Name: שיטת אימוביליזציה אנכית לניתוח מיקרוסקופ בהילוך מהיר בכחוליות נימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: למדו שיטת אימוביליזציה אנכית לניתוח מיקרוסקופיה בכחוליות נימה Anabaena. השיטה מאפשרת צפייה בדינמיקת חלבון FtsZ ובמבנה ה-Z-ring בתלת-ממד, ומספקת כלי יעיל לחקר חלוקת תאים באורגניזמים רב-תאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה למלגות הדוקטורט הלאומיות (ANID 21211333; 21191389) על המימון. גרנט פונדסיט 1161232.
עבודה זו נתמכה על ידי de Advanced Microscopy Facility UMA UC.

1. שיקולים ובחירת המודל הסלולרי
הערה: לציאנובקטריה יש אוטופלואורסצנטיות חזקה עקב נוכחות פיגמנטים פוטוסינתטיים. אות זה נמצא בחלק האדום של הספקטרום, ולכן החלבונים הפלואורסצנטיים המתאימים להדמיה בציאנובקטריה הם אלה הרחוקים מהפליטה האדומה. לדוגמה, GFP, YFP, ונוס, טורקיז ו- BFP.
<ol><li>בחר רכיב דיוויזומי הקיים בזן הציאנובקטריאלי נימה המטרה. לצורך הניסויים יש צורך לבנות מוטציה ציאנובקטריאלית נימית המבטאת את הרכיב הדיוויזום שנבחר המאוחה לחלבון פלואורסצנטי. בפרוטוקול זה, מוטנט Anabaena sp. המבטא FstZ-sfGFP, כדוגמה. זן זה הושג על ידי הזדווגות תלת-הורית עם E. coli11.</li>
	<li>בדוק את רמת ההפרדה של המוטציה שבה ייעשה שימוש. בדוגמה, ההפרדה נקבעה על ידי הגברת PCR של גן המטרה. מוטנט FtsZ-sfGFP המשמש בפרוטוקול זה הוא זן מופרד לחלוטין החסר את הגן הפראי ftsZ.</li>
</ol>2. תנאי גידול
<ol><li>יצירת תת-תרבית חדשה של המוטנט באמצעות תרבית של 10 מ"ל בפאזה נייחת (גדלה במשך כ-14 יום באור קבוע, ב-25 מעלות צלזיוס, עבור Anabaena sp.) והוספה ל-90 מ"ל של מדיום BG11 בתוספת אנטיביוטיקה (ספקטינומיצין וסטרפטומיצין 10 μl ml-1 עבור מוטנט FtsZ-sfGFP).</li>
	<li>לגדל את תרבית התאים החדשה באור קבוע ובטמפרטורה האופטימלית עד שמגיעים לשלב המעריכי. מוטנט FtsZ-sfGFP של Anabaena sp. גדל ב 25 ° C במשך 7 ימים לפני הכנת המדגם.</li>
</ol>3. הכנת מדגם במטריצת אגרוז
<ol><li>קח 2 מ"ל של תרבות הצמיחה הומוגנית.</li>
	<li>צנטריפוגה בגודל 2,500 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בינתיים, בצלוחית של 50 מ"ל, מחממים 30 מ"ל של 3% נקודת התכה נמוכה אגרוז בתווך נוזלי BG11. השתמשו במיקרוגל בעוצמה בינונית ובדקו את התמיסה כל 15 שניות עד להמסה מלאה. מניחים בצד להתקרר ל-37°C. הערה: Autoclave הפתרון של agarose כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>לאחר סיום הצנטריפוגה, השליכו 1.9 מ"ל של הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים בנפח הנותר על ידי פיפטציה לפחות שלוש פעמים למעלה ולמטה.</li>
	<li>מערבבים את התאים המרחפים מחדש עם 900 μL של תמיסת אגרוז 3% על ידי פיפטציה למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים. הערה: תמיסת האגרוז חייבת להיות נוזלית אך לא חמה מדי כדי למנוע נזק לתאים. השלב הבא חייב להתבצע מהר ולפני שתמיסת האגרוז יוצרת ג'ל כמו עקביות =.</li>
	<li>שואפים את מטריצת האגרוז במזרק 1 מ"ל בזהירות. חשוב להימנע מיצירת בועות בזמן שהדגימה נשאפת עם המזרק. הערה: לפני שלב זה, ודא כי קצה המזרק נחתך כדי לחסל את חור הכניסה הצר.</li>
	<li>תן לתערובת הדגימה-אגרוז להתמצק על ידי הצבת המזרק במצב אופקי בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.</li>
	<li>הסר את מטריצת agarose בזהירות באמצעות הבוכנה ולשים אותו על משטח נקי ושטוח.</li>
	<li>חותכים את המדגם מוצק לפרוסות, בטווח עובי של 0.5 - 1 מ"מ, שמירה על שלמות המטריצה. הערה: לקבלת תוצאות טובות יותר, חתכו את מטריצת האגרוז באמצעות אזמל או סכיני גילוח דקים.</li>
	<li>מניחים את הפרוסות זו לצד זו על כיסוי. מספר הדיסקים על coverslip יהיה תלוי בממדים שלה. הערה: עבור מיקרוסקופ בהילוך מהיר, מומלץ להשתמש בתא תא המיועד לניתוח מיקרוסקופיה (למשל, תאים מגנטיים Attofluor או Chamlide). תאים אלה מאפשרים רכישת הדגימה תוך הימנעות מהתייבשות. בדוגמה זו הדגימות מוכנות על גבי כיסויים מעוגלים (25 מ"מ) באמצעות תא Attofluor.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל של תמיסת אגרוז 3% מומסת על הדגימה שהונחה בתא כדי למנוע התייבשות.</li>
	<li>המתן עד שתמיסת האגרוז מתמצקת לחלוטין ליצירת ג'ל.</li>
</ol>4. רכישת תמונות
<ol><li>תקנן את הפרמטרים כדי לדמיין את החלבון הפלואורסצנטי המעניין את הזן המוטנטי במיקרוסקופ קונפוקלי. ודא כי המיקרוסקופ יכול לזהות הן את autofluorescence ואת הסמן הפלואורסצנטי שנבחר.</li>
	<li>דמיינו את הדגימה בקונפורמציית השדה הבהיר עם הגדלה מרבית, וחפשו חוט להט בכיוון אנכי כפי שמוצג באיור 1.</li>
	<li>מצא את אתר החלוקה המעניין באמצעות סריקה ראשונית באמצעות האות האוטופלואורסצנטי לאורך מישור Z.</li>
	<li>השתמש בפרמטרים של סמן החלבון הפלואורסצנטי כדי לדמיין את האות של החלבון המעניין באתר החלוקה.</li>
	<li>לבצע ניסויים בהילוך מהיר בהתאם למודל הביולוגי ולחלבון המעניין. לדוגמה, במקרה הזה בוצעו ניסויים בהילוך מהיר של 10 שניות ב-50 שניות כדי לתעד את הדינמיקה של FtsZ לאורך טבעת Z ב-Anabaena sp. (איור 2).</li>
</ol>

