זיהוי הגנים המעורבים בהתפתחות סטומאטלית באמצעות ניקוד פנוטיפ אפידרמלי

מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפ ללא שימוש בקליפות אפידרמיס כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות הסטומטלית. השיטה הראשונה מדגימה כיצד לנתח פנוטיפ סטומטלי באמצעות אפידרמיס צמחי מוכתם O כחול טולוידין. השיטה השנייה מתארת כיצד לזהות ליגנדות סטומטיות ולנטר את פעילותן הביולוגית.

שתי שיטות הניתוח הפנוטיפיות המוצגות כאן מציעות תמונות באיכות גבוהה המספיקות לביצוע ניתוח פנוטיפי כמותי ולהדגמת תגובות פנוטיפיות של טיפול בפפטיד עם פרטים אפידרמיסיים. כתוצאה מכך, שתי שיטות אלה יכולות לשמש להבנת דפוסי תאי האפידרמיס והתפתחותם. שתי שיטות אלה הן טכניקות קלות ואמינות יחסית מכיוון שהן אינן דורשות כימיקלים רעילים או פיסת אפידרמיס הנמצאים בשימוש נרחב לניתוח פנוטיפי אפידרמיס.

עם זאת, הטכניקות מסובכות והן דורשות הכשרה מיוחדת. כדי להתחיל, בזהירות לבחור ולחתוך את אחד cotyledons מן שתילים בודדים כי הם גדלים באופן אחיד עם שתילים אחרים על הצלחת כדי להגביל את השונות. הכניסו כל קוטילדון לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל מיליליטר אחד של תמיסת קיבוע באמצעות מלקחיים והשאירו את הדגימה בתמיסת הקיבוע למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

הסר את פתרון הקיבוע והוסף מיליליטר אחד של 70% אתנול. הפוך את הצינור מספר פעמים והשאר את הצינור המכיל את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך כ -30 דקות. חזור על שלב זה באמצעות מיליליטר אחד של 50% אתנול ולאחר מכן 20% אתנול.

החליפו את המיליליטר האחד של 20% אתנול במיליליטר אחד של מים מזוקקים, הפכו את הצינור המכיל את דגימות הקוטילדון מספר פעמים והשאירו אותו למשך כ-30 דקות. מוציאים את כל המים המזוקקים מהצינור ומוסיפים מיד כ-200 מיקרוליטר של תמיסת צביעה Toluidine Blue O או TBO למשך כשתי דקות. הסר את תמיסת צביעת TBO ביסודיות ככל האפשר ולאחר מכן שטוף מיד את הדגימות כמה פעמים על ידי הוספת מיליליטר אחד של מים מזוקקים טריים.

במכסה מנוע של זרימה למינרית, השתילו בזהירות 10 עד 12 שתילי ארבידופסיס בני יום אחד מכל אחת משתי הצלחות המוכנות לצלחת בת 24 בארות המכילה 1.5 מיליליטר של חצי מדיום נוזלי טרשת נפוצה בכל באר. הוסף חיץ HCL של 50 מילימולר טריס בלבד או שני ריכוזים שונים של הפפטיד לכל באר המכילה את השתילים שנבטו על חצי לוחות אגר MS. מערבבים בעדינות את השתילים עם החיץ בלבד או עם תמיסת פפטיד באמצעות פיפטה ואוטמים את הצלחת בסרט מיקרו-נקבוביות.

לדגור על צלחת הבדיקה בתנאי יום ארוך במשך חמישה עד שבעה ימים ב 22 מעלות צלזיוס. מעבירים שתיל מהבאר על מגלשת כיסוי ומנתחים את הקוטילדון של השתיל. מניחים את הצד האבקסיאלי של הקוטילדון בעזרת מלקחיים וחותכים אותו לחתיכות קטנות.

קחו עוד שקופית מיקרוסקופ נקייה והניחו עליה טיפה של תמיסת יודיד פרופידיום. מניחים את אחת החתיכות הקטנות של קוטילדון לתוך הטיפה באמצעות מלקחיים ומניחים בעדינות את הכיסוי. יש למרוח תמיסת פרופידיום יודיד נוספת על קצה הכיסוי כדי להסיר בועות אוויר שנוצרו.

דמיינו את הצד האבקסיאלי של הקוטילדון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי והשוו את התמונות לתמונות משתילים שגדלו בחצי מדיום MS המכיל חיץ בלבד. תמונות של אבקסיאל קוטילדון משתילים בני 10 ימים של שלושה גנוטיפים של Arabidopsis, סוג פראי, קו מושתק STOMAGEN ומוטנטים epf1 epf2 מוצגות כאן. כאן, הקו המושתק STOMAGEN מייצג את הגנוטיפים עם מספר נמוך של פיוניות והמוטנטים epf1 epf2 מייצגים את הגנוטיפים עם מספר גבוה של פיוניות.

תמונות האפידרמיס המייצגות של קוטילדונים משתילים בני 10 ימים מסוג בר, TMM וקווים טרנסגניים הנושאים מבנה ביטוי יתר של אסטרדיול המושרה epf2 או epf1 שימשו לניתוח כמותי של פנוטיפ האפידרמיס. התמונות הקונפוקליות המייצגות של אפידרמיס מסוג בר ואפידרמיס קוטילדון epf2 שגדלו במשך שישה עד שבעה ימים בתמיסת חיץ ואפידרמיס קוטילדון epf2 שגדל עם שתי אצוות שונות של פפטידים מסוג epf2 מוצגות באיור זה. על ידי ביצוע הליך זה, הקפד לחתוך את אחד cotyledons משתיל בודד שכבר גדל באופן אחיד עם שתילים אחרים.

בחר גם שתיל שאינו נוגע במדיה של MS כדי להגביל את השונות. נקודה נוספת שיש לזכור היא כי לא מניחים יותר מחמישה cotyledons בצינור microcentrifuge אחד. כמו כן, החלק בעדינות את הצינור כדי להבטיח פיזור אחיד של כתמי TBO סביב הקוטילדונים כדי להכתים אותם היטב.

בהתחשב בכך שפפטידים מבניים מרובים קיימים בתמיסת פפטידים, שיטת bioassay זו תהיה שימושית מאוד לזיהוי צורות מקופלות וביו-אקטיביות כראוי של פפטיד והפונקציות הביולוגיות שלהם.