ניתוח הביטוי והרכבת הקומפלקסים של חלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית בשמרי הביקוע Schizosaccharomyces pombe

תחום המחקר שלנו הוא תרגום חלבונים מיטוכונדריאליים, ואנו מנסים להבהיר את המנגנונים המשפיעים על התרגום וההרכבה של קומפלקס שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית. המחקר שלנו מצא כי shy1 ממלא תפקיד בקיימות התפקוד הרגיל של המיטוכונדריה על ידי השתתפות בהרכבה של עירויים קומפלקס ארבע. המעבדה שלנו תחקור את המנגנון של עירוי M=מטוטרקסט.

[קריין] כדי להתחיל, מדוד את המשקל הרטוב של כדור תא של Schizosaccharomyces pombe. השעו מחדש את התאים בשמונה מיליליטר של מאגר S. הוסף דיתיותרייטול לריכוז סופי של 10 מילימולר, ופניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד למילימולר אחד, וודא ששני הריאגנטים מוכנים טריים. הוסף אנזימים ליטיים לתרחיף התאים כדי לעכל את דופן התא של Schizosaccharomyces pombe. סובב את הצינור על שייקר ב-30 מעלות צלזיוס למשך הזמן המומלץ לאנזים הליטי הספציפי. השתמש במיקרוסקופ כדי לצפות בהיווצרות ספרופלסטים. לאחר מכן צנטריפוגה של הדגימה למשך 10 דקות ב-1,000 גרם, ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את הספרופלסטים. השעו מחדש את הגלולה בשמונה מיליליטר של מאגר S קר כקרח. לאחר שתי כביסות, השעו מחדש את הספרופלסטים בשמונה מיליליטר של מאגר הומוגניזציה קר כקרח המכיל מעכבי פרוטאז. מעבירים את התערובת להומוגניזטור מזכוכית מצונן מראש המכיל עלי, ומבחנה. הומוגניזציה של התאים באופן מכני על ידי ביצוע כ -15 משיכות למעלה ולמטה עם העלי המתאים היטב. לאחר מכן בדוק את הספרופלסטים תחת מיקרוסקופ כדי לבדוק אם יש שבירת קרום. כעת העבירו את המתלה ההומוגני לצינורות צנטריפוגה. צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1,000 גרם ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול תאים ופסולת בלתי שבורים. צנטריפוגה את הסופרנטנט שנוצר למשך חמש דקות ב-3,000 G ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את הגרעין. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינורות צנטריפוגה טריים. צנטריפוגה ב-12,000 גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את המיטוכונדריה ואברונים אחרים, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מאגר מגבי סורביטול EDTA קר כקרח לאחר סילוק הסופרנטנט. ואז שוב צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-12,000 גרם ב-4 מעלות צלזיוס כדי לשטוף את המיטוכונדריה. השעו מחדש את הגלולה הסופית במיליליטר אחד של מאגר מגבים סורביטול EDTA קר כקרח. לאחר מכן מכניסים את המיטוכונדריה המטוהרת לצינורות אחסון לניסויים עתידיים. ב-SDS מאגר טעינת עמודים ל-40 מיקרוליטר של חלבון כולל מיטוכונדריאלי. דנטורציה של החלבונים על ידי דגירה של התערובת למשך הזמן המצוין בטמפרטורה המתאימה. טען כ-20 מיקרוגרם או ארבעה מיקרוליטרים של חלבונים מיטוכונדריאלים לתוך ג'ל דף SDS של 12% לפני ספיגה חיסונית. כדי להכין את הדגימה לדף BN, מיטוכונדריה גלולה ראשונה מאליקוטים קודמים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את המיטוכונדריה ב-200 מיקרוליטר של שלושה מאגרי ג'ל של עמודי XBN. לאחר מכן, פיפטה שני מיקרוליטר של 100 X פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד ומיקרוליטר אחד של מגנזיום כלוריד טוחנת אחת. שוב צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-12,000 גרם ב-4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את כדור המיטוכונדריה ב-160 מיקרוליטר של 5% משקל לפי נפח digitorum. יש לדגור על קרח למשך 30 דקות, ולערבב בעדינות כל 10 דקות. צנטריפוגה את המתלים למשך חמש דקות ב -20,000 גרם ב -4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי. הוסף 80 מיקרוליטר של שלושה מאגר דגימת דפי XBN לדגימה המטופלת ב-digitorum. או 32 מיקרוליטר לדגימה שטופלה ב-DDM. כעת הרכיבו את הג'לים המקוריים של Bis-Tris עם שיפוע של 3 עד 12%. טען את דגימות החלבון המטופלות יחד עם סמני חלבון בעלי משקל מולקולרי גבוה לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד מקומי. הפעל את הג'ל במתח קבוע של 80 וולט, וזרם של שישה מיליאמפר למשך 30 דקות באמצעות מאגר קתודה המכיל 0.02% Kumasi G250. החלף את המאגר במאגר קתודה ללא קומאסי, והמשיך לפעול ב-10 מיליאמפר למשך שלוש שעות עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל. חותכים את נתיב הג'ל המכיל את סמן החלבון. מכתים את הסמן במאגר Kumasi R250 למשך 15 דקות. לאחר מכן הסר את הכתמים עד שהרצועות נראות לעין. טבלו את החלק הנותר של הג'ל במאגר העברת דפי BN למשך 30 דקות לשיווי משקל. שוטפים 0.45 מיקרומטר קרום כתם PVDF עם מתנול, ומאזן במאגר ההעברה למשך 10 דקות. העבירו חלבונים מהג'ל אל קרום ה- PVDF באמצעות זרם קבוע של 300 מיליאמפר למשך שעתיים. שטפו את קרום ה-PVDF עם מתנול כדי להסיר צבע קומאסי. לאחר מכן דגרו את הממברנה במאגר חוסם TBS המכיל 5% חלב דל שומן למשך שעה אחת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. לדגור את קרום ה-PVDF עם הנוגדנים הראשוניים שצוינו כנגד קומפלקסים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית של Schizosaccharomyces pombe. לאחר דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס, שטפו את הממברנה באמצעות מאגר TBST. לאחר מכן דגרו את הממברנה בנוגדנים המשניים בדילול של 1 עד 10,000 למשך שעה ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת הממברנה עם מאגר TBST, חשוף וסרוק את קרום ה-PVDF כדי לדמיין תוצאות של כתמים חיסוניים. מחיקת הגן shy1, הובילה לירידה ניכרת ברמות המצב היציב של חלבוני שרשרת הנשימה המקודדים ב-DNA המיטוכונדריאלי Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 ו-Atp6. ניתוח עמוד מקורי כחול הראה כי השפע של קומפלקסי העל של שרשרת הנשימה המסיסים DG 3242 ו-324 הופחת בתאי דלתא ביישן1. בעוד שהרמות של קומפלקסי העל 32.=, ו-55N נותרו ללא השפעה. רמת הקומפלקס הדיאמטרי המסיס DDM 3 לא השתנתה בזן Delta shy1.