<ol><li>Löwe, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li>
<li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ%2C+a+prokaryotic+homolog+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin.</a> Cell. 80 (3), 367-370 (1995).</li>
<li>Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+FtsZ+C-terminal+variable+%28+CTV+%29+region+in+Z-ring+assembly+and+interaction+with+the+Z-ring+stabilizer+ZapD+in+E%5BTitle%5D)+AND+%22coli+cytokinesis%22%5BJournal%5D)">Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E.</a> coli cytokinesis. , 1-24 (2016).</li>
<li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+dynamics+of+divisome+proteins+and+PBP2x%3AFtsW+in+cells+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).</li>
<li>Bisson-Filho, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treadmilling+by+FtsZ+filaments+drives+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division.</a> Science. 355 (6326), 739-743 (2017).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPase+activity-coupled+treadmilling+of+the+bacterial+tubulin+FtsZ+organizes+septal+cell+wall+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis.</a> Science. 355 (6326), 744-747 (2017).</li>
<li>Whitley, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+treadmilling+is+essential+for+Z-ring+condensation+and+septal+constriction+initiation+in+Bacillus+subtilis+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division.</a> Nature Communications. 12 (1), (2021).</li>
<li>Mazón, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LexA-binding+sequences+in+Gram-positive+and+cyanobacteria+are+closely+related%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related.</a> Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).</li>
<li>Mandakovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyDiv%2C+a+conserved+and+novel+filamentous+cyanobacterial+cell+division+protein+involved+in+septum+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).</li>
<li>Camargo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZipN+is+an+essential+FtsZ+membrane+tether+and+contributes+to+the+septal+localization+of+SepJ+in+the+filamentous+cyanobacterium+Anabaena%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).</li>
<li>Thiel, T., Peter Wolk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugal+Transfer+of+Plasmids+to+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).</li>
<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+chemostat%3A+An+agarose-based%2C+microfluidic+device+for+high-throughput%2C+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים.

