קביעה מבנית ברזולוציה תת-ננומטרית של המגלוטינין מטומוגרפיה קריו-אלקטרונית של נגיפי שפעת
7 בנובמבר 2025
מאמר זה מציג פרוטוקול לעיבוד נתונים של נגיפי שפעת שצולמו באמצעות טומוגרפיה קריו-אלקטרונית וממוצע תת-טומוגרפיה לאחר מכן של גליקופרוטאין המגלוטינין. פרוטוקול זה מכסה עיבוד נתונים שלב אחר שלב, החל מעיבוד מקדים של תמונה ועד לליטוש המודל הסופי.
המעבדה שלנו משתמשת בביולוגיה מבנית כדי לחקור וירוסים ולהתפתחות עמידות לתרופות. בעבודה הנוכחית, אנו מאפיינים כיצד המגלוטינין של שפעת משנה את מבנה גופו בעת קישור הקולטנים. השתמשנו בטומוגרפיה אלקטרונית קריו-אלקטרונית כדי להמחיש את ארגון ומבנה המורפולוגיה הוויראלית.
באופן ספציפי, השתמשנו בשיטה זו של מיקרוסקופ אלקטרוני-קריו-כדי להדמית שפעת הווירוס הפליאומורפית. הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לחקור את הארגון והמבנה של המגלוטינין שפעת במקום על וירוסים שלמים ברזולוציה תת-ננומטרית. הרזולוציה הגבוהה הזו מאפשרת לנו להמחיש אינטראקציות שהיו בעבר נסתרות.
כדי להתחיל, השיק טרמינל לינוקס להפעלת סביבת Conda. השתמש בטרמינל כדי להפעיל את סביבת קונדה עם ISO net מותקן. צור תיקיית משנה בשם תיקיית טומו, ואז העבר את כל קבצי הטומוגרמה לתיקייה הזו.
לאחר מכן, השתמש בקוד כדי ליצור קובץ כוכב בתיקיית הפרויקט. באמצעות עורך טקסט, פתחו את קובץ הכוכב שנוצר והזינו את ערך הדפוקוס המשוער עבור תמונות הנטייה האפס לעמודה הרביעית. עכשיו הרץ את פקודת הקונבולוציה CTFD בטרמינל.
לאחר דה-קונבול, הפעל את סביבת הממשק הגרפי EMAN2 כדי להתחיל בעיבוד מוקדם לאיסוף חלקיקים. תחת טומוגרפיה, לחץ שמאלי על החץ ליד הנתונים הגולמיים, בחר ייבוא טומוגרמות מתפריט הנפתח ובחר את הקבצים. לאחר מכן, לחצו שמאלי על החץ ליד הסגמנטציה ובחרו טומוגרמות מעובדות מראש.
השתמש בפרמטרים מתאימים לברירת מחדל. לאחר העיבוד המוקדם, תיווצר אוטומטית תיקיית מידע עם קבצי JSON ריקים התואמים לשמות הבסיס של קבצי טומוגרפיית התהליך. הוסיפו מידע פיקסלי אנגסטרום לקבצים לפני שאתם ממשיכים.
כדי לאמן רשת עצבית קונבולוציונית, או CNN לזהות את גליקופרוטאין ה-HA, יש לשנות את תיקיית העבודה למיקום הטומוגרמות שישמשו. לאחר מכן פתחו את ממשק האימון של CNN באמצעות הטרמינל. ודא שארבעה חלונות פתוחים.
אחד מהם מכיל את המידע על פרמטרי CNN וטומוגרמות בתיקייה, ושלושת החלונות האחרים מכילים תמונות של הפניות טובות, הפניות רעות וחלקיקים שנבחרו על ידי ה-CNN. בממשק המשתמש של CNN, לחץ על האפשרות החדשה כדי לאתחל CNN עם קצב למידה ברירת מחדל של 0.0001 וגודל קופסה של שמונה. בעמודת שם הקובץ, לחצו שמאלי על טומוגרפיה מייצגת כדי לפתוח אותה.
העבר את הסמן מעל הטומוגרמה הפתוחה ולחץ על גלגל הגלילה של העכבר כדי לפתוח חלון חדש. לחץ שמאלי על מחוון המספר N כדי לעבור את ציר ה-Z. לאחר מכן, בטומוגרמה הפתוחה, השתמשו בפאנל ההפניות הטובות כדי לבחור 10 עד 20 תכונות המתאימות ל-HA. תמונות חיוביות מופיעות בחלון החיובי.
