קביעה מבנית ברזולוציה תת-ננומטרית של המגלוטינין מטומוגרפיה קריו-אלקטרונית של נגיפי שפעת

המעבדה שלנו משתמשת בביולוגיה מבנית כדי לחקור וירוסים ולהתפתחות עמידות לתרופות. בעבודה הנוכחית, אנו מאפיינים כיצד המגלוטינין של שפעת משנה את מבנה גופו בעת קישור הקולטנים. השתמשנו בטומוגרפיה אלקטרונית קריו-אלקטרונית כדי להמחיש את ארגון ומבנה המורפולוגיה הוויראלית.

באופן ספציפי, השתמשנו בשיטה זו של מיקרוסקופ אלקטרוני-קריו-כדי להדמית שפעת הווירוס הפליאומורפית. הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לחקור את הארגון והמבנה של המגלוטינין שפעת במקום על וירוסים שלמים ברזולוציה תת-ננומטרית. הרזולוציה הגבוהה הזו מאפשרת לנו להמחיש אינטראקציות שהיו בעבר נסתרות.

כדי להתחיל, השיק טרמינל לינוקס להפעלת סביבת Conda. השתמש בטרמינל כדי להפעיל את סביבת קונדה עם ISO net מותקן. צור תיקיית משנה בשם תיקיית טומו, ואז העבר את כל קבצי הטומוגרמה לתיקייה הזו.

לאחר מכן, השתמש בקוד כדי ליצור קובץ כוכב בתיקיית הפרויקט. באמצעות עורך טקסט, פתחו את קובץ הכוכב שנוצר והזינו את ערך הדפוקוס המשוער עבור תמונות הנטייה האפס לעמודה הרביעית. עכשיו הרץ את פקודת הקונבולוציה CTFD בטרמינל.

לאחר דה-קונבול, הפעל את סביבת הממשק הגרפי EMAN2 כדי להתחיל בעיבוד מוקדם לאיסוף חלקיקים. תחת טומוגרפיה, לחץ שמאלי על החץ ליד הנתונים הגולמיים, בחר ייבוא טומוגרמות מתפריט הנפתח ובחר את הקבצים. לאחר מכן, לחצו שמאלי על החץ ליד הסגמנטציה ובחרו טומוגרמות מעובדות מראש.

השתמש בפרמטרים מתאימים לברירת מחדל. לאחר העיבוד המוקדם, תיווצר אוטומטית תיקיית מידע עם קבצי JSON ריקים התואמים לשמות הבסיס של קבצי טומוגרפיית התהליך. הוסיפו מידע פיקסלי אנגסטרום לקבצים לפני שאתם ממשיכים.

כדי לאמן רשת עצבית קונבולוציונית, או CNN לזהות את גליקופרוטאין ה-HA, יש לשנות את תיקיית העבודה למיקום הטומוגרמות שישמשו. לאחר מכן פתחו את ממשק האימון של CNN באמצעות הטרמינל. ודא שארבעה חלונות פתוחים.

אחד מהם מכיל את המידע על פרמטרי CNN וטומוגרמות בתיקייה, ושלושת החלונות האחרים מכילים תמונות של הפניות טובות, הפניות רעות וחלקיקים שנבחרו על ידי ה-CNN. בממשק המשתמש של CNN, לחץ על האפשרות החדשה כדי לאתחל CNN עם קצב למידה ברירת מחדל של 0.0001 וגודל קופסה של שמונה. בעמודת שם הקובץ, לחצו שמאלי על טומוגרפיה מייצגת כדי לפתוח אותה.

העבר את הסמן מעל הטומוגרמה הפתוחה ולחץ על גלגל הגלילה של העכבר כדי לפתוח חלון חדש. לחץ שמאלי על מחוון המספר N כדי לעבור את ציר ה-Z. לאחר מכן, בטומוגרמה הפתוחה, השתמשו בפאנל ההפניות הטובות כדי לבחור 10 עד 20 תכונות המתאימות ל-HA. תמונות חיוביות מופיעות בחלון החיובי.

כדי להסיר אחד, החזק את shift ולחץ שמאלי. כעת עבור לפאנל ההפניות הגרועות ובחר בין 10 ל-20 הפניות המתאימות לתכונות כמו טלאי ממברנה ריק, צפיפות RNP, סמנים פידוציאליים ופסולת. הגדר את מספר האיטרציות ל-50 ולחץ על סמל הרכבת כדי להתחיל את ההכשרה ב-CNN.