חקר הדינמיקה של חלבונים דיוויזומים הוא ללא ספק אתגר. בפרט, בציאנובקטריה נימה, אחד האתגרים הוא הדמיה של טבעת Z במישור האופקי, שעבורה התאים חייבים להיות בכיוון אנכי. השיטה שתיארנו כאן מאפשרת את מיקום טבעת Z במישור XY לביצוע הניתוחים השונים. זוהי השיטה הפשוטה הראשונה עבור ציאנובקטריה נימה המאפשרת הדמיה מלאה של טבעת Z. 
למרות שפרוטוקול זה הוא פשוט ומהיר, יש לנקוט בזהירות מיוחדת במהלך שלב הכנת הדגימה במטריצת האגרוז, שכן נקודת ההתכה הנמוכה חייבת להיות בטמפרטורה מתאימה כדי להיות נוזלית מספיק לערבוב ע...

חלוקת תאי חיידקים היא תהליך שבו תא אם מייצר שני תאי בת, ברוב המקרים על ידי מנגנון המכונה ביקוע בינארי. אחד האירועים המוקדמים ביותר בתהליך המחיצה הוא לוקליזציה של FtsZ באמצע התא1. חלבון זה, שהוא הומולוגי מבחינה מבנית לטובולין2, נשמר ומופץ באופן נרחב ברוב החיידקים, והפילמור שלו יוצר מבנה כיווץ המכונה טבעת Z3. טבעת זו משמשת כפיגום לחלבוני חלוקה אחרים ויחד הם יוצרים מנגנון מולקולרי הנקרא דיוויזום. מספר מחקרים הראו כי טבעת Z היא דינמית מאוד וכי פרוטופילמנטים FtsZ נעים על ידי הליכון 4,5,6. כדי לחקור את טבעת Z בניסויי קיטועי זמן, מומלץ להקליט את אתר החלוקה במישור XY לרזולוציה טובה יותר ולדגימה מהירה. על מנת להשיג זאת, יש צורך לפתח שיטות אימוביליזציה של תאים אנכיים הכוללות בדרך כלל ננו-ייצור של מלכודות תאי מיקרו-חורים והתקנים מיקרופלואידים מורכבים7.
ציאנובקטריה הם מיקרואורגניזמים פוטוסינתטיים המסווגים כגראם-שליליים על ידי המורפולוגיה התאית שלהם. עם זאת, מבחינה פילוגנטית הם קרובים יותר לחיידקים גראם-חיוביים8. לאורגניזמים אלה יש גנים של חלוקת תאים הנפוצים בחיידקים גראם-חיוביים וגראם-שליליים, אך הדיוויזום שלהם מכיל גם יסודות ייחודיים9. Anabaena sp. PCC 7120 (להלן Anabaena sp.) הוא ציאנובקטריה נימית בעלת מישור חלוקה אחד והיא מודל לחקר חלוקת תאים בציאנובקטריה רב-תאית. בזן זה, ניתן היה לקבוע את המיקום של FtsZ באמצע התאים10. עם זאת, אין מחקרים המראים את הדינמיקה in vivo של FtsZ במודל זה. במעבדה שלנו, באמצעות הזדווגות תלת-הורית ורקומבינציה הומולוגית, השגנו מוטציה מופרדת לחלוטין של Anabaena sp. המבטאת את חלבון FtsZ המאוחה ל-sfGFP, שהחליף את הגן ftsZ האנדוגני המלא. פיתחנו שיטת אימוביליזציה מהירה ופשוטה של תאים המעדיפה את הכיוון האנכי של חוטי הזן המוטנטי לניסויים בהילוך מהיר כדי לדמיין את חלבוני החלוקה בציאנובקטריה נימה. שיטה זו אינה זקוקה להתקנים מיקרופלואידים שיכולים להיות יקרים וקשים לפיתוח. לדוגמה, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לדמיין את טבעת Z במוטציה FtsZ-sfGFP באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

