ניתוח הביטוי והרכבת הקומפלקסים של חלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית בשמרי הביקוע Schizosaccharomyces pombe
May 2nd, 2025
שמרי הביקוע Schizosaccharomyces pombe מתגלים כמודל אטרקטיבי לחקר מיטוכונדריה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח השפע וההרכבה של קומפלקסי הנשימה המיטוכונדריאלים ב-S. pombe. זה מאפשר לאפיין את הפונקציות החדשות של גנים שמורים בשרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית.
תחום המחקר שלנו הוא תרגום חלבונים מיטוכונדריאליים, ואנו מנסים להבהיר את המנגנונים המשפיעים על התרגום וההרכבה של קומפלקס שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית. המחקר שלנו מצא כי shy1 ממלא תפקיד בקיימות התפקוד הרגיל של המיטוכונדריה על ידי השתתפות בהרכבה של עירויים קומפלקס ארבע. המעבדה שלנו תחקור את המנגנון של עירוי M=מטוטרקסט.
[קריין] כדי להתחיל, מדוד את המשקל הרטוב של כדור תא של Schizosaccharomyces pombe. השעו מחדש את התאים בשמונה מיליליטר של מאגר S. הוסף דיתיותרייטול לריכוז סופי של 10 מילימולר, ופניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד למילימולר אחד, וודא ששני הריאגנטים מוכנים טריים. הוסף אנזימים ליטיים לתרחיף התאים כדי לעכל את דופן התא של Schizosaccharomyces pombe. סובב את הצינור על שייקר ב-30 מעלות צלזיוס למשך הזמן המומלץ לאנזים הליטי הספציפי. השתמש במיקרוסקופ כדי לצפות בהיווצרות ספרופלסטים. לאחר מכן צנטריפוגה של הדגימה למשך 10 דקות ב-1,000 גרם, ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את הספרופלסטים. השעו מחדש את הגלולה בשמונה מיליליטר של מאגר S קר כקרח. לאחר שתי כביסות, השעו מחדש את הספרופלסטים בשמונה מיליליטר של מאגר הומוגניזציה קר כקרח המכיל מעכבי פרוטאז. מעבירים את התערובת להומוגניזטור מזכוכית מצונן מראש המכיל עלי, ומבחנה. הומוגניזציה של התאים באופן מכני על ידי ביצוע כ -15 משיכות למעלה ולמטה עם העלי המתאים היטב. לאחר מכן בדוק את הספרופלסטים תחת מיקרוסקופ כדי לבדוק אם יש שבירת קרום. כעת העבירו את המתלה ההומוגני לצינורות צנטריפוגה. צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1,000 גרם ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול תאים ופסולת בלתי שבורים. צנטריפוגה את הסופרנטנט שנוצר למשך חמש דקות ב-3,000 G ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את הגרעין. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינורות צנטריפוגה טריים. צנטריפוגה ב-12,000 גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את המיטוכונדריה ואברונים אחרים, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מאגר מגבי סורביטול EDTA קר כקרח לאחר סילוק הסופרנטנט. ואז שוב צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-12,000 גרם ב-4 מעלות צלזיוס כדי לשטוף את המיטוכונדריה. השעו מחדש את הגלולה הסופית במיליליטר אחד של מאגר מגבים סורביטול EDTA קר כקרח. לאחר מכן מכניסים את המיטוכונדריה המטוהרת לצינורות אחסון לניסויים עתידיים. ב-SDS מאגר טעינת עמודים ל-40 מיקרוליטר של חלבון כולל מיטוכונדריאלי. דנטורציה של החלבונים על ידי דגירה של התערובת למשך הזמן המצוין בטמפרטורה המתאימה. טען כ-20 מיקרוגרם או ארבעה מיקרוליטרים של חלבונים מיטוכונדריאלים לתוך ג'ל דף SDS של 12% לפני ספיגה חיסונית. כדי להכין את הדגימה לדף BN, מיטוכונדריה גלולה ראשונה מאליקוטים קודמים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את המיטוכונדריה ב-200 מיקרוליטר של שלושה מאגרי ג'ל של עמודי XBN. לאחר מכן, פיפטה שני מיקרוליטר של 100 X פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד ומיקרוליטר אחד של מגנזיום כלוריד טוחנת אחת. שוב צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-12,000 גרם ב-4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את כדור המיטוכונדריה ב-160 מיקרוליטר של 5% משקל לפי נפח digitorum. יש לדגור על קרח למשך 30 דקות, ולערבב בעדינות כל 10 דקות. צנטריפוגה את המתלים למשך חמש דקות ב -20,000 גרם ב -4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי. הוסף 80 מיקרוליטר של שלושה מאגר דגימת דפי XBN לדגימה המטופלת ב-digitorum. או 32 מיקרוליטר לדגימה שטופלה ב-DDM. כעת הרכיבו את הג'לים המקוריים של Bis-Tris עם שיפוע של 3 עד 12%. טען את דגימות החלבון המטופלות יחד עם סמני חלבון בעלי משקל מולקולרי גבוה לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד מקומי. הפעל את הג'ל במתח קבוע של 80 וולט, וזרם של שישה מיליאמפר למשך 30 דקות באמצעות מאגר קתודה המכיל 0.02% Kumasi G250. החלף את המאגר במאגר קתודה ללא קומאסי, והמשיך לפעול ב-10 מיליאמפר למשך שלוש שעות עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל. חותכים את נתיב הג'ל המכיל את סמן החלבון. מכתים את הסמן במאגר Kumasi R250 למשך 15 דקות. לאחר מכן הסר את הכתמים עד שהרצועות נראות לעין. טבלו את החלק הנותר של הג'ל במאגר העברת דפי BN למשך 30 דקות לשיווי משקל. שוטפים 0.45 מיקרומטר קרום כתם PVDF עם מתנול, ומאזן במאגר ההעברה למשך 10 דקות. העבירו חלבונים מהג'ל אל קרום ה- PVDF באמצעות זרם קבוע של 300 מיליאמפר למשך שעתיים. שטפו את קרום ה-PVDF עם מתנול כדי להסיר צבע קומאסי. לאחר מכן דגרו את הממברנה במאגר חוסם TBS המכיל 5% חלב דל שומן למשך שעה אחת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. לדגור את קרום ה-PVDF עם הנוגדנים הראשוניים שצוינו כנגד קומפלקסים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית של Schizosaccharomyces pombe. לאחר דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס, שטפו את הממברנה באמצעות מאגר TBST. לאחר מכן דגרו את הממברנה בנוגדנים המשניים בדילול של 1 עד 10,000 למשך שעה ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת הממברנה עם מאגר TBST, חשוף וסרוק את קרום ה-PVDF כדי לדמיין תוצאות של כתמים חיסוניים. מחיקת הגן shy1, הובילה לירידה ניכרת ברמות המצב היציב של חלבוני שרשרת הנשימה המקודדים ב-DNA המיטוכונדריאלי Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 ו-Atp6. ניתוח עמוד מקורי כחול הראה כי השפע של קומפלקסי העל של שרשרת הנשימה המסיסים DG 3242 ו-324 הופחת בתאי דלתא ביישן1. בעוד שהרמות של קומפלקסי העל 32.