימות כמה פעמים על ידי הוספת 1 מ"ל של מים מזוקקים טריים.</li>
	</ol></li>
	<li>הדמיה וניתוח נתונים<ol><li>קח שקופית מיקרוסקופ, והוסף טיפה של 15% גליצרול (~ 50 μL). מניחים את הקוטילדון עם הצד האבקסיאלי כלפי מעלה ל-15% גליצרול על המגלשה בעזרת מלקחיים עדינים. לאחר מכן, כסו אותו בעדינות עם כיסוי כך שניתן יהיה להסיר את כל בועות האוויר שנוצרו מהדגימה.</li>
		<li>דמיינו את הצד האבקסיאלי של אפידרמיס הקוטילדון באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 1 ואיור 2), ולאחר מכן בחנו את הפנוטיפ של האפידרמיס על-ידי ספירת מספר הפיוניות וסוגי תאי אפידרמיס אחרים.</li>
		<li>עבור כל גנוטיפ, חשב את הפנוטיפ האפידרמלי באמצעות הנוסחאות הבאות המתוארות על ידי Jangra et al.17: אינדקס סטומטלי (%) = (מספר הפיוניות/המספר הכולל של תאי האפידרמיס) × 100 צפיפות סטומטית (mm−2) = מספר הפיוניות/שטח (מ"מ2) הערה: צלם לפחות שמונה קוטילדונים (N = 8) עבור כל גנוטיפ, ותעד את הפנוטיפ האפידרמלי של כל גנוטיפ על ידי השוואתו לפנוטיפ של צמח מסוג בר ו / או צמחים טרנסגניים המבטאים טרנסגן המושרה כימית שגדל ללא השראה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. בדיקות ביולוגיות לפפטידים סטומאטליים
הערה: הליך הבדיקות הביולוגיות מוצג באיור 3.
<ol><li>עיקור זרעים ותנאי גידול<ol><li>יש לעקר ~25 זרעים לכל טיפול כנ"ל, ולזרוע כמחצית מהזרעים על כל אחת משתי צלחות אגר 1/2 MS במכסה מנוע זרימה למינרית. הערה: השתמשו בגנוטיפ עם תאי אפידרמיס גבוהים ו/או נמוכים (למשל, epf22) במקום להשתמש ברקע פראי (למשל, Col-0) כדי לזהות בקלות את הפעילות הביולוגית של הפפטידים על התבנית וההתמיינות של תאי האפידרמיס (איור 4).</li>
		<li>לרבד את הזרעים במשך 3 ימים ב 4 °C (75 °F) בחושך.</li>
		<li>הוציאו כל אחת משתי הצלחות במרווחים של ~10 שעות, ודגרו על הזרעים על צלחות בטמפרטורה של 22°C מתחת ל-120 μmol·m−2·s−1 אור עם תקופת צילום של 16 שעות אור ו-8 שעות חושך למשך יום אחד.</li>
	</ol></li>
	<li>טיפול והדמיית פפטיד<ol><li>במכסה מנוע זרימה למינרית, השתילו בזהירות 10-12 שתילי ארבידופסיס בני יום אחד מכל אחת משתי הצלחות המוכנות לצלחת בת 24 בארות המכילה 1.5 מ"ל של 1/2 מדיום נוזלי MS בכל באר (~ 20 שתילים לבאר). הערה: עיתוי הטיפול בפפטיד עבור השתילים הוא קריטי לתוצאות הפנוטיפיות של הטיפול בפפטידים, לכן הכינו את הזרעים בשתי צלחות נפרדות כדי לקבל שני שלבי התפתחות שתילים שונים לטיפול.</li>
		<li>הוסף חיץ בלבד (50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) או שני ריכוזים שונים של הפפטיד (בדרך כלל, 1 μM ו- 2.5 μM פפטיד ב- 50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) לכל באר המכילה ~ 20 שתילי Arabidopsis בני יום אחד שנבטו על 1/2 צלחות אגר MS. הערה: הוציאו את תמיסת הפפטיד מהמקפיא, ושמרו אותם ב-RT למשך מספר דקות לפני הטיפול. פפטידים המאוחסנים במקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס יציבים למשך מספר שנים, אך יש להימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה על ידי אחסון תמיסת הפפטיד באליציטוטים קטנים.</li>
		<li>לאחר ערבוב עדין של השתילים עם חיץ בלבד או תמיסת פפטיד באמצעות פיפטה, אטמו את הצלחת בסרט מיקרו-נקבוביות. לדגור על צלחת הבדיקה בתנאים של יום ארוך (16 שעות פוטופריוד, 120 μmol·m−2·s−1 אור) במשך 5-7 ימים ב 22 ° C. הערה: מנעו מהשתילים לגדול קרוב מדי זה לזה כדי לאפשר לכל שתיל חשיפה אחידה לתמיסת הפפטידים. סובבו בעדינות את הצלחת במשך 2-3 שעות לפני הדגירה על הצלחת בתא גדילה כדי להגביר את האוורור.</li>
		<li>מעבירים כל שתיל מהבאר המכילה חיץ בלבד או פפטיד על שקופית כיסוי, ומנתחים את הקוטילדון של השתיל. מניחים את הצד האבקסיאלי של הקוטילדון בעזרת מלקחיים, וחותכים אותו לחתיכות קטנות.</li>
		<li>קחו עוד שקופית מיקרוסקופ נקייה, והניחו עליה טיפה של תמיסת יודיד פרופידיום (~25 μL, 2 מ"ג/מ"ל ב-H2O).</li>
		<li>מניחים את אחת החתיכות הקטנות של קוטילדון לתוך טיפה של תמיסת יודיד פרופידיום באמצעות מלקחיים, ומניחים בעדינות את הכיסוי. יש למרוח תמיסת פרופידיום יודיד נוספת על קצה הכיסוי כדי להסיר בועות אוויר שנוצרו.</li>
		<li>דמיינו את הצד האבקסיאלי של הקוטילדון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, והשוו את התמונות לתמונות משתילים שגדלו בתווך של 1/2 MS המכיל חיץ בלבד. הערה: התמונות שהוצגו באיור 4 נלקחו משתילי Col-0 או epf22,5 מסוג בר שטופלו בחיץ בלבד (איור 4A, B) או בשתי אצוות של תמיסת פפטיד EPF2 (איור 4C-F) ואוחסנו בטמפרטורה של -80°C במשך שנה אחת.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+peptide+gene+EPF1+enforces+the+stomatal+one-cell-spacing+rule%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule.</a> Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).</li>
<li>Hara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cell+density+is+autoregulated+via+a+secretory+peptide%2C+EPIDERMAL+PATTERNING+FACTOR+2+in+Arabidopsis+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves.</a> Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).</li>
<li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+density+is+controlled+by+a+mesophyll-derived+signaling+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule.</a> Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).</li>