כדי להסיר אחד, החזק את shift ולחץ שמאלי. כעת עבור לפאנל ההפניות הגרועות ובחר בין 10 ל-20 הפניות המתאימות לתכונות כמו טלאי ממברנה ריק, צפיפות RNP, סמנים פידוציאליים ופסולת. הגדר את מספר האיטרציות ל-50 ולחץ על סמל הרכבת כדי להתחיל את ההכשרה ב-CNN.
לאחר סיום ההכשרה, לחץ על הגשה. חלקיקים נבחרים יוצגו בטומוגרמה כעיגולים כחולים או ייראו בחלון החלקיקים. המשך לשפר על ידי בחירת הפניות חיוביות ושליליות נוספות, תוך לחיצה מעת לעת על שמירה כדי לשמור על ההתקדמות.
כאשר ה-CNN פועל כראוי, לחץ על יישום הכל כדי להריץ בחירת חלקיקים. לאחר מכן העריך את התוצאות בכמה טומוגרפיות ואמן מחדש לפי הצורך. כדי לשמור קואורדינטות לכל טומוגרמה, פתח מחדש את ממשק המשתמש EMAN2 באמצעות הפקודה e2projectmanager.py.
לחץ על החץ תחת ממוצע תת-טומוגרפיה ובחר איגרוף ידני. עכשיו, הזן את שם הטומוגרמה ולחץ על השקה. לאחר מכן, לחץ ברצף על הקובץ, שמור את כבל הקופסה ו-tomogram_ha.
שלח הודעות כדי לשמור על הקואורדינטות. עבור לתיקיית ה-neural net sub ולתיקיות info sub כדי לגבות ולשמור ברשת. HDF, אימונים.
HDF, מבודדים. hdf, ו-boxes3Dref.hdf. לאמן CNN שני לזהות את שכבת החלבון M1 ואת נוכחות ה-VRNP על ידי שינוי גודל קופסת האימון משמונה ל-14.
כדי לאצור חלקיקים, קודם כל הורידו מחברות מהמאגר של GitHub. לאחר מכן פתח את ה-CNN של חלקיקי ה-CNN ומנקה את מחברת ה-IPYNB, וטען את המודולים הנדרשים. טען את קבצי הטקסט של HA ו-M1 למחברת.
תסתכל עליהם כענני תלת-ממד באמצעות ספריית תלת-ממד פתוחה. לאחר מכן, סנן חריגים בקואורדינטות HA באמצעות שיטת הסרת חריגים סטטיסטיים תלת-ממדיים פתוחים. לאחר מכן, חשב את המרחקים בין ענני HA ל-M1 על ידי זיהוי נקודות HA מעל 20 פיקסלים מ-M1 כחריגים ושמור את הקואורדינטות הנותרות לקובץ טקסט פלט.
לאחד את כל החלקיקים ולשמור כקבצי כוכבים באמצעות קובץ כוכבים pts2. IPYNB. באמצעות WarpTools, חלצו חלקיקים שמכופפים את גורם ארבע ומבצעים ממוצע תת-טומוגרפי התחלתי ב-RELION מינוס ארבע באמצעות הקוד. המור את קובץ warp star לפורמט RELION 4.
לאחר מכן יוצרים הפניה ראשונית באמצעות RELION refine MPI על תת-קבוצה של חלקיקים. בצע חיזוק אוטומטי תלת-ממדי על תת-טומוגרמות עם RELION refine MPI. בהתכנסות, חזור על שיפור אוטומטי עם סטיית תרגום טיטאן ל-8 וצעד לשתיים.
נצל סיווג דו-ממדי כדי להשליך חלקיקי זבל באמצעות RELION Refine. צור קבצי כוכבים עם מחלקות טובות באמצעות הקוד, ואז שלב את קבצי הכוכבים הבודדים. טומוגרפיות מייצגות חשפו ויריונים פליאומורפיים בצורות שנעו בין כדוריות לצורות מוארכות.
הממוצע הסופי של תת-טומוגרמה הגיע לרזולוציה גלובלית של 6.0 אנגסטרומים עם רזולוציה מקומית שנעה בין חמישה לשבעה אנגסטרומים. הליסים האלפא וגיליות הבטא נפתרו בשחזור הסופי של ה-HA, ותמכו באיכות המבנית של המפה המשופרת. אתרי גליקוזילציה זוהו בארבעה מיקומים על ראש וגבעול ה-HA, מה שאישר את נראות צפיפות הגליקן בשחזור הסופי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול לחקר הקונפורמציה של המגלגלין של שפעת לאחר קישור לקולטן באמצעות טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים. הפרוטוקול מאפשר הדמיה של המורפולוגיה והמבנה הנגיפי ברזולוציה של תת-ננומטר.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה מבנית
- וירולוגיה
- טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים
רקע
- נגיפי השפעת מציגים מורפולוגיה פלאומופית.