=, ו-55N נותרו ללא השפעה. רמת הקומפלקס הדיאמטרי המסיס DDM 3 לא השתנתה בזן Delta shy1.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בשמרי הביקוע Schizosaccharomyces pombe כאורגניזם מודל למחקר מיטוכונדרי. הוא מפרט פרוטוקול לניתוח מתחמי נשימה מיטוכונדריים, ומדגיש את תפקיד הגן shy1 בתפקוד המיטוכונדריה.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביולוגיה תאית
- מחקר מיטוכונדרי
רקע
- Schizosaccharomyces pombe הוא מודל חשוב לחקר המיטוכונדריה.
- מתחמי נשימה מיטוכונדריים חיוניים לייצור אנרגיה תאית.
- הבנת פונקציות הגנים בהרכבת המיטוכונדריה יכולה לחשוף תובנות על תהליכים מטבוליים.
- הגן shy1 מעורב בהרכבת מתחמי שרשרות הנשימה.
מטרת המחקר
- לנתח את השפע וההרכבה של מתחמי הנשימה המיטוכונדריים ב-S. pombe.
- לחקור את תפקיד הגן shy1 בתפקוד המיטוכונדריה.
- לפתח פרוטוקול לחקר תרגום חלבון מיטוכונדרי.
שיטות ששימשו
- הכנת כדורית תאים ויצירת ספרולסטים.
- צנטריפוגציה לבידוד מיטוכונדריה ואברונים אחרים.
- דנטורציה של חלבונים וטעינתם ל-SDS-PAGE ו-BN-PAGE.
- אימונובלוטינג לניתוח חלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדרית.
תוצאות עיקריות
- מחיקה של הגן shy1 הפחיתה את רמות חלבוני שרשרת הנשימה המקודדים ב-DNA המיטוכונדרי.
- ניתוח Blue native PAGE הראה ירידה בשפע של מתחמים על-סופרים ספציפיים של שרשרת הנשימה בתאים Delta shy1.
- רמות מתחם 3 נותרו ללא שינוי בזן Delta shy1.
- המחקר מספק תובנות לגבי מנגנוני הרכבת החלבונים המיטוכונדריים.
מסקנות
- Shy1 חיוני לשמירה על תפקוד שרשרת הנשימה המיטוכונדרית.
- הפרוטוקול שפותח יכול לשמש למחקרים נוספים על דינמיקה מיטוכונדרית.
- הבנת הרכבת המיטוכונדריה יכולה להיות בעלת השלכות למחקר מטבולי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of mitochondrial respiratory chain protein expression and complex assembly in Schizosaccharomyces pombe enables mechanistic de-risking of mitochondrial function hypotheses in early discovery. This workflow supports target validation and pathway interrogation for mitochondrial biology, informing risk-adjusted portfolio decisions in metabolic and energy-related disease research. The approach provides a reproducible platform for dissecting gene-specific roles in respiratory chain assembly, enhancing predictive confidence in target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function in mitochondrial respiratory chain assembly and maintenance.
- Supports biological de-risking by clarifying the impact of genetic perturbations on protein complex formation.
- Facilitates predictive confidence in target validation for mitochondrial pathways.
Screening & Assay Development
- Prepares validated mitochondrial protein complexes for downstream biochemical and genetic assays.
- Standardizes quantitative immunoblotting outputs for reproducibility across experiments.
- Enables reliable assessment of protein abundance and complex integrity for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial protein complex analysis with disease-relevant model systems.
- Supports continuity from genetic discovery to preclinical validation of mitochondrial targets.
- Provides mechanistic insights that inform translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early genetic hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation, specifically for mitochondrial targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gene-specific roles in respiratory chain assembly and function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of protein expression and complex formation for assay development.
- Analytics: Provides immunoblot-based measurements to compare wild-type and mutant conditions quantitatively.
- Translational Research: Bridges genetic findings in yeast to disease-relevant mitochondrial dysfunction models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to diverse mitochondrial gene targets and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible protein complex analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in mitochondrial target portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation, electrophoresis, and immunoblotting techniques.
- Demands access to centrifugation, PAGE, and immunodetection instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and antibody validation.
- Adaptable to other yeast or eukaryotic model systems with protocol optimization.
- Dependent on antibody specificity and quantitative detection limits for target proteins.