<li>Sugano, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomagen+positively+regulates+stomatal+density+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis.</a> Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).</li>
<li>Hunt, L., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+peptide+EPF2+controls+asymmetric+cell+divisions+during+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development.</a> Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).</li>
<li>Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signalling+peptide+EPFL9+is+a+positive+regulator+of+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development.</a> New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).</li>
<li>Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+of+ligand-receptor+pairs+specifying+stomatal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning.</a> Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).</li>
<li>Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+patterning+and+differentiation+by+synergistic+interactions+of+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases.</a> Science. 309 (5732), 290-293 (2005).</li>
<li>Nadeau, J. A., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stomatal+distribution+on+the+Arabidopsis+leaf+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface.</a> Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+function+of+Arabidopsis+SERK+family+receptor-like+kinases+in+stomatal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning.</a> Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).</li>
<li>Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+stomatal+initiation+is+controlled+by+MAPK-mediated+regulation+of+the+bHLH+SPEECHLESS%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS.</a> Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).</li>
<li>Yang, M., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+too+many+mouths+and+four+lips+mutations+affect+stomatal+production+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).</li>
<li>Theunissen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+studying+grass+leaf+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An improved method for studying grass leaf epidermis.</a> Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).</li>
<li>Venkata, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((crw1--A+novel+maize+mutant+highly+susceptible+to+foliar+damage+by+the+western+corn+rootworm+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle.</a> PLoS One. 8 (8), 71296(2013).</li>
<li>Tucker, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+small+RNA+pathways+promote+the+mitotic+events+of+megagametogenesis+during+female+reproductive+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis.</a> Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).</li>
<li>Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NMR+structure+of+stomagen+reveals+the+basis+of+stomatal+density+regulation+by+plant+peptide+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones.</a> Nature Communications. 2, 512(2011).</li>
<li>Jangra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplicated+antagonistic+EPF+peptides+optimize+grass+stomatal+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation.</a> Development. 148 (16), (2021).</li>
<li>Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xylem+and+phloem+transcriptomes+from+secondary+tissues+of+the+Arabidopsis+root-hypocotyl%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl.</a> Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).</li>
<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+inflorescence+architecture+by+intertissue+layer+ligand-receptor+communication+between+endodermis+and+phloem%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).</li>
<li>Tameshige, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+peptide+and+its+receptors+shape+the+auxin+response+pattern+and+leaf+margin+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis.</a> Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).</li>
<li>Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+signaling+specificity+in+Arabidopsis+by+spatially+restricted+buffering+of+ligand-receptor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions.</a> The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).</li>
<li>Uchida, N., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plant+vascular+stem+cells+by+endodermis-derived+EPFL-family+peptide+hormones+and+phloem-expressed+ERECTA-family+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).</li>
<li>Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EPFL+Signals+in+the+boundary+region+of+the+SAM+restrict+its+size+and+promote+leaf+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation.</a> Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