לאחר סיום ההכשרה, לחץ על הגשה. חלקיקים נבחרים יוצגו בטומוגרמה כעיגולים כחולים או ייראו בחלון החלקיקים. המשך לשפר על ידי בחירת הפניות חיוביות ושליליות נוספות, תוך לחיצה מעת לעת על שמירה כדי לשמור על ההתקדמות.

כאשר ה-CNN פועל כראוי, לחץ על יישום הכל כדי להריץ בחירת חלקיקים. לאחר מכן העריך את התוצאות בכמה טומוגרפיות ואמן מחדש לפי הצורך. כדי לשמור קואורדינטות לכל טומוגרמה, פתח מחדש את ממשק המשתמש EMAN2 באמצעות הפקודה e2projectmanager.py.

לחץ על החץ תחת ממוצע תת-טומוגרפיה ובחר איגרוף ידני. עכשיו, הזן את שם הטומוגרמה ולחץ על השקה. לאחר מכן, לחץ ברצף על הקובץ, שמור את כבל הקופסה ו-tomogram_ha.

שלח הודעות כדי לשמור על הקואורדינטות. עבור לתיקיית ה-neural net sub ולתיקיות info sub כדי לגבות ולשמור ברשת. HDF, אימונים.

HDF, מבודדים. hdf, ו-boxes3Dref.hdf. לאמן CNN שני לזהות את שכבת החלבון M1 ואת נוכחות ה-VRNP על ידי שינוי גודל קופסת האימון משמונה ל-14.

כדי לאצור חלקיקים, קודם כל הורידו מחברות מהמאגר של GitHub. לאחר מכן פתח את ה-CNN של חלקיקי ה-CNN ומנקה את מחברת ה-IPYNB, וטען את המודולים הנדרשים. טען את קבצי הטקסט של HA ו-M1 למחברת.

תסתכל עליהם כענני תלת-ממד באמצעות ספריית תלת-ממד פתוחה. לאחר מכן, סנן חריגים בקואורדינטות HA באמצעות שיטת הסרת חריגים סטטיסטיים תלת-ממדיים פתוחים. לאחר מכן, חשב את המרחקים בין ענני HA ל-M1 על ידי זיהוי נקודות HA מעל 20 פיקסלים מ-M1 כחריגים ושמור את הקואורדינטות הנותרות לקובץ טקסט פלט.

לאחד את כל החלקיקים ולשמור כקבצי כוכבים באמצעות קובץ כוכבים pts2. IPYNB. באמצעות WarpTools, חלצו חלקיקים שמכופפים את גורם ארבע ומבצעים ממוצע תת-טומוגרפי התחלתי ב-RELION מינוס ארבע באמצעות הקוד. המור את קובץ warp star לפורמט RELION 4.

לאחר מכן יוצרים הפניה ראשונית באמצעות RELION refine MPI על תת-קבוצה של חלקיקים. בצע חיזוק אוטומטי תלת-ממדי על תת-טומוגרמות עם RELION refine MPI. בהתכנסות, חזור על שיפור אוטומטי עם סטיית תרגום טיטאן ל-8 וצעד לשתיים.

נצל סיווג דו-ממדי כדי להשליך חלקיקי זבל באמצעות RELION Refine. צור קבצי כוכבים עם מחלקות טובות באמצעות הקוד, ואז שלב את קבצי הכוכבים הבודדים. טומוגרפיות מייצגות חשפו ויריונים פליאומורפיים בצורות שנעו בין כדוריות לצורות מוארכות.

הממוצע הסופי של תת-טומוגרמה הגיע לרזולוציה גלובלית של 6.0 אנגסטרומים עם רזולוציה מקומית שנעה בין חמישה לשבעה אנגסטרומים. הליסים האלפא וגיליות הבטא נפתרו בשחזור הסופי של ה-HA, ותמכו באיכות המבנית של המפה המשופרת. אתרי גליקוזילציה זוהו בארבעה מיקומים על ראש וגבעול ה-HA, מה שאישר את נראות צפיפות הגליקן בשחזור הסופי.