<table><tbody><tr><td>מזרק 1 מ"ל</td><td>צ'ינגדאו אגנה טכנולוגיה רפואית ושות', בע"מ</td><td>-</td><td>מזרק הפלסטיק הרפואי החד פעמי עם מחט 1 מ"ל המשמש בדרך כלל לשאיבת נוזל או נוזל הזרקה, בניסוי זה הוא משמש ליניקת הדגימה והפיכתה לפילמור.</td></tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A7816</td><td>מצלמת התא Attofluor היא מחזיק כיסוי עמיד ופרקטי המיועד לצפייה בדגימות תאים חיים במיקרוסקופים זקופים או הפוכים.</td></tr><tr><td>Axygen MaxyGene II Thermal Cycler עם 96 בארות בלוק</td><td>CORNING</td><td>THERM-1001</td><td>ה-MaxyGene II Thermal Cycler החדש הגביר את המהירות והתכונות המתקדמות, ומספק את ביצועי הפרימיום שלמדת לצפות ממוצרי המותג Axygen. תכנות גמיש ייחודי. זמני ריצה מהירים. זרימת עבודה משופרת בהשוואה למחזורי שיפוע מסורתיים. קצבי הגברה של עד 5&deg; ג/שנייה מכסה מחומם מתכוונן מכיל רצועות, צינורות ומיקרופלטות.</td></tr><tr><td>משקפי כיסוי פישרברנד: Circles</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12-546-2P</td><td>עשוי מזכוכית בורוסיליקט אופטית משובחת, בעובי וגודל אחידים. צורה מעגלית. עמיד בפני קורוזיה.&nbsp;</td></tr><tr><td>נקודת התכה נמוכה agarose</td><td>Promega</td><td>V3841</td><td>Agarose, נקודת התכה נמוכה, דרגה אנליטית, אידיאלית ליישומים הדורשים שחזור של שברי DNA שלמים לאחר אלקטרופורזה של ג'ל.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ LSM 880 מבית Zeiss Airyscan</td><td></td> Zeiss-המיקרוסקופ <td></td><td>Zeiss Airyscan LSM 880 הוא מיקרוסקופ מוקד סריקת לייזר שיכול לרכוש תמונות מתחת למגבלת הרזולוציה (רזולוציה רוחבית ~ 120 ננומטר ורזולוציה צירית ~ 350 ננומטר). הגלאים רגישים מאוד ומאפשרים לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה במהירות גבוהה.</td></tr><tr><td>מיקרוצנטר ואקוט; fuga Fresco 17</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75002402</td><td>להאיץ את תהליכי הכנת הדגימה השגרתיים עד פי 17,000 וגרם עם המיקרו-צנטריפוגה הסטנדרטית שלנו, הזמינה בקירור. מיקרו-צנטריפוגות אלו מציעות פרודוקטיביות, רב-תכליתיות, בטיחות ונוחות במכשיר מעבדה קומפקטי וקל לשימוש.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Timelapse של ניקון</td><td></td> <td>ניקון-מיקרוסקופ</td> <td>סריקת לייזר C2 של ניקון הוא מיקרוסקופ אידיאלי לזמן ארוך טווח, מכיוון שבזכות תא הדגירה שלו ניתן לשמור דגימות בתנאים אופטימליים במשך יותר מ-8 שעות.</td></tr><tr><td>סכיני גילוח דקים Schick Super Chromium</td><td>Farmazon</td><td>מק"ט: 401146</td><td>&nbsp; סכיני הגילוח הדקים משמשים לחיתוך מטריצת האגרוז, ומאפשרים לנו להשיג את הדיסקים עם הדגימה תוך שמירה על שלמות המטריצה.</td></tr></tbody></table>