שתי שיטות הניתוח הפנוטיפיות לזיהוי ואפיון הגנים השולטים בתבניות ובהתמיינות הסטומטית המוצגות כאן הן בדיקות נוחות ואמינות, שכן הפרוטוקולים אינם דורשים שימוש בקליפות אפידרמיס ובציוד ייעודי (הגוזלים זמן רב ודורשים הכשרה מיוחדת להכנת דגימות) אך כן מפיקים תמונות איכותיות לניתוח כמותי של פנוטיפים אפידרמליים.
מגבלה של טכניקה זו לאנליזה פנוטיפית באמצעות ארבידופסיס קוטילדונים מוכתמים ב-TBO היא שקבלת תמונות באיכות גבוהה עם ניגודיות חזותית עבור סוגי תאי אפידרמיס שונים תלויה בזמן הצביעה ובמאפיינים...

דפוסים והתמיינות נכונים של הפיוניות של הצמח הם קריטיים לתפקודם בשני תהליכים ביולוגיים בסיסיים, פוטוסינתזה וטרנספירציה, והם נאכפים על ידי מסלולי איתות פפטידים EPF. בארבידופסיס, שלושה פפטידים עשירים בציסטאין המופרשים, EPF1, EPF2 ו-STOMAGEN/EPFL9, שולטים בהיבטים שונים של התפתחות סטומטית ונתפסים על ידי רכיבי קולטן פני השטח של התא, כולל קינאזות קולטן ממשפחת ERECTA (ER, ERL1 ו-ERL2), SERK ו-TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . הכרה זו מובילה לאחר מכן להפחתת הרגולציה של גורמי השעתוק המקדמים התמיינות סטומטית בתהליך תלוי MAPK11. הגילוי של גנים סטומטיים מרכזיים אלה מושג בעיקר על ידי סינון פנוטיפי של מוטנטים המציגים פגמים אפידרמיסים. מאמר זה מציג שיטות פנוטיפ פשוטות ויעילות יחסית להדמיית הפיוניות ותאי אפידרמיס אחרים, הנדרשות כדי לזהות ולאפיין את הגנים הפוטנציאליים השולטים בתבניות ובהתמיינות הסטומטלית.
התצפית על פרטי האפידרמיס של הצמח הושגה בדרך כלל באמצעות קליפות אפידרמיס עם או בלי כתמים בצבע כגון toluidine blue O (TBO) או ספרנין12,13,14. עם זאת, האתגר העיקרי של שיטות אלה הוא שהן דורשות הכשרה מיוחדת כדי לקלף את אפידרמיס העלה מבלי לקרוע את הרקמות ולהתבונן ולנתח בקפידה את נתוני הדפוסים תוך הימנעות מתמונות שצולמו מחלקים שונים של העלה. טיפולים כימיים לניקוי דגימות הרקמה באמצעות ריאגנטים כגון תמיסות ניקוי מבוססות כלורל הידרט היו בשימוש נרחב גם עבור מגוון רחב של חומרים ביולוגיים 8,15; טיפולים אלה אכן מייצרים מידע פנוטיפי רב על ידי מתן תמונות באיכות גבוהה, אך גם דורשים שימוש בכימיקלים מסוכנים (למשל, פורמלדהיד, כלורל הידרט). מאמר זה מציג תחילה שיטת פנוטיפ קלה ונוחה יחסית, המפיקה תמונות המספיקות לניתוח כמותי, אך אינה דורשת שימוש בכימיקלים מסוכנים ובקליפות עלי אפידרמיס להכנת הדגימה. אפידרמיס cotyledon מוכתם TBO הוא גם אידיאלי לחקר התפתחות stomatal כי חוסר טריכומות ואת שיפוע התפתחותי קטן יותר cotyledons לאפשר פרשנות פשוטה ו tractable של פנוטיפים האפידרמיס.
פפטידים סטומאטליים EPF שייכים לקבוצה של פפטידים ספציפיים לצמחים, עשירים בציסטאין, בעלי גדלים בוגרים גדולים יחסית וקשרים דיסולפידים תוך-מולקולריים בין שאריות ציסטאין משומרות. קיפול קונפורמטיבי נכון הוא קריטי לתפקודם הביולוגי, אך פפטידים עשירים בציסטאין, המיוצרים על ידי סינתזה כימית או מערכת רקומבינציה הטרולוגית, יכולים להיות לא פעילים והם תערובת של פפטידים מקופלים כראוי ולא מקופלים 3,7,16. לפיכך, סינון של פפטידים ביו-אקטיביים שיש להם תפקיד בבקרת התפתחות סטומטית היה משימה מאתגרת מאוד. כתב יד זה מתאר בנוסף בדיקה ביולוגית לזיהוי ואפיון טוב יותר של פפטידים סטומאטליים ביו-אקטיביים. בשיטה זו, שתילי Arabidopsis גדלים בצלחת רב באר המכילה מדיה עם וללא פפטידים פוטנציאליים במשך 6-7 ימים. לאחר מכן, אפידרמיס cotyledon הוא דמיינו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. באופן כללי, כדי להמחיש בבירור את הפעילות הביולוגית של פפטידים פוטנציאליים בהתפתחות סטומטלית, הגנוטיפים המייצרים יותר ו / או פחות תאי שושלת סטומטלית, כגון מוטנט epf2, המייצר יותר תאי אפידרמיס, וקו STOMAGEN-ami, המקנה צפיפות תאי אפידרמיס מופחתת 2,4,5, משמשים בנוסף לבקרת Arabidopsis מסוג פראי (Col-0) עבור bioassays.
בסך הכל, שני הפרוטוקולים המוצגים כאן יכולים לשמש להערכה מהירה ויעילה של פנוטיפים אפידרמליים שונים ולסינון פפטידים קטנים והורמונים שיש להם תפקיד בבקרת דפוס סטומטלי והתפתחות.