- המגלגלין הוא גליקופרוטאין מרכזי המעורב בקישור לקולטן.
- הבנת השינויים הקונפורמציוניים יכולה לתרום לחקר עמידות לתרופות.
- טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים מספקת יכולות הדמיה ברזולוציה גבוהה.
מטרת המחקר
- לאפיין את השינויים הקונפורמציוניים של המגלגלין לאחר קישור לקולטן.
- להדמיה את הארגון והמבנה של נגיפי השפעת.
- לשפר את ההבנה של האינטראקציות הנגיפיות ברמה המולקולרית.
שיטות בשימוש
- טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים להדמיית מבנים נגיפיים.
- ממוצע תת-טומוגרפי להעמקת המודל.
- טכניקות עיבוד תמונה לשיפור הנתונים.
- הדמיה של המגלגלין in situ על נגיפים שלמים.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של המגלגלין של שפעת ברזולוציה של תת-ננומטר.
- זיהוי אינטראקציות שנחשפו בעבר במהלך קישור לקולטן.
- תובנות מבניות מפורטות לארגון הנגיף.
- פרוטוקול שהוקם למחקרים עתידיים על גליקופרוטאינים נגיפיים.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של המגלגלין של שפעת.
- הממצאים תורמים להבנת המבנה והתפקוד הנגיפיים.
- גישה זו יכולה להיות מיושמת במחקרים נגיפיים אחרים בביולוגיה מבנית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Subnanometer-resolution cryo-electron tomography of influenza hemagglutinin (HA) enables direct structural interrogation of viral glycoproteins in their native context, addressing a critical challenge in target validation for antiviral discovery. This workflow enhances predictive confidence in structure-based drug design and supports mechanistic de-risking at the earliest stages of antiviral portfolio development. The robust pipeline for HA visualization on intact virions positions structural biology as a foundational capability for translational virology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of HA conformation and organization on pleomorphic influenza virions.
- Supports functional target validation by resolving glycosylation sites and protein-protein interactions at subnanometer scale.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing structural features relevant to receptor binding and membrane fusion.
- Improves predictive confidence for downstream inhibitor or vaccine design targeting HA.
Screening & Assay Development
- Provides validated structural templates for in silico screening and rational design workflows.
- Standardizes particle picking and subtomogram averaging for reproducible structural outputs.
- Enables quantitative assessment of glycoprotein density and distribution on virion surfaces.
- Supports assay development by confirming the presence and accessibility of key epitopes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural findings with disease-relevant viral strains and glycoprotein variants.
- Enables continuity from molecular discovery to preclinical validation of HA-targeted interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates by providing high-resolution structural benchmarks.
Pipeline & Workflow Integration
This cryoET pipeline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research for antiviral programs.
- Discovery Biology: Delivers high-resolution structural data to test mechanistic hypotheses about HA function and viral entry.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative structural outputs for computational and experimental screening platforms.
- Analytics: Provides robust measurements of glycosylation, secondary structure, and protein organization for comparative analyses.
- Translational Research: Bridges molecular findings to preclinical models by characterizing clinically relevant viral strains.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, modular workflow for structural analysis of diverse viral glycoproteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in target structure and function.
- Operational Value: Standardizes data processing and analysis for reproducible, scalable outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes candidates with validated structural engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and triage of antiviral assets based on structural benchmarks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-electron tomography, image processing, and neural network-based particle picking.
- Demands access to high-performance computing infrastructure and specialized software (e.g., EMAN2, RELION).
- Necessitates cross-team standardization of data formats, annotation, and quality control.
- Adaptation to other viral systems may require retraining of neural networks and protocol optimization.
- Resolution and throughput are limited by sample heterogeneity and data acquisition constraints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:42
Preprocessing CryoElectron Tomograms and Convolutional Neural NetworkBased Particle Picking for HA Glycoprotein and M1 Protein Identification
5:32
Particle Curation and Subtomogram Averaging Workflow Using RELION and WarpTools
7:30
Results