שיטת אימוביליזציה אנכית לניתוח מיקרוסקופ בהילוך מהיר בכחוליות נימה

Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria

אירוע מרכזי בחלוקת תאי חיידקים הוא תהליך הספטציה, שבו החלבון FtsZ הוא מרכיב המפתח. FtsZ מתפלמר ויוצר מבנה דמוי טבעת (טבעת Z) במרכז התא המשמש כפיגום לחלבוני חלוקה אחרים. מיקרוסקופ ברזולוציית על במודלים חיידקיים Escherichia coli ו - Bacillus subtilis הראה כי טבעת Z אינה רציפה, בעוד מחקרי הדמיה של תאים חיים הראו כי FtsZ נע לאורך הטבעת על ידי מנגנון המכונה הליכון. כדי ללמוד את הדינמיקה של FtsZ in vivo, מיקום תא מיוחד במצב אנכי נחוץ להדמיית המבנה המלא של הטבעת במישור XY. במקרה של דימות FtsZ בציאנובקטריה רב-תאית, כגון Anabaena sp. PCC7120, שמירה על החוטים במצב אנכי היא מאתגרת בגלל גודל התאים ואורך החוטים. במאמר זה, אנו מתארים שיטה המאפשרת אימוביליזציה אנכית של חוטי Anabaena sp. PCC 7120 באמצעות נקודת התכה נמוכה agarose ומזרקים, כדי להקליט את טבעת Z במוטציה המבטאת חלבון היתוך FtsZ-sfGFP. שיטה זו היא דרך מהירה וזולה לרשום דינמיקה של חלבונים באתר החלוקה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

הדמיה של טבעת Z ב Anabaena sp. באמצעות שיטת immobilization אנכי כדי ללמוד את הדינמיקה של רכיבי טבעת Z בחיידקים, יש צורך לרכוש תמונות בתאים בכיוון אנכי. במצב זה, ניתן לדמיין את טבעת Z ואת החלבונים העיקריים של divisome כדי לפקח על דינמיקה של חלבונים על ידי מיקרוסקופ time-lapse. הכנת הדגימה הקלאסית לחיידקים אינה פועלת עבור ציאנובקטריה נימה. במקרה של Anabaena sp., החוטים מכוונים במצב שאינו מאפשר לדמיין את טבעת Z. בנוסף, לא ניתן לשמור על החוטים משותקים לצורך הדמיה נכונה של חלבוני חלוקת הת...

אנו מציגים שיטה פשוטה ונגישה להדמיית ציאנובקטריה נימית במישור XY. נעשה שימוש במטריצת אגרוז נקודת התכה נמוכה, המאפשרת רכישת תמונות של חלבונים המעורבים בחלוקה, בכיוון אנכי. לכן, מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על כל אורגניזם נימה וסוגים שונים של חלבונים.

A main event in bacterial cell division is the septation process, where the protein FtsZ is the key element. FtsZ polymerizes forming a ring-like ...