<table><tbody><tr><td>18 מ"מ x 18 מ"מ תלוש כיסוי</td><td>VWR</td><td>16004-326</td><td></td></tr><tr><td>צלחות סטריליות 24 בארות עם מכסה</td><td>VWR</td><td>CA62406-183</td><td></td></tr><tr><td>3M קלטת כירורגית מיקרופורית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>19-027-761</td><td>סרט נייר כירורגי מיקרופורוס המשמש לאיטום לוחות MS</td></tr><tr><td>76 x 26 מ"מ שקופית מיקרוסקופ</td><td>TLG</td><td>GEW90-2575-03</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית, &ge; 99.8%&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>ביושופ</td><td>AGR001.1</td><td></td></tr><tr><td>Bleech</td><td>אקונומיקה ביתית (למשל, קלורוקס)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי&nbsp;</td><td>ניקון&nbsp;</td><td></td><td>ניקון C2 המופעל על ידי NIS-Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>גרינפילד</td><td>P210EAAN</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>Open-srouce</td> <td>(פיג'י זה רק) ImageJ v2.1/1.5.3j</td><td>הורד מ-https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>מלקחיים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F6521&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תערובת הוויטמינים של Gamborg</td><td>Cassson Labs</td><td>GBL01-100ML</td><td>חנות ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>תאי גידול</td><td>Conviron,&nbsp; דגם E15</td><td></td><td>מחזור אור 16 שעות, מוגדר על 21&deg; C בעוצמת אור של 120 ומיקרו; mol&middot; m-2&middot; s-1.</td></tr><tr><td>אורות</td><td>אספקת HD</td><td>25272</td><td>נורות פלורסנט&nbsp; בתאי צמיחה, סילבניה F72T12/CW/VHO 72 אינץ' T12 VHO 4200K&nbsp;</td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-222-155</td><td>צינורות בהם מונחים זרעי Arabidopsis thaliana לביצוע עיקור</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Eclipse TiE מצויד במצלמה דיגיטלית DsRi2</td></tr><tr><td>Murashige ומלחים בזאליים Skoog&nbsp;</td><td>חנות Cassson</td><td>Labs MSP01-1LT</td><td>ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 100 מ"מ x 20 מ"מ&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-757-11Z</td><td>צלחות פטרי בהן מוזגים מדיה טרשת נפוצה לצורך גידול Arabidopsis thaliana</td></tr><tr><td>Propidium Iodide&nbsp;</td><td>VWR</td><td>39139-064</td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-916-5A</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>ביושופ</td><td>SUC700.5</td><td></td></tr><tr><td>כחול טולואידין O</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T3260-5G</td><td></td></tr><tr><td>טריס בסיס</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-אסטרדיול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E2758</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי הגנים המעורבים בהתפתחות סטומאטלית באמצעות ניקוד פנוטיפ אפידרמלי

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

סטומטות הן נקבוביות קטנות על פני השטח של צמחי יבשה המעורבות בחילופי גזים ובשחרור אדי מים, ותפקידן קריטי לפריון הצמח ולהישרדותו. ככזו, להבנת המנגנונים שבאמצעותם מתפתחות ותבניות הפיוניות יש ערך אגרונומי עצום. מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפיות המשתמשות בקוטילדונים Arabidopsis שניתן להשתמש בהן כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות ובתבניות סטומטליות. תחילה מוצגים נהלים לניתוח הפנוטיפים הסטומאטליים באמצעות cotyledons מוכתמים O כחול toluidine. שיטה זו מהירה ואמינה ואינה דורשת שימוש בקליפות אפידרמיס, הנמצאות בשימוש נרחב לניתוחים פנוטיפיים אך דורשות הכשרה מיוחדת. בשל נוכחותן של שאריות ציסטאין מרובות, הזיהוי והייצור של פפטידים ביו-אקטיביים מסוג EPF שיש להם תפקיד בהתפתחות סטומטלית היו מאתגרים. לפיכך, השני הוא הליך המשמש לזיהוי ליגנדות stomatal וניטור הפעילות הביולוגית שלהם על ידי bioassays. יתרונה העיקרי של שיטה זו הוא בכך שהיא מפיקה נתונים הניתנים לשחזור בקלות יחסית, תוך הפחתת כמות תמיסת הפפטיד והזמן הנדרש לאפיון תפקידם של הפפטידים בשליטה על דפוס סטומטלי והתפתחותו. בסך הכל, פרוטוקולים מתוכננים היטב אלה משפרים את היעילות של לימוד הרגולטורים הסטומאטליים הפוטנציאליים, כולל פפטידים מפרישים עשירים בציסטאין, הדורשים מבנים מורכבים ביותר לפעילותם.

צמחים טרנסגניים סטומטיים שונים ומוטנטים הידועים כבעלי צפיפות סטומטית ואשכולות נמוכים או יותר (epf2 2,5, epf1 epf22,5, tmm12, קו 4 מושתק STOMAGEN, וקווים טרנסגניים הנושאים את מבנה ביטוי היתר Est::EPF1 או Est::EPF2 7 ) שימשו להדגמת יעילותם של שני הניתוחים הפנוטיפיים שהוצגו כאן, שמטר...

מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפ ללא שימוש בקליפות אפידרמיס כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות הסטומטלית. השיטה הראשונה מדגימה כיצד לנתח פנוטיפ סטומטלי באמצעות אפידרמיס צמחי מוכתם O כחול טולוידין. השיטה השנייה מתארת כיצד לזהות ליגנדות סטומטיות ולנטר את פעילותן הביולוגית.

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant ...

שתי שיטות הניתוח הפנוטיפיות המוצגות כאן מציעות תמונות באיכות גבוהה המספיקות לביצוע ניתוח פנוטיפי כמותי ולהדגמת תגובות פנוטיפיות של טיפול בפפטיד עם פרטים אפידרמיסיים. כתוצאה מכך, שתי שיטות אלה יכולות לשמש להבנת דפוסי תאי האפידרמיס והתפתחותם. שתי שיטות אלה הן טכניקות קלות ואמינות יחסית מכיוון שהן אינן דורשות כימיקלים רעילים או פיסת אפידרמיס הנמצאים בשימוש נרחב לניתוח פנוטיפי אפידרמיס.עם זאת, הטכניקות מסובכות והן דורשות הכשרה מיוחדת. כדי להתחיל, בזהירות לבחור ולחתוך את אחד cotyledons מן שתילים בודדים כי הם גדלים באופן אחיד עם שתילים אחרים על הצלחת כדי להגביל את השונות. הכניסו כל קוטילדון לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל מיליליטר אחד של תמיסת קיבוע באמצעות מלקחיים והשאירו את הדגימה בתמיסת הקיבוע למשך הלילה בטמפרטורת החדר.הסר את פתרון הקיבוע והוסף מיליליטר אחד של 70% אתנול. הפוך את הצינור מספר פעמים והשאר את הצינור המכיל את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך כ -30 דקות. חזור על שלב זה באמצעות מיליליטר אחד של 50% אתנול ולאחר מכן 20% אתנול.החליפו את המיליליטר האחד של 20% אתנול במיליליטר אחד של מים מזוקקים, הפכו את הצינור המכיל את דגימות הקוטילדון מספר פעמים והשאירו אותו למשך כ-30 דקות. מוציאים את כל המים המזוקקים מהצינור ומוסיפים מיד כ-200 מיקרוליטר של תמיסת צביעה Toluidine Blue O או TBO למשך כשתי דקות. הסר את תמיסת צביעת TBO ביסודיות ככל האפשר ולאחר מכן שטוף מיד את הדגימות כמה פעמים על ידי הוספת מיליליטר אחד של מים מזוקקים טריים.במכסה מנוע של זרימה למינרית, השתילו בזהירות 10 עד 12 שתילי ארבידופסיס בני יום אחד מכל אחת משתי הצלחות המוכנות לצלחת בת 24 בארות המכילה 1.5 מיליליטר של חצי מדיום נוזלי טרשת נפוצה בכל באר. הוסף חיץ HCL של 50 מילימולר טריס בלבד או שני ריכוזים שונים של הפפטיד לכל באר המכילה את השתילים שנבטו על חצי לוחות אגר MS. מערבבים בעדינות את השתילים עם החיץ בלבד או עם תמיסת פפטיד באמצעות פיפטה ואוטמים את הצלחת בסרט מיקרו-נקבוביות.לדגור על צלחת הבדיקה בתנאי יום ארוך במשך חמישה עד שבעה ימים ב 22 מעלות צלזיוס. מעבירים שתיל מהבאר על מגלשת כיסוי ומנתחים את הקוטילדון של השתיל. מניחים את הצד האבקסיאלי של הקוטילדון בעזרת מלקחיים וחותכים אותו לחתיכות קטנות.