בחיידקים, חקר הדינמיקה של חלבוני חלוקת התא דורש אוריינטציה מרחבית של התאים. לדוגמה, במקרה של טבעת Z, המרכיב העיקרי בחלוקת התא החיידקי, כיוון אנכי הוא בסיסי כדי להקליט את כל המבנה במישור XY. בסרטון זה, אנו מפתחים שיטה להשגת אוריינטציה מסוימת זו בציאנובקטריה נימית Anabaena.Anabaena הוא אורגניזם פוטוסינתטי רב-תאי, וחולק עם חיידקים אחרים את היכולת להשתמש בדיניטרוגן אטמוספרי כמקור חנקן. בהיעדר אלמנט זה, Anabaena להבדיל תאים המתמחים קיבוע חנקן. לכן, הוא מספק מודל מצוין שבו לנתח את הקשר בין חלוקת התא לבין רב תאיות.ראשית, בחר רכיב divisome נוכח זן ציאנובקטריאל נימה המטרה. לצורך הניסוי יש צורך לבנות מוטציה ציאנובקטריאלית נימית המבטאת את הרכיב הדיוויזום שנבחר המאוחה לחלבון פלואורסצנטי. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במוטציה Anabaena המבטאת FtsZ המאוחה ל- GFP כדוגמה.ראשית, ליצור תת-תרבית חדשה של המוטנט עם 10 מיליליטר של תרבית בשלב נייח, ו-90 מיליליטר של תווך נוזלי. לאחר מכן לגדל את תרבית התאים החדשה באור קבוע ובטמפרטורה אופטימלית, עד שמגיעים לשלב המעריכי. בדוגמה שלנו, המוטציה גודלה ב-25 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים.עכשיו לוקחים שני מיליליטר מתרבות הגידול ושמים אותם בצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 2, 500 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, בדוק שכל התאים נמצאים בתחתית הצינור.היזהר בעת הטיפול בדגימות, כדי למנוע השעיה חוזרת. חממו את תמיסת האגרוז בעלת נקודת ההתכה הנמוכה ב-3% במיקרוגל. חשוב לעשות זאת בפרקי זמן קצרים, ולבדוק את התמיסה עד נוזלית לחלוטין.ברגע שהוא נמס, מניחים בצד כדי להתקרר. קח את צינורות הצנטריפוגות של השלב הקודם, השליך 1.9 מיליליטר של supernatant, ו להשעות מחדש את התאים בנפח הנותר על ידי pipeting לפחות שלוש פעמים למעלה ולמטה. במקום העבודה שלך, שים את הצינור עם התאים, תמיסת האגרוז המומסת, מזרק של מיליליטר אחד חתוך בקצה, ואזמל עם להב חדש ונקי.לאחר מכן מערבבים את התאים עם 900 מיקרוליטר של תמיסת 3% agarose על ידי pipetting לפחות שלוש פעמים. חשוב מאוד לוודא כי הפתרון agarose הוא לא חם מדי, אבל נשאר נוזלי. עם זאת, אנו נמנעים מנזק לתאים במהלך תהליך זה.השלב הבא חייב להיעשות מהר, ולפני הפתרון agarose gelifies. למצוץ את מטריצת agarose מזרק אחד מיליליטר, בזהירות. חשוב להימנע מיצירת בועות בזמן שהדגימה נשאבת.לאחר מכן, לדגור את המדגם, לשים את המזרק במצב אופקי בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. לאחר הדגירה, בזהירות להסיר את המטריצה עם התאים באמצעות הבוכנה במשטח נקי ושטוח. באמצעות אזמל, לחתוך את מדגם ג'ל לפרוסות דקות ככל האפשר, שמירה על שלמות המטריצה.לאחר מכן הפקידו את הדגימות בתלוש הכיסוי המתאים, זו לצד זו. כפי שמוצג בסרטון, בשלב זה, תוכל להשתמש בעצה כדי לסייע בתהליך הטיפול בדגימה. עבור ניסויים בהילוך מהיר, מומלץ להשתמש בתא תא המיועד לניתוח מיקרוסקופיה.במקרה זה, אנו משתמשים בכיסויים עגולים המתאימים לתאים מסוג זה, כפי שניתן לראות בסרטון. לבסוף, כדי למנוע התייבשות של הדגימה, להוסיף נפח נוסף של תמיסת 3% agarose מומס בתוך החדר. לפני ההדמיה, המתן עד agarose הוא gelified לחלוטין.עכשיו לשים את החדר עם התאים במיקרוסקופ להדמיה. מומלץ להשתמש בציוד עם בקרת טמפרטורה ולחות. דמיינו את הדגימה בשדה בהיר עם הגדלה מרבית, וחפשו חוט להט בכיוון אנכי.ניתן למצוא את אתר החלוקה המעניין בסריקה ראשונית באמצעות האות האוטופלואורסצנטי לאורך מישור Z. עם זאת, השתמש בפרמטרים של סמן החלבון הפלואורסצנטי שלך כדי לדמיין את האות של החלבון שלך של עניין באתר החלוקה. כעת ניתן לבצע ניסויים בהילוך מהיר על פי המודל הביולוגי והחלבון המעניין.במקרה זה, אנו יכולים לראות את כל המבנה של טבעת Z במוטציה FtsZ-GFP, במישור XY. בעזרת השיטה שלנו, היינו מסוגלים להקליט את הדינמיקה של הטבעות האלה בפרק זמן ארוך. לבסוף, עם השינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות, אנו מסיקים כי מבנה זה הוא דינמי מאוד במודל שלנו.שיטה זו היא פרוטוקול מהיר וזול לרישום דינמיקת החלבונים באתר החלוקה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המיושם על מורפולוגיות מורכבות כציאנובקטריה נימה, תוך שימוש באנבאנה כמודל.

vertical-immobilization-method-for-time-lapse-microscopy-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקה מהירה להדמיה של גידול בתאי שמרים משותקת, מיושם כאן לכתבים פלורסנט בבית לוקוסים שקט ההזדווגות HML ו...