קחו עוד שקופית מיקרוסקופ נקייה והניחו עליה טיפה של תמיסת יודיד פרופידיום. מניחים את אחת החתיכות הקטנות של קוטילדון לתוך הטיפה באמצעות מלקחיים ומניחים בעדינות את הכיסוי. יש למרוח תמיסת פרופידיום יודיד נוספת על קצה הכיסוי כדי להסיר בועות אוויר שנוצרו.דמיינו את הצד האבקסיאלי של הקוטילדון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי והשוו את התמונות לתמונות משתילים שגדלו בחצי מדיום MS המכיל חיץ בלבד. תמונות של אבקסיאל קוטילדון משתילים בני 10 ימים של שלושה גנוטיפים של Arabidopsis, סוג פראי, קו מושתק STOMAGEN ומוטנטים epf1 epf2 מוצגות כאן. כאן, הקו המושתק STOMAGEN מייצג את הגנוטיפים עם מספר נמוך של פיוניות והמוטנטים epf1 epf2 מייצגים את הגנוטיפים עם מספר גבוה של פיוניות.תמונות האפידרמיס המייצגות של קוטילדונים משתילים בני 10 ימים מסוג בר, TMM וקווים טרנסגניים הנושאים מבנה ביטוי יתר של אסטרדיול המושרה epf2 או epf1 שימשו לניתוח כמותי של פנוטיפ האפידרמיס. התמונות הקונפוקליות המייצגות של אפידרמיס מסוג בר ואפידרמיס קוטילדון epf2 שגדלו במשך שישה עד שבעה ימים בתמיסת חיץ ואפידרמיס קוטילדון epf2 שגדל עם שתי אצוות שונות של פפטידים מסוג epf2 מוצגות באיור זה. על ידי ביצוע הליך זה, הקפד לחתוך את אחד cotyledons משתיל בודד שכבר גדל באופן אחיד עם שתילים אחרים.בחר גם שתיל שאינו נוגע במדיה של MS כדי להגביל את השונות. נקודה נוספת שיש לזכור היא כי לא מניחים יותר מחמישה cotyledons בצינור microcentrifuge אחד. כמו כן, החלק בעדינות את הצינור כדי להבטיח פיזור אחיד של כתמי TBO סביב הקוטילדונים כדי להכתים אותם היטב.בהתחשב בכך שפפטידים מבניים מרובים קיימים בתמיסת פפטידים, שיטת bioassay זו תהיה שימושית מאוד לזיהוי צורות מקופלות וביו-אקטיביות כראוי של פפטיד והפונקציות הביולוגיות שלהם.

identification-genes-involved-stomatal-development-via-epidermal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פיתחנו פרוטוקול פשוט לגשת לשחזור בתגובה הפיוניות לחיידקים לחיות. שיטה זו מקטינה ופצע ומניפולציה של העלה, לעומת השימוש קליפות אפידרמיס שדווח קודם לכן.

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

התרת איך פיזיולוגיה ומורפולוגיה צמודות מאפשרת הבנה עמוקה יותר של תפקוד מכניסטית של צמח עלים. אנו מציגים שני הליך לגזור פרמטרים של רגולציה הפיוניות ממדידות הפיוניות מוליכות ומתאמים עם תכונות עלה פונקציונליות מסורתיות.

הנוגע לתכונות מוליכות הפיוניות פונקציונליות ליף

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לפקח דינמיקת fluorescently- מתויג חלבון על משטחי תא צמח עם מיקרוסקופיה epifluorescence זווית משתנה, מראה מהבהב נקודות של PATROL1 מתויג GFP, חלבון סחר קרום, בקליפת התא של המתחם הפיוניות ב thaliana ארבידופסיס.

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

ברמה התת-תאית, אירועי איתות מווסתים באופן דינמי על ידי רמזים התפתחותיים וסביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת הביטוי החולפת של הטבק כדי לנטר אינטראקציה דינמית של חלבון-חלבון ולחשוף ארגון מרחבי של העברת אותות בתאי צמחים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

פרוטוקול זה מתאר שיטת הכנת מועשר בתאי המשמר stomatal שימושי עבור מחקרים ביולוגיים פיזיולוגיים ואחרים.

הפיוניות הקלטת-פיל: שיטה משופרת עבור הכנת הדוגמא משמר תא

אנו מספקים שיטה לזיהוי מודולים של דיות שקרנים על ידי הקרנת בקנה מידה גדול של ספריה מורכבת.

זיהוי של הרגולטורים הרומן של דיות צמח על ידי הקרנת הדמיה תרמית בקנה מידה גדול בהליוציץ השנתי

מתרגם הריבוכמה אהדה (מלכודת) מציעה את האפשרות לנתח תוכניות התפתחותיות עם עיבוד מינימלי של איברים ורקמות. הפרוטוקול מניב RNA באיכות גבוהה מתאים המיועדים עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-יחידת משנה ריבוזומבית. כלים לניתוח במורד הזרם, כגון רביעיית-PCR או RNA-seq, חושפים פרופילי ביטויים ספציפיים לסוג תאים.

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים ב - Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממנפת מכשיר הדמיה סטומטלי נייד, יחד עם צינור ניתוח תמונה המיועד לתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר.

תצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות למזרקי Pseudomonas PV . עגבניה DC3000 ב Arabidopsis thaliana

פרוטוקול זה מציג שיטה השוואתית להערכת תכונות סטומטליות ואפידרמליות בשני מינים מובחנים, באמצעות פילינג אפידרמלי, טכניקות ניקוי וניתוח תמונות בעזרת בינה מלאכותית. המטרה היא לאפשר כימות בתפוקה גבוהה וניתנת לשחזור של מבנים תאיים הבסיס לתפקוד הפיוניתי ליישומים חקלאיים ולמחקר צמחי רחב.

אפיון תכונות פטיחות ואפידרמליות באמצעות פילינג, ניקוי וניתוח תמונות מבוסס בינה מלאכותית

למדו שיטות חדשניות לניתוח פנוטיפי של התפתחות סטומטות בצמחים באמצעות צביעת toluidine blue O בזרעי Arabidopsis. השיטות מאפשרות הערכה מדויקת של תכונות אפידרמליות ללא חומרים רעילים.

זיהוי הגנים המעורבים בהתפתחות סטומאטלית באמצעות ניקוד פנוטיפ אפידרמלי

גלה סרטונים נוספים