טכניקה מהירה עבור ויזואליזציה של תאים חיים שמרים ללא יכולת לזוז

הקלטה התנהגות תאיים ב Myxococcus xanthus Biofilms באמצעות זמן לשגות Microcinematography

פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לפקח על התנהגות תא בודד של חיידקים שונים בתוך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות זמן לשגות. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כיצד לנתח את תמונות מיקרוסקופ.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

מקור: Weber, N. et al., טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור בהקפאה של הלקונה החוטית Cyanobacterium Phormidium. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים מבחן מבוסס LED ממוקד לחקר פוטוטקסיס בציאנובקטריה חוטית. החיידקים נודדים לעבר מקור האור, ויוצרים הצטברות צפופה במרכז המואר, אשר מומחשת ומכומתת באמצעות ניתוח עוצמת פיקסלים של התמונה שצולמה.

בדיקת פוטוטקסיס של ציאנובקטריה חוטית באמצעות תאורת אור ממוקדת

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לגדול ואיכותי לנתח biofilms חיידקים על עובש פטרייתי על ידי מיקרוסקופ confocal אלקטרונים.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

שמרי הביקוע, שמר החלוקה היא מערכת מודל מצוינת ללמוד cytokinesis, השלב הסופי חלוקת תא. כאן אנו מתארים גישה מיקרוסקופ לנתח אירועים cytokinetic שונים בתאי שמרים ביקוע חי.

ניתוח Spatiotemporal של אירועים Cytokinetic שמרים ביקוע

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להמחיש דחיסת אן ארעי של כחוליות. טיפוח סינכרונית, פיקוח על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, הקפאה מהירה ו גבוה מתח הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה משמשים. פרוטוקול עבור מתודולוגיות אלה מוצג, יישומים עתידיים ופיתוחים הנדונים.

ויזואליזציה של דחיסת DNA ב כחוליות על ידי מתח גבוה הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה

תאים חיידקיים במרחב מאוד מאורגנים. כדי לבצע את הארגון הזה לאורך זמן בתאים Myxococcus xanthus גדל לאט, פותחה מלכודת קרינה פלואורסצנטית הדמיה לחיות תאים עם רזולוציה גבוהה ייתכן במשך מספר דורות. באמצעות שיטה זו, ייתכן הדינמיקה של חלבונים חשובים על כרומוזום סגרגציה ועל חלוקת התא יכול להיקבע.

קרינה פלואורסצנטית Live-תא הדמיה של שלמה וגטטיבי תא מחזור של חיידק חברתית גידול איטי Myxococcus xanthus

מוצג כאן פרוטוקול המתאר ניטור של מחזור החיים המלא של חיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצני זמן לשגות בשילוב עם כרית agarose ומנות הדמיה תא.

הדמיה חיה של מחזור החיים של החיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצני זמן לשגות

פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד מסלעים ימיים. מאמר זה מתאר את הבידוד של חוטים ממקורות טבעיים, מיצוי DNA, ריצוף גנום, טרנספורמציה טבעית, ביטוי של sfGFP, קריוקונסרבציה ושיטות תנועתיות.

טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה

כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיה של הדינמיקה התלת-ממדית של דופן התא ברקמת טחב חי, המאפשר הדמיה של ניתוק דפנות התא במוטנטים מסוג ggb ועיבוי דפוסי דופן התא בסוג הבר במהלך ההתפתחות לאורך תקופה ארוכה.

הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens

למדו שיטת אימוביליזציה אנכית לניתוח מיקרוסקופיה בכחוליות נימה Anabaena. השיטה מאפשרת צפייה בדינמיקת חלבון FtsZ ובמבנה ה-Z-ring בתלת-ממד, ומספקת כלי יעיל לחקר חלוקת תאים באורגניזמים רב-תאיים.

שיטת אימוביליזציה אנכית לניתוח מיקרוסקופ בהילוך מהיר בכחוליות נימה

גלה סרטונים